内皮细胞在血液循环系统中的影响和作用

研究生课程论文

课程名称动物生理生态学

开课时间 2013学年第一学期

学院化学与生命科学学院

学科专业动物学

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学位类别全日制硕士

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交稿日期 2013.12 23 成绩

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内皮细胞在血液循环系统中的影响和作用摘要：内皮细胞是血液包裹的最里面的，也是直接接触的一层内皮细胞，对血管和机体有保护作用，通过尿酸、染木素、晚期糖基化的三种物质对内皮细胞的凋亡、功能性的研究，对内皮细胞的合成和释放的细胞因子之间的平衡的紊乱，本综述是总结三个实验性文章对于后来糖尿病、心血管通透性增加还有血管舒张及各种炎症，和心血管增生疾病，有一个铺垫性开创。

关键词：内皮细胞，尿酸，染木素，晚期糖基化，凋亡。

The impact and role of endothelial cells in

the circulatory system

Abstract: endothelial cells is the most inside blood package. a layer of endothelial cells are in direct contact. and has a protective effect on blood vessels and the body. the functionality of the three substances through the uric acid. dye lignin, advanced glycation apoptosis. on endothelial cells. balance disorder between cytokine synthesis and release of endothelial cells of this review is a summary. three experimental articles for later diabetes. cardiovascular increased permeability and vasodilation and various kinds of inflammation. and cardiovascular proliferative diseases, there is a basic starting.

Keywords: endothelial cells. uric acid. dye lignin.advanced glycation.apoptosis.

引言

血管内皮覆盖于血管内膜表面，不仅是血管的保护膜，更是机体重要的内分泌、旁分泌器官，其参与调节血管壁通透性、维持血管舒张/收缩平衡、调节凝血功能平衡、减轻血管炎症反应等，对维持心血管系统发挥正常功能起着重要的作用。1993年Ross等人[1]首次提出“内皮功能障碍”假说，即在各种因素作用下，血管内皮细胞合成和释放的细胞因子之间的平衡紊乱，导致血管通透性增加、血管舒张/收缩失衡、炎症反应增加等[2]。此后，血管内皮功能成为心血管领域研究的热点，几乎所有的心血管疾病均与内皮功能障碍有关。正是因为内皮细胞的重要性，在近期的三篇文献中“尿酸对血管内皮细胞氧化应激反应的影响及其对细胞的损伤作用”“染料木素对氧化应激诱导内皮细胞氧化应激损伤的保护作用和机制”“晚期糖基化终产物对心肌微血管内皮细胞及糖尿病心肌缺血再灌注损伤的影响及机制”总结性的对内皮细胞的结构和功能做出一个简要的分析。

随着生活条件改善，心血管疾病的发病率逐年增加，据世界卫生组织2008年全球疾病负担报告指出，心血管疾病是全球头号杀手。在认识血糖及血脂等经典危险因素的同时，高尿酸血症患病率的逐年上升与心血管疾病的关系备受关注。大量流行病学调查发现尿酸(Uric acid,UA)升高与高血压、糖尿病、代谢综合征、’肾脏损害等心血管疾病的发生、发展有关。[3]

1. 尿酸对内皮细胞的影响

UA是内源性核酸分解与食物中摄入的嚓吟经核普酶分解为次黄嘌吟，在黄嘌吟氧化酶(Xanthine oxidase,XO)作用下转变为黄嘌吟，并进一步降解而产生的。在人和多数灵长类动物中，UA主要经肾脏(占90%)和肠道(10% )排泄。非哺乳类动物等可表达尿酸酶，将血清尿酸(Serum uric acid,SUA)转化成尿囊素，由于尿囊素的水溶性高，容易通过肾脏排泄，所以这些动物的SUA浓度常常低于0.02g/L，而人和多数灵长类动物因缺乏尿酸酶，SUA常常较高，容易患高尿酸血症。当人类SUA浓度高于0.06g/L(女性)或0.07g/L(男性)时，即可产生高尿酸血症[4]。

UA首次被关注是由于过饱和的尿酸(水中>0.068g/L)结晶，产生关节炎症引起痛风。后来发现，UA结晶不仅有促炎症作用，也有抗氧化作用Ames等指出UA是循环中主要的抗氧化剂，正是它的存在减少了氧化应激带来的变老和基因癌变，从而使得人和某些灵长类动物的寿命较其他哺乳动物更长。在说明UA能阻止疾病发生的同时，有学者提出高尿酸血症可能通过损伤血管内皮细胞功能参与心血管疾病的发生、发展。Erdogan 等[5]大量观察性研究表明无论是SUA正常的健康者、原发性高血压还是心力衰竭者，SUA与内皮细胞功能均呈负相关;Mszzali M[6]等动物实验证明，通过应用尿酸酶抑制剂3周建立的高尿酸血症模型，说明高尿酸血症与高血压的发生有关，且通过降低UA可阻止舒是一种机体阴离子转运体，可阻止UA进入细胞，从而抑制UA的氧化应激反应patsakA指出RAS系统中的重要组成部分血管紧张素II除了能直接收缩血管外，还能诱导产生氧自由基，加速一氧化氮( Nitric oxide,NO )消耗而降低其舒血管作用，而UA可激活RAS系统;UA穿过受损的内皮细胞进入血管平滑肌，激活P38, ERK44/42 MAPK途径，活化转录因子AP-1, NF-KB,从而产生MCP-1, CRP及PDGF等细胞因子，使VSMC增殖或产生炎症反应‘27-2810此三种作用机制之间相互联系，关系错综复杂，因此目前对于UA致内皮细胞损伤的具体机制尚不明确。

作者通过UA对内皮细胞的一系列的实验，在不同的浓度的UA对内皮细胞的结构的影响，我们可以在分光光度计的观察下，在不同的时间段下，我们可以测量内皮细胞的含氧

量。

实验原理:模拟机体内黄嘿吟与XO反应系统，产生02，加入电子传递物质及gress氏显色剂，使反应体系呈现紫红色，可用分光光度计侧其吸光度。当被测样本中含有产生O2一时，则比色时测试管的吸光度高于对照管的吸光度;当被测样本中含有02一抑制剂时，则比色时测试管的吸光度低于对照管的吸光度，从而可反映出被检物品对O2一的影响能力。我们可以看出其中的结论是如图1。这分别是在0h，24h，48h 的情况下培养的内皮细胞下状况，HUVEC消化后呈圆形，单个或数个连接，细胞接种后约1h开始贴壁生长，早期细胞呈小多角、球形、呈团状，少数细胞伸展，24h生长最快，逐渐生长成梭形，细胞间相互连接，呈鱼贯状，间呈漩涡状排列。核清晰，呈圆形或椭圆形，1-2个核仁，胞浆丰富，内含小颗粒，48h胞体呈多角形一可见相互嵌合，为单层，呈铺路石状排列(图1)。符合血管内皮细胞生长方式[7]。

图1 不同时间HUVEC体外培养情况（200×）

尿酸可刺激liuvEc内O2一表达;当尿酸作用时间为6,12,24,48h时，0.10g/L UA组与O.OSg/L UA组O2一表达无统计学差异(< P > 0.05 ) 0.20g/L UA组较0.1 0g/LUA组O2一表达显著性增加(P<0.05 ) 0.30g/L组与0.20g/L组无统计学差异((P> 0.05)。

空白对照组各时间点间O2一表达无明显变化;不同浓度尿酸(0.05, 0.10, 0.20,0.30g/L )，随着作用时间(6, 12, 24h)延长，O2一表达逐渐增加;当尿酸作用时间为48h时，O2一表达显著性降低。3.5尿酸对血管内皮细胞NADPH. X0, eNOS, COX-2, LOX表达的影响尿酸可激活NADPH, XO. eNOS表达，但COX-2及LOX表达较空白对照组无明显变化;随着尿酸刺激浓度的增加，NADPH. X0, eNOS表达逐渐增加，而0.30g/L UA组较0.20g/L UA组NADPH 表达无显著性差异，XO表达增加，eNOS表达显著性下降。

尿酸对血管内皮损害机制除氧化应激外，尚有RAS激活及血管平滑肌细胞增殖或炎症等，且三者之间联系紧密[8]，如有学者指出尿酸激活内皮细胞氧化应激是基于RAS激活基础上;尿酸通过激活RAS系统刺激V SMC增殖，RAS阻滞剂(AT1受体)可阻止尿酸诱导VSMC增殖，说明RAS与VSMC关系密切[9]。因此为求进一步深入、全面地探讨尿酸对血管损害机制应制备动物模型同时研究尿酸与氧化应激、RAS系统及血管平滑肌细胞增殖及炎症等[10]。

2 晚期糖基化终产物对心肌微血管内皮细胞的影响

晚期糖基化终产物(advanced glycation end products, AGEs)是机体在长期高糖状态时蛋白质和还原糖之间经过非酶性糖基化反应生成的物质，它被认为是糖尿病最主要的致病物质之一。AGEs主要通过与其受体((RAGE)作用从而促发氧化应激反应，导致ROS大量产生，促进ICAM, VCAM, TNF-a,IL-6等一系列炎症因子的表达，导致细胞的损伤。最近有研究表明，与野生型小鼠相比，RAGE-/一小鼠心肌缺血再灌注损伤明显降低，同时伴有硝基酪

氨酸(体内蛋白质被硝基化修饰的主要指标)水平增加。但是，AGEs/RAGE导致蛋白质被硝基化修饰的机制以及导致哪种蛋白质硝基化修饰仍不清楚，更重要的是AGE s/RAGE在心肌以及心肌微血管内皮细胞缺血性损伤中的作用及机制也未完全阐明[11]。

晚期糖基化终产物增加缺氧复氧诱导的心肌微血管内皮细胞的硫氧还蛋白硝基化失活,硫氧还蛋白是一种12kd大小的小分子蛋白，具有促进细胞增殖及生长的功能。其活性除了转录及翻译水平的调节外，还可以通过翻译后的修饰来调节。有研究表明，硫氧还蛋白可以被硝基化修饰，导致其活性不可逆的被抑制，从而取消其心肌保护作用。在本实验中我们发现，晚期糖基化终产物可以导致体内某些蛋白质的硝基化修饰，但是究竟是哪种蛋白被修饰仍不清楚[12]。因此，我们假设，晚期糖基化终产物导致的心肌微血管内皮细胞损伤可能与硫氧还蛋白的硝基化修饰有关。我们发现，与Sham组相比，缺氧复氧损伤分别增加对照及晚期糖基化终产物预孵育组硫氧还蛋白的表达(all P<0.05 )但是晚期糖基化终产物不管对

Sham组及S I/R组的心肌微血管内皮细胞的硫氧还蛋白的表达均没有影响[13]。

进一步的研究表明[14]，晚期糖基化终产物减少缺氧复氧诱导硫氧还蛋白的硝基化失活，表现为增加了硫氧还蛋白的硝基化水平(P<0.01) (Fig 1-4)，降低硫氧还蛋白的活性(P<0.01) 在本实验中，我们发现:1、晚期糖基化终产物是心肌微血管内皮细胞缺氧复氧损伤加重的重要原因;2、硫氧还蛋白的硝基化失活是晚期糖基化终产物导致心肌微血管内皮细胞缺血性损伤的分子机制，从而发现了晚期糖基化终产物导致细胞损伤的一种翻译后修饰新机制;3、阻断RAGE信号或者给予外源性的硫氧还蛋白可能将是治疗心肌微循环受损的有效方法[15]。

3. 染木素的氧化应激诱导内皮细胞的凋亡

本研究发现，低剂量(生理浓度，nM)的大豆异黄酮一染料木素对氧化应激诱导的内皮细胞活力下降和凋亡有明显的抑制作用，这种抗氧化效应是通过对抗氧化基因Nrf2和PPA 助，及受此两种抗氧化原件调节的下游基因HO-1所调控的，此外细胞自身的抗氧化机制SOD, CAT和GSH亦发挥了重要作用[16]。该研究结果进一步阐明了染料木素对抗内皮细胞氧化应激损伤的保护作用机制。

内皮细胞损伤或继发的内皮细胞凋亡是许多血管病变如氧化应激诱导的动脉粥样硬化中的核心事件。以往研究表明，药理浓度扭M)的染料木素对内皮细胞的氧化应激损伤有保护作用，比如对细胞的增殖抑制和分泌抑制作用，降低细胞凋亡率或细胞通透性。本研究证实，生理浓度(nM)的染料木素能明显抑制氧化应激诱导的内皮细胞凋亡。值得注意的是，本研究所采用的染料木素浓度100 nM-500nM，而有摄食大豆及其制品的亚洲人群中的血浆中染料木素浓度为300 nM-500 nM,二者浓度范围十分接近。结合此流行病学观察和该研究结果提示，富含大豆或大豆制品的饮食可能对动脉粥样硬化患者有益[17]。

关于染料木素与细胞凋亡的研究的报道结果不尽相同，且有关染料木素的抗氧化或致氧化效应的研究亦存在着一定的争议。染料木素对许多肿瘤细胞，如乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、非小细胞肺肿瘤细胞、头颈鳞状癌细胞和胰腺癌细胞都显示出诱导凋亡的能力。染料木素的这种致凋亡作用与其对凋亡相关基因的调节有着密切关系，比如Bcl-2, Bax, Bcl-xl, PPAR和Caspase-3 。目前尚没有直接的研究证据表明染料木素的致凋亡作用是通过它的致氧化效应所导致的。Ullah及研究小组成员等发现，染料木素通过激发内源性铜离子和ROS 生成从而诱导乳腺癌细胞凋亡。亦有研究表明，染料木素能够抑制ROS的产生，从而抑制NF-KB的活性，具有抗氧化活性，此作用机制在肿瘤血管生成和癌细胞迁移过程中具有重要意义。染料木素对慢性疾病如心血管疾病、骨质疏松和阿茨海默症(Alzheimer's disease)同

样具有防治作用。据报道[18]，在内皮细胞、人视网膜上皮细胞和神经元PC12细胞中，染料木素通过增强抗凋亡蛋白的表达从而降低细胞凋亡率。除了可直接清除ROS和抑制LDL氧化，染料木素对细胞内激酶级联信号通路亦有强烈的激活作用，包括eN0 S , NF-oB , Nrf 1和Nrf2 ,染料木素的这些较强的生物学活性使其作为一种优良的天然抗氧化剂被应用于临床成为可能。染料木素对肿瘤细胞具有致凋亡作用的干预剂量通常需达到数十微摩甚至更高，但此剂量范围对正常细胞却没有明显的影响，基于此观察，我们推测，染料木素的这种生物学效应的差异性可能归结于在肿瘤和心血管疾病两种不同的病理情况下，肿瘤细胞和正常细胞基因表达谱具有本质的差别。不同于正常细胞，肿瘤细胞的特点在于其无法受到调控的生长或增殖、高侵袭性、高迁移性以及NF-KB信号通路的持续激活，这些异常的细胞行为都导致了肿瘤细胞始终处于高氧化应激状态。对许多不同来源的肿瘤细胞的研究表明，染料木素诱导肿瘤细胞凋亡的浓度范围一般为30 M—100 M。值得注意的是，如此高浓度的染料木素对正常细胞却没有任何毒性。根据我们目前的研究显示，高浓度的染料木素(50 M)对内皮细胞增殖或凋亡几乎无影响。此外，有报道称姜黄素能够诱导结肠癌细胞凋亡，并能增强奥沙利铂(Oxaliplatin)对结肠癌细胞的杀伤作用，却对正常的结肠永生细胞没有影响EGCG对表皮癌细胞有诱导凋亡的作用，却对正常的角蛋白细胞没有影响。因此，在研究染料木素的促凋亡或抗凋亡效应时，不能简单的将染料木素定义为一种抗氧化剂或一种致氧化剂，特别是在不同来源的细胞株或不同病理状态下进行的研究。这一点在对染料木素的作用进行分子机制研究时显得尤为重要，在探讨其分子机制时必须根据

实际的实验条件充分考虑剂量的设置、细胞型的选择以及生长环境等可能对分子机制产生重要影响的各种因素。

通过尿酸、染木素、晚期糖基化产物三种物质对内皮细胞的的不同程度的实验，对其信号通路上的各种蛋白的调控对内皮细胞的的凋亡研究，使得我们再对糖尿病、高血压的的各种心血管疾病有个很好实验铺垫性研究。

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