鸡毒支原体的分离与鉴定
鸡毒支原体感染症状与治疗方法
鸡毒支原体感染 鸡毒支原体感染的原因 鸡毒支原体感染在鸡主要表现为呼吸道症状，如气管炎、气囊炎等，所以曾经一度名之为慢性呼吸道病。引这种感染是世界性分布的，国内也很普遍。 鸡毒支原体感染的症状 表现咳嗽、喷嚏、气管罗音和鼻炎。鼻炎尤其常见于火鸡，患禽一侧或双侧眶下窦发炎、肿胀，严重时眼睛张不开。常有鼻涕堵塞鼻孔，有时鼻孔被粘液混合物堵满，病禽频频摇头急于甩掉，有时用翅膀拂擦鼻液致使翅上涂着鼻液变污。常出现轻度结膜炎，眼上有清性分泌物，但有时眼睛炎症也很严重。有时关节发炎出现跛行，但少见有站立不起的。在火鸡偶尔出现运动失调，这是由于支原体侵入脑内所致。也有报道引起腹水症状的。受感染鸡群生产性能下降。有报道说，感染鸡比正常无感染鸡少产卵10～20个，孵化率下降10个百分点，肉鸡存活率下降10个百分点，活重减少0.2kg，肉料比由1.85上升为2.2。也有报道说，在发病期间出雏率下降到40%上下，雏鸡有10%出现畸形。一般说来死亡轻微，但也有时出现10%～30%甚至更高的死亡率。这大概都是由于环境应激或者并发感染所致。发病虽然常年都可能发生，但寒冷季节居多。幼鸡群比成年鸡群发病多，这与年龄有关，也可能与成年鸡以往感染获得免疫有关。 鸡毒支原体感染的治疗方法 在病初可以试用一些对支原体有抑制作用的抗生素进行治疗，抗生素可以拌在饲料内或者经过饮水投服，也可以注射。土霉素和四环素的用量为每吨饲料400g；泰乐菌素为每4.5L 水内加2～3g；北里霉素为每吨饲料内300～500g。泰妙菌素(支原净是泰妙菌素的一种制剂)饮水含量为120～500mg/L，不论饮水或饲料拌服都要连用几天。如果投药效果不良，就要考虑并发病的问题，或者是病原株对所使用的抗生素具有抗药性的关系
病毒分离方法
植物内生菌分离方法 植物内生菌分离方法 匿名提问 2009-02-18 20:04:53 发布 自然科学学术 6个回答 回答 曲恋| 2009-02-18 20:45:40 有0人认为这个回答不错| 有0人认为这个回答没有帮助 植物内生放线菌是一类大有开发潜力的微生物资源。目前使用的分离条件和技术尚不完善，容易被外源菌和内生真菌、细菌污染，因此内生放线菌尤其是稀有内生放线菌的选择性分离技术至少是今后一段时间研究的重点。介绍了植物内生放线菌选择性分离方法并提出值得研究的问题。( 添加评论(0) nk0226 | 2009-07-25 11:13:09 有0人认为这个回答不错| 有0人认为这个回答没有帮助 植物病毒与病毒防治 Plant Virology& Control of Plant Virology 32学时2学分 一、课程性质、地位和任务 植物病毒与病毒防治是研究病原病毒与植物病毒病害相互关系的生物学科。本课程重点讲授植物病毒相关生物学特性与研究进展：病毒侵染寄主植物生理效应与抗病免疫；植物亚病毒病原等基础理论知识。同时，根据植物病毒基础研究需要，课程理论讲授与实验技能训练并重。通过本课程的学习，使学生进一步熟悉病毒病原与其它相关病原的区别要点，病害宏观及微观鉴定基本技术、方法、手段，并能在实践中应用。为独立开展植物病毒及病毒病害研究奠定基础。 二、课程教学的基本要求 要求学生重点掌握以下内容： （1）植物病毒的传播途径及传毒机制；
（2）病毒侵染植物内部症状，侵染增殖过程； （3）植物受病毒侵染的生理效应与抗病免疫； （4）植物亚病毒病原的基本特性； （5）植物病毒与病毒病害诊断鉴定的程序与方法。 三、课程理论教学大纲及学时分配 1. 绪论（2学时） 1.1 病毒的发现与病毒学的发展 1.2 研究病毒的意义与任务 1.3 植物病毒与其他病毒的关系 1.4病毒与其他微生物的区别 2. 病毒的分类与命名（3学时） 主要介绍病毒分类和命名的基本原则相关指标。重点：植物病毒的命名和分类系统。 2.1 病毒命名和分类的发展 2.2 病毒命名的系列 2.3 病毒分类的系列 2.4 植物病毒的命名和分类系统 3. 病毒侵染植物与增殖与增殖过程及遗传与变异（5学时） 主要讲授植物病毒侵染方式，在寄主体内的增殖过程，病毒遗传变异的本质。难点:病毒进入寄主细胞的方式及粒体装配。 3.1病毒粒体的吸附与侵入 3.2病毒粒体的脱壳与生物合成 3.3病毒粒体的装配与释放 3.4病毒的遗传与变异 3.5病毒的体外重新组与生物活性 4. 植物病毒的传播途径及传毒机制（5学时） 主要讲授病毒的介体传播和非介体传播的两大途径，以及不同介体传播机制与病害发生流行关系，难点：介体持久性传毒（口针传毒）与非持久性传毒（巡回传毒）机理。 4.1介体传毒 4.2非介体传毒 4.3种子与花粉传毒 4.4传毒机制 5. 病毒侵染植物生理效应与抗病免疫（5学时） 主要介绍病原侵染植物的内部症状（内含体）、病毒在植物体内的运转及生理活性物质改变与寄主抗病机理。难点：病毒侵染植物的生理变化与寄主的免疫反应。 5.1病毒侵染植物内部症状（内含体及其类型） 5.2病毒在植物体内的运输
支原体
简介 支原体是在1898年发现的，又称人形支原体，是一种简单的原核生物。其大小介于细菌和病毒之间。 结构也比较简单，多数呈球形，没有细胞壁，只有三层结构的细胞膜，故具有较大的可变性。支原体的基因组多为双链DNA，散布于整个细胞内没有形成的核区或拟核。这种细胞内含有DNA,RNA和多种蛋白质，包括上百种酶。支原体可以在特殊的培养基上接种生长，用此法配合临床进行诊断。与泌尿生殖道感染有关的主要是分解尿素支原体和人型支原体两种，约有 20-30%的非淋菌性尿道炎的病人，是由以上两种支原体引起的，是非淋菌性尿道炎及宫颈炎的第二大致病菌。在成年人的泌尿生殖道中分解尿素支原体和人型支原体感染率主要与性活动有关，也就是说，与性交次数的多少、性交对象的数量有关，不管男女两性都是如此。据统计女性的支原体感染率更高些，说明女性的生殖道比男性生殖道更易生长支原体。另外，分解尿素支原体的感染率要比人型支原体的感染率为高. 特征 (1)形态与结构 支原体的大小为0.1～0.3um,可通过滤菌器，常给细胞培养工作带来污染的麻烦。菌落小（直径0.1~1.0mm），在固体培养基表面呈特有的"油煎蛋"状。无细胞壁，不能维持固定的形态而呈现多形性，对渗透压敏感，对抑制细胞壁合成的抗生素不敏感。革兰氏染色不易着色，故常用Giemsa染色法将其染成淡紫色。细胞膜中胆固醇含量较多，约占36%，对保持细胞膜的完整性具有一定作用。细胞膜含甾醇，比其他原核生物的膜更坚韧。凡能作用于胆固醇的物质（如二性霉素B、皂素等）均可引起支原体膜的破坏而使支原体死亡。 支原体基因组为一环状以双链DNA，分子量小（仅有大肠杆菌的五分之一），合成与代谢很有限。 肺炎支原体的一端有一种特殊的末端结构（terminal
病毒的分离鉴定讲课教案
病毒的分离鉴定
病毒的分离与鉴定 要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必须满足以下原则： ①从患病者体内分离出病毒； ②在实验动物或寄主细胞中可以培养； ③证明这种培养物具有滤过性； ④在原始宿主或相关种属内能产生同样的病症； ⑤能重新分离出病毒。 1.病毒的分离 1.1标本的处理 1.1.1标本的收集 a)粪便标本：将5g粪便标本和50ml PBS放入盛有20-25颗玻璃小 珠的100ml无菌瓶中，搅拌成悬液，倒出上清，3000×g，4℃离心6min。 b)拭子和生物体液：拭子浸在2-3ml运载培养基中，将棉拭子中的 液体尽量挤出以获得标本，如果液体被污染，应3000×g 4℃离心30min。 c)组织标本：用无菌乳钵或匀浆器研磨组织标本，同时加入足量的 PBS制备成20%的悬液，3000×g 4℃离心30min。 1.1.2 除菌处理 a)粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4℃过夜。 b)鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4℃作用
4小时。 c)对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病 毒、痘病毒等，则可加入等量的乙醚4℃过夜除菌。 1.2病毒的分离培养 病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体细胞进行分离培养（细胞培养）。 1.2.1 鸡胚接种 a)鸡卵的选择：一般都选新鲜、10天以内的受精卵以保证规格质 量上的一致。 b)孵育：孵育时可将鸡卵放入卵箱内进行,气室向上，孵育的最适 温度为38--39℃，相对湿度为40—70％，孵育8日后，鸡卵应每天翻动1—2次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。 c)检卵：鸡卵孵育4～5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况 （二天一次）。①未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。 ②活鸡卵：鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管， 鸡卵内有一小黑点（鸡胚），有明显的自然转动。③死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩张、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和胚胎的位置待用。 d)接种：
病毒的分离鉴定
病毒的分离鉴定 Prepared on 22 November 2020
病毒的分离与鉴定 要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必须满足以下原则： ①从患病者体内分离出病毒； ②在实验动物或寄主细胞中可以培养； ③证明这种培养物具有滤过性； ④在原始宿主或相关种属内能产生同样的病症； ⑤能重新分离出病毒。 1.病毒的分离 1.1标本的处理 标本的收集 a)粪便标本：将5g粪便标本和50mlPBS放入盛有20-25颗玻璃小 珠的100ml无菌瓶中，搅拌成悬液，倒出上清，3000×g，4℃离心6min。 b)拭子和生物体液：拭子浸在2-3ml运载培养基中，将棉拭子中的 液体尽量挤出以获得标本，如果液体被污染，应3000×g4℃离心30min。 c)组织标本：用无菌乳钵或匀浆器研磨组织标本，同时加入足量的 PBS制备成20%的悬液，3000×g4℃离心30min。 除菌处理 a)粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4℃过夜。
b)鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4℃作用 4小时。 c)对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病 毒、痘病毒等，则可加入等量的乙醚4℃过夜除菌。 1.2病毒的分离培养 病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体细胞进行分离培养（细胞培养）。 鸡胚接种 a)鸡卵的选择：一般都选新鲜、10天以内的受精卵以保证规格质 量上的一致。 b)孵育：孵育时可将鸡卵放入卵箱内进行,气室向上，孵育的最适 温度为38--39℃，相对湿度为40—70％，孵育8日后，鸡卵应每天翻动1—2次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。 c)检卵：鸡卵孵育4～5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况 （二天一次）。①未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。 ②活鸡卵：鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管， 鸡卵内有一小黑点（鸡胚），有明显的自然转动。③死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩张、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和胚胎的位置待用。 d)接种：
中药治疗鸡毒支原体病的研究进展
畜牧兽医科技信息 2010年第12期中药治疗鸡毒支原体病的研究进展 孟冬霞，武果桃，任 杰 （山西省农业科学院畜牧兽医研究所，太原030032） DOI:10．3969/J.ISSN ．1671-6027．2010．12.003 鸡毒支原体病也称鸡慢性呼吸道病(Chronic Respiratory Disease,CRD)，是由鸡毒支原体（M ycoplsma gallisepticum,M G)引起的一种接触性、传染性呼吸道病，以咳嗽、流鼻涕、呼吸时发出音和窦部肿胀为临床特征。疾病发展缓慢，病程很长，有的呈隐性感染，在鸡群中可长期蔓延。既可水平传染，亦可垂直传播。目前鸡单一慢性呼吸道病很少，多与大肠杆菌病、传染性鼻炎、新城疫和传染性支气管炎等引起呼吸道症状的疫病混合感染，对养鸡业危害极大，是影响鸡群增重和生长发育的严重疫病之一。目前，国内外对CRD 主要采用抗生素治疗，虽然有一定的治疗作用，但由于生产中频繁使用大量的抗生素，使M G 对抗生素的敏感性逐渐降低，同时随着人们食品安全的意识加强以及国际残留限量的要求逐年提高，抗生素的应用受到了很大的限制。中草药因其独特的优势，越来越受到人们的青睐。许多科研工作者进行了中草药治疗鸡慢性呼吸道疾病的研究，并取得了一定进展。1中药的优势 中药是取自自然界的天然物质，完整保留了它们的自然结构和生物学活性，在治疗鸡毒支原体病方面有着独特的优势。 1.1自然性 中药属于纯天然药物，同时含有多糖、低聚糖、生物碱、甙类、酶类、有机醇、鞣质及多酚类、色素和挥发油等活性成分及淀粉、蛋白质、氨基酸、纤维素、脂肪、维生素等营养成分，这是西药所无法比拟的。 1.2多功能性 每一种中药均含有十种、数十种甚至上百种有机成分，这就决定了其功能的多样性，如营养作用、调节作用、抗应激作用、抗病原体作用、激素样作用、增强免疫作用等。 1.3双向调节性 中药对同一器官组织的不同功能起到双向调节作用，中药可以对免疫功能进行双向调节。 1.4毒副作用小 中药所含成分均为生物有机物，相对于抗生素和化学合成药物毒副作用小。 1.5不易产生抗药性 中药成分复杂和多靶点的作用机理，使细菌不易产生耐 药性。 因为中药治病主要是通过扶正去邪，调整阴阳，提高动物免疫力，从而消灭病原体，使其恢复平衡。 1.6增强动物机体的免疫力 中药所含有的多糖、甙类、生物碱、挥发油等多种生物有效成分能够特异性或非特异性地增强动物机体的免疫力。 1.7整体调节性 中药是多种成分的复合体，在作用机制上以整体调节为主。中药对动物机体有激素样作用和适应原样作用。近期的研究表明，中药免疫调节剂在体内的作用不仅与免疫系统的作用有关，而且与神经内分泌系统的作用也密切相关。在神经内分泌与免疫系统之间有一个由多种神经递质、激素和免疫活性物质（如细胞因子）构成的完整调节网络，共同维持机体免疫功能，使其处于稳定的平衡状态（健康状态）。2鸡毒支原体感染的辩证论治分析 鸡毒支原体病由鸡毒支原体感染所致。其发病机理为鸡感染鸡毒支原体后，气管及支气管的粘膜及其上纤毛严重破坏而脱落，其分泌功能和纤毛排斥异物痰液的功能严重受损，使痰液无法排除而沉积到细支气管末端及肺泡中，最终使部分肺组织（尤其于肺边缘）肉变、硬变、坏死，从而临床上出现呼吸困难，临床症状主要表现为喷嚏、流泪、咳喘、呼噜、鼻炎、流涕、眼睑、鼻窦肿胀等。多呈慢性经过。 本病常因继发感染和环境恶化（如拥挤、空气污浊不洁、维生素缺乏营养不良、寒冷等）使机体抵抗力降低，正气受损时病情加重。故环境恶化、饲养管理不良、机体抵抗力降低常为本病的诱因。 根据中医理论分析，急病多实，慢病多虚，同时又多以环境恶化、饲养管理不良、寒冷、机体抵抗力下降，正气受损为诱因，据此本病应属虚证范畴，但根据病理变化，肺组织的肉变、硬变、坏死及咳喘等症状，又是邪实的表现。故综上分析，本证属正虚邪实，故治则应扶正祛邪，以补肺润肺以扶正，宣肺平喘、理气化痰、清热解毒以祛邪。3中药在治疗鸡毒支原体病上的应用 3.1中药种类3.1.1清热类药 金银花、连翘、板蓝根、黄药子、白药子、穿 心莲、鱼腥草清热解毒药等；栀子、知母、石膏、胆酸等清热降火药；黄连、黄柏、黄芩等清热燥湿药。 专论与综述 6
支原体
支原体 1. 支原体：没有细胞壁的原核细胞型微生物、细胞膜含固醇、能通过0.45m滤菌器、二分裂繁殖，含DNA与RNA、能在无生命培养基中繁殖的最小微生物。 2. ①球状体：0.2~0.25 μm，最小达0.1 μm；②丝状体：最长可达150 μm。③因细胞柔软且具扭曲性，致使细胞能通过孔径比自身小得多的过滤器 3. 支原体是引起实验室细胞感染的非常普遍的现象，常常导致细胞培养失败。 4. 支原体的细胞膜中含有一般原核生物所没有的甾醇，所以即使缺乏细胞壁，其细胞膜仍有较高的机械强度。 5. 致病类别：肺炎支原体（M. pneumoniae)、人型支原体(M. hominis)、生殖器支原体(M. genitalium)、穿透支原体(M. penetraus)、溶脲脲原体(U. urealyticum)。 6. 致病性与免疫性 7. 主要致病性支原体:①非典型性肺炎（约占非细菌性肺炎的1/2），通过呼吸道传播——肺炎支原体（不分解尿素）；②泌尿生殖系统感染，可造成不育症。通过性接触传播或母婴传播——解脲脲原体、人型支原体及生殖支原体（能分解尿素)。 8. 肺炎支原体：通过飞沫传染, 多发夏秋季节. 多见于青少年。 （1）所致疾病: 引起间质性肺炎(非典型性肺炎) 、哮喘及支气管炎 （2）致病物质及机制： A. 顶端结构：粘附和定植功能，刺激作用致炎症。 B. 多糖荚膜：抗吞噬作用。 C. 夺取宿主细胞的脂质与胆固醇，破坏细胞。 D. 产生毒性代谢产物(如神经毒素、超氧离子、氨等），引起细胞损伤。 E.诱发超敏反应。 9.泌尿生殖道支原体 （1）病原体: 溶脲尿原体、人型支原体及生殖支原体 （2）所致疾病：性传播性疾病，仅次于衣原体占第二位。常发生混合感染，如支原体+衣原体，支原体+淋球菌。A. 泌尿生殖系统炎症及泌尿道结石；B. 男性不育症；C. 先天畸形, 自然流产, 死胎； 10. 微生物学检验 （1）标本采集：一般可取病人痰、咽拭子、鼻咽洗液、支气管分泌物、血清标本等。（2）标本直接检查：标本涂片、核酸检测、 （3）分离与鉴定 （4）抗体检测：ELISA、补体结合(CF)试验、间接血凝试验、 （5）冷凝集实验：肺炎支原体感染后，患者血清中出现冷凝集素，能在0-4 ℃条件下凝集人红细胞（37℃时却无此效应）。此凝集实验为非特异性的，仅33-75%患者出现，是肺炎支原体感染的辅助诊断试验。
病毒的分离与鉴定
病毒的分离与鉴定 （一）病毒的分离病毒分离的一般程序是：检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状鸡胚→病变或死亡细胞培养→细胞病变→鉴定病毒种型(血清学方法)无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离… （一）病毒的分离 病毒分离的一般程序是： 检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状 鸡胚→病变或死亡 细胞培养→细胞病变 →鉴定病毒种型(血清学方法) 无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离心后，取上清接种；咽洗液、粪便、尿、感染组织或昆虫等污染标本在接种前先用抗生素处理，杀死杂菌。 1．细胞培养用分散的活细胞培养称细胞培养（Cell culture）。所用培养液是含血清（通常为胎牛血清）、葡萄糖、氨基酸、维生素的平衡溶液，pH7.2～7.4。细胞培养适于绝大多数病毒生长，是病毒实验室的常规技术。 原代细胞培养(Primary cell culture) 用胰蛋白酶将人胚（或动物）组织分散成单细胞，加一定培养液，37℃孵育1-2天后逐渐在培养瓶底部长成单层细胞，如人胚肾细胞、兔肾细胞。原代细胞均为二倍体细胞，可用于产生病毒疫苗，如兔肾细胞生产风疹疫苗，鸡成纤维细胞产生麻疹疫苗，猴肾细胞生产脊液灰质炎疫苗。因原代细胞不能持续传代培养，故不便用于诊断工作。 二倍体细胞培养(Diploid cell cultune) 原代细胞只能传2-3代细胞就退化，在多数细胞退化时，少数细胞能继续传下来，且保持染色体数为二倍体，称为二倍体细胞。二倍体细
鸡毒支原体病的治疗方法.doc
鸡毒支原体病的治疗方法 概述：鸡毒支原体对许多抗生素易产生耐药性，而且停药后往往复发，长期单一使用某种药物，往往效果不明显，临床用药应该做到剂量适宜、疗程充足、联合用药和交替用药等。本病的药物治疗效果与有无并发感染关系很大，病鸡如果同时并发其他病毒病，疗效不明显，所以应及时控制并发症或继发病。 鸡毒支原体病的治疗方法 1、在病初可以试用一些对支原体有抑制作用的抗生素进行治疗，抗生素可以抖在饲料内或者经过饮水投服，也可以注射。 2、土霉素和四环素养的用量为每吨饲料400g; 3、泰乐菌系为每4.5L水内加2—3g; 4、北里霉素为每吨饲料内300—500g。 5、泰妙菌素(支原净是泰妙菌素的一种制剂)饮水含量为120—500mg/L,不论饮水或饲料拌服都要连用几天。 6、如果投药效果不良，就要考虑并发病的问题，或者是病原株对所使用的抗生素具有抗药性的关系。 鸡毒支原体病有什么特征? 鸡毒支原体具有一般支原体形态特征，格兰氏染色阴性，发酵葡萄糖，不水解精氨酸，不从尿素取得能源，对毛地黄皂苷敏感，还原四氮唑，吸附鸡红细胞，溶解绵羊红细胞，不形成膜与斑。鸡毒支原
体具有缓慢运动的能力，此种能力可能与其一种特殊超微结构有关系，即在细胞的一端偶尔在两端有小泡状物，支原体以此小泡接触于真核细胞，运动时顺小泡方向移动。 鸡毒支原体对环境抵抗力低弱。在水内立刻死亡。在20度的鸡粪内可生存1——3天。在卵黄内37度时生存18周，在45度中经12—14h死亡。液体培养在4度中不超过1个月，在-30度中可保存1—2年，在-60度中存活时间更长。 鸡毒支原体有什么流行特点? 鸡毒支原体感染流行于全世界鸡场中。根据血清学调查，感染率平均在79%—80%间。影响到鸡毒支原体感染流行的因素，除去支原体本身的致病性以外，鸡的年龄显然也是一个因子，鸡对支原体感染力随年龄的增长而加强。并发感染对鸡毒支原体感染有相当大的影响，即使是致病力不强的鸡毒支原体隐性感染，也常会因接种新城疫疫苗或传染性支气管炎疫苗而暴发临诊的支原体病。 环境因素也起着影响鸡毒支原体感染流行的重要作用。鸡群拥挤加剧了病原的传播，同时拥挤是一种应激，减低了鸡的抵抗力。鸡舍污浊、粪便集蓄，空气中氨的含量增高刺激呼吸粘膜，方便了支原体的发育。 营养不足会导致支原体疾病的发生，支原体的传播主要有两种方式，其是直接接触的方式，是感染禽呼出的带有支原体的小滴经呼吸道传染给同舍内笼的鸡或火鸡。另一种方式是经卵传播病原经过感染
犬细小病毒的分离与鉴定
犬细小病毒的分离与鉴定 摘要：采用细胞培养法对疑似犬细小病毒的粪便和内脏进行了分离和鉴定，并对分离到的病毒进行生物学特性鉴定和动物回归试验。结果共分离到3株CPV，分离株在猫肾细胞F81产生明显细胞病变，血凝效价达1∶27～1∶210，细胞病变能被犬细小病毒阳性血清所抑制，接种幼犬后，分离株3可以引起试验犬发病死亡。 关键词：犬细小病毒；分离；鉴定 犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）属于细小病毒科细小病毒属，为单股、负义、线形无囊膜的DNA病毒[1]。CPV可引起犬的出血性肠胃炎和心肌炎，并使白细胞大量减少，在幼犬中的发病率和死亡率都很高[2]。CPV对多种理化因素和常用消毒剂具有较强的抵抗力，在4～10 ℃存活6个月，37 ℃存活2周，56 ℃存活24 h，80 ℃存活15 min，在粪便中可存活数月至数年[3]；该病毒对乙醚，氯仿和醇类有抵抗力[4]。CPV一年四季均可发病，以冬、春多发[5]，饲养管理条件骤变、长途运输、寒冷、拥挤均可促使该病发生[6]。病犬是主要传染源，其呕吐物、唾液、粪便中均有大量病毒[7]。根据临床症状和血清学反应，可做出准确诊断[8-13]。本研究通过对山东毒株分离，并对其部分生物学特性进行研究，为该病的防治和后续研究提供一定的理论基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂DMEM培养基为Gibco产品；小牛血清、谷氨酸胺、双抗、胰蛋白酶等购自大连宝生物TaKaRa有限公司；其他化学试剂均为分析纯试剂。 1.1.2 病料病料为2009～2011年聊城大学兽医院收集或其他养犬场送检的可疑CPV病料，包括20份粪便样品和10份脏器。 1.1.3 试验动物和细胞8只40～50日龄的山东细犬幼犬（抗CPV HI抗体效价小于1∶4），健康状况良好；猫肾传代细胞系（F81）和犬肾传代细胞系（MDCK）等由聊城大学农学院实验室保存。 1.2 方法 1.2.1 试剂的配制 1）1%猪红细胞悬液的制备。用20 mL注射器内吸入阿氏液3～5 mL，于健康猪前腔静脉采血10～15 mL，立即混匀，4 ℃保存备用。使用时用PBS洗涤保存的猪红细胞，1 000 r/min离心5 min，洗涤3次，取红细胞泥1 mL加稀释液100 mL，再加入小牛血清白蛋白0.1 g，即为1%猪红细胞悬液。 2）HA抗原配制。用移液器向V型血凝板每孔加稀释液25 μL，然后吸取25 μL经福尔马林灭活的CPV细胞培养物，在血凝板上倍比稀释，最后1孔不稀释，作为阴性对照；接着每孔加稀释液25 μL和1%猪红细胞悬液50 μL，于振荡器上振荡1 min混匀，于4 ℃冰箱静置1～2 h，待红细胞完全沉淀后判定。判定的方法是以50%红细胞凝集为终点，在对照孔红细胞完全不凝集，呈圆形小点
肺炎支原体的分离鉴定与药敏性研究_刘展
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１２．Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．６ 中国临床医学 ２ ０１２年１２月 第１９卷 第６期 ·论著· 肺炎支原体的分离鉴定与药敏性研究 刘展１＊ 袁春丽１＊ 李青凤２ 汪水城１ 王本旭２ （１．北京市怀柔区妇幼保健院，北京 １０１４００；２．北京军区疾病预防控制中心，北京 １０００４２ ）摘要 目的：探讨肺炎支原体的临床分离株对临床常用药的敏感性。方法：将临床采集的咽试子标本经过选择性培养基筛选培养，同时进行聚合酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）检测，确定分离到的支原体为肺炎支原体。将肺炎支原体与不同浓度的临床常用抗生素混合， 观察液体培养基颜色的变化，判断肺炎支原体对药物的敏感性。结果：成功分离到１株肺炎支原体；阿奇霉素、红霉素和头孢呋辛钠浓度分别稀释至３１μｇ／ｍＬ、１２５μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ时，肺炎支原体抑制；而头孢曲松钠、美洛西林、氨苄青霉素等抗生素对支原体无抑制作用，培养基颜色均由红色变为橙黄色。结论：肺炎支原体临床分离株对阿奇霉素高度敏感， 对红霉素和头孢呋辛钠中度敏感。关键词 肺炎支原体； 分离鉴定； 药敏性中图分类号 Ｒ７２５．６ 文献标识码 Ａ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＬＩＵ Ｚｈａｎ１ ＹＵＡＮ Ｃｈｕｎｌｉ１ ＬＩＱｉｎｇｆｅｎｇ２ ＷＡＮＧ Ｓｈｕｉｃｈｅｎｇ１ ＷＡＮＧ Ｂｅｎｘｕ２ １．Ｈｕａｉｒｏｕ Ｍａｔｅｒｎａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０１４００，Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｃｏｍｍａｎｄ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００４２，Ｃｈｉｎａ Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｄｒｕｇ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｓａｍｐｌｅｓｏｆ ｔｈｒｏａｔ ｓｗａｂ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｉｎ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ，ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｈｅｙ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＰＣＲ．Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｗｅｒｅｍｉｘｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ．Ｉｆ ｏｎｅ ｄｒｕｇ ｃｏｕｌｄ ｋｉｌｌ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ，ｔｈｅ ｃｏｌｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｄｉａ ｗｏｕｌｄ ｎｏｔ ｃｈａｎｇｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｏｎｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐ ｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｔｙｐｅ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ．Ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｚｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ，ｅｒｙｔｈｒｏ－ｍｙｃｉｎ ａｎｄ ｃｅｆｕｒｏｘｉｍｅ ｓｏｄｉｕｍ ｗｅｒｅ ｄｉｌｕｔｅｄ ｔｏ ３１μｇ／ｍＬ，１２５μｇ／ｍＬ，５００μｇ／ｍＬ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｗｅｒｅｓｕｐｒｅｓｓｅｄ．Ｃｅｆｔｒｉａｘｏｎｅ ｓｏｄｉｕｍ，ｍｅｚｌｏｃｉｌｌｉｎ ａｎｄ ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ ｈａｄ ｎｏ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ：Ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｒｏａｔ ｓｗａｂ ｓａｍｐｌｅｓ ｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｅａｓｉｌｙ ｂｙ ａｚｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ．Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎａｎｄ ｃｅｆｕｒｏｘｉｍｅ ｓｏｄｉｕｍ ａｌｓｏ ｈａｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．Ｋｅｙ Ｗｏｒｄｓ Ｍｙｃｏｐｌｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ； Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ； Ｄｒｕｇ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ＊刘展和袁春丽为共同第１作者 基金项目：北京市首都医学发展科研基金（编号：２００９３２６７）通讯作者 王本旭，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗａｎｇ ｂｅｎｘｕ２０２８＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ 支原体肺炎是肺炎支原体（ｍｙｃｏｐ ｌａｓｍａ ｐｎｅｕ－ｍｏｎｉａｅ，ＭＰ） 引起的肺炎。支原体肺炎起病缓慢，患者有发热、 阵发性刺激性咳嗽、少量黏液性或黏液脓性痰。支原体肺炎多发于青少年，患病率占肺炎的 １５％～３０％［１］ 。目前临床治疗支原体肺炎的常用药 物包括阿奇霉素、红霉素等［ ２］ 。本研究旨在通过探讨ＭＰ临床分离株对临床常用抗生素的敏感性， 为临床治疗支原体肺炎提供用药依据。 １ 资料与方法 １．１ 材料 乳糖酸阿奇霉素（东北制药集团沈阳第一制药有限公司，０．２５ ｇ ，２５万Ｕ／瓶），头孢呋辛钠（Ｅｓｓｅｔｉ Ｆａｒｍａｃｅｕｔｉｃｉ ｓ．ｒ．ｌ，Ｉｔａｌｙ，０．７５ ｇ ／瓶），头孢曲松钠（上海罗氏制药有限公司，０．５ ｇ ／瓶），青霉素（石家庄制药集团有限公司，１ ｇ ／瓶）；美洛西林（华北制药有限公司，１ ｇ ／瓶）；乳糖酸红霉素（湖南中南科伦药业有限公司，０．２５ ｇ ／瓶）；支原体培养基ＣＭ０４０１、ＣＭ０４０３、ＳＲ００５９和ＳＲ００６０Ｃ（Ｏｘｏｉｄ公司，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇ ｄｏｍ）；核酸分子量标准ＤＬ２０００ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ（大连宝生物工程有限公司）。１．２ 研究方法 １．２．１ 双向培养基制备 １００ ｍＬ蒸馏水中加入３．５５ ｇ ＣＭ０４０１，１２１℃高压灭菌１５ ｍｉｎ，每个１５ｍＬ培养管中加入１ ｍＬ灭菌后的ＣＭ０４０１培养基，自然凝固。取１支ＳＲ００６０Ｃ，加入２０ｍＬ蒸馏水溶解。向每个培养管中加入２ ｍＬ ＳＲ００６０Ｃ，４℃保存备用。 １．２．２ 咽拭子标本选择性培养与鉴定 将咽拭子标本浸入双向培养基中，３７℃培养２周左右。当培养基颜色由红色转变为橙黄色时，将培养液于ＭＰ固体培养（ＣＭ０４０３＋ＳＲ００５９＋琼脂粉）上划板培养，直至镜下看到“ 油煎蛋”样菌落长成为止。挑取菌落于双相培养基中继续培养，观察培养基颜色变化。１．２．３ ＭＰ的ＰＣＲ鉴定方法 支原体核酸提取方 法参照ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃａｔ２ ２６
病毒的分离鉴定
病毒的分离与鉴定 要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必须满足以下原则： ①从患病者体分离出病毒； ②在实验动物或寄主细胞中可以培养； ③证明这种培养物具有滤过性； ④在原始宿主或相关种属能产生同样的病症； ⑤能重新分离出病毒。 1.病毒的分离 1.1标本的处理 1.1.1标本的收集 a)粪便标本：将5g粪便标本和50ml PBS放入盛有20-25颗玻璃小 珠的100ml无菌瓶中，搅拌成悬液，倒出上清，3000×g，4℃离心6min。 b)拭子和生物体液：拭子浸在2-3ml运载培养基中，将棉拭子中的 液体尽量挤出以获得标本，如果液体被污染，应3000×g 4℃离心30min。 c)组织标本：用无菌乳钵或匀浆器研磨组织标本，同时加入足量的 PBS制备成20%的悬液，3000×g 4℃离心30min。 1.1.2 除菌处理 a)粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4℃过夜。 b)鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4℃作用4 小时。
c) 对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、 痘病毒等，则可加入等量的乙醚4℃过夜除菌。 1.2 病毒的分离培养 病毒是严格的细胞寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体细胞进行分离培养（细胞培养）。 1.2.1 鸡胚接种 a) 鸡卵的选择：一般都选新鲜、10天以的受精卵以保证规格质量上 的一致 。 b) 孵育：孵育时可将鸡卵放入卵箱进行,气室向上，孵育的最适温度 为38--39℃，相对湿度为40—70％，孵育8日后，鸡卵应每天翻动1—2次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。 c) 检卵：鸡卵孵育4～5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况（二 天一次）。①未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。②活鸡卵：鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管，鸡卵有一小黑点（鸡胚），有明显的自然转动。③死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和胚胎的位置待用。 d) 接种：
病毒分离鉴定技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪的一种繁殖障碍与呼吸困难的传染病。其特征为发病母猪厌食、发热，怀孕后期发生流产、死胎和木乃伊胎，幼龄仔猪发生呼吸道症状[1]。1987年在美国中西部首先发现该病，并分离到病毒，其后在北美、欧洲、亚洲等国家流行。目前该病已在全球范围内传播、蔓延。我国郭宝清等[4]于1996年首次从暴发流产的胎儿中分离到PRRSV。国内诸多血清学检测结果表明，该病在我国许多地方已有流行[5]。河南某猪场"猪场发生临床症状疑似PRRS的传染病，用间接ELISA法检测，呈PRRS 抗体阳性。从病猪肺、淋巴结病料中分离到1株疑似PRRSV，并对其进行了一系列的鉴定。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1病料采自河南某猪场疑似PRRS发病仔猪肺脏及淋巴结。 1.1.2细胞及血清细胞系Marc145、Vero、PK15均购自中国兽药监察所；阳性血清购自中国兽药监察所；阴性血清采自无PRRS病史猪场的新生仔猪血清，经中和试验证明为阴性。 1.1.3主要试剂及试剂盒RNasin、dNTP、反转录 Buffer、MMLV、rTaq酶均购自宝生物(大连)工程有限公司；琼脂糖为 Sigma公司产品；其他常规试剂均为分析纯；UNIQ10柱式Trizol 总RNA抽提纯化试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
1.1.4RTPCR引物设计根据GenBank公布的PRRSV美洲株ORF5核苷酸序列，参照文献[6]自行设计并由宝生物(大连)工程有限公司合成下述一对引物，引物扩增片段长度为720bp；上游引物P1 5′CTG GAG CCG TGC TAT CAT3′；下游引物P2 5′TCC ATT TCA TGA CAC CTG3′。 1.2方法 1.2.1细胞培养生长液为含100 mL/L新生牛血清(NCS)的RPMIl640培养液；维持液为含20 mL/L NCS的RPMIl640培养液。Marc145、Vero和PK15细胞均在体积分数为5%的CO2培养箱中于37 ℃培养至单层后传代培养。 1.2.2病料的处理无菌采集发病仔猪的淋巴结、肺脏、脾脏等组织并剪碎，用Hanks液研磨并制成5倍～10倍的乳悬液，反复冻融3次后，经5 000 r/min离心30 min，上清悬液用0.22μm微孔滤膜过滤后，－20 ℃保存备用。 1.2.3病毒的分离将上述处理的病料悬液1 mL分别接种于长成单层的 Marc145细胞、Vero细胞和PK15细胞，37 ℃吸附1 h，补加维持液至8 mL，继续培养3 d～5 d，反复冻融3次，收获培养上清液，同时设参考毒株、正常细胞作为对照。出现典型PRRSV细胞病变时按上述方法继续传代，供进一步检测备用，连传5代未出现CPE者判为阴性。
第18章-支原体
第18章支原体 0.45 m DNA与RNA。支原体是目前所知能在无生命培养基中繁殖的最小微生物。过去曾称为类胸膜肺炎微生物(pleuropneumonia-like organism, PPLO)，由于它们能形成有分枝的长丝，故称之为支原体。 第一节概述 一、生物学性状 （一）形态与结构 支原体没有细胞壁，具有高度多形性，但基本形态有三种，即球形、双球形及丝状。有时呈棒状、星状、环状、哑铃状等不规则形态。大小为0.2～0.3μm，很少超过1.0μm，是原核细胞生物中最小的。革兰染色阴性，但不易着色，用姬姆萨染料着色较好，呈淡紫色，但需染3小时以上。 电子显微镜下的支原体细胞膜超微结构分三层，内、外二层主要是蛋白质，中间层为约含胆固醇36%的脂质。凡能作用于胆固醇的物质，如二性霉素B、皂素、毛地黄苷等能引起支原体细胞膜的破坏而死亡。与其他原核生物一样，支原体胞质内含有核糖体。 有的支原体在细胞膜外还有一层由多聚糖构成的荚膜，有毒性，是支原体的致病因素之一。 有的支原体有一种特殊的顶端结构，能使支原体粘附在宿主上皮细胞表面。这与支原体在粘膜上的定植和致病有关。也有认为顶端结构在表面上呈交替粘附和释放，造成支原体在表面滑动。 （二）基因组特征 支原体基因组是一环状双链DNA，其大小为大肠埃希菌的1/5。其中，肺炎支原体基因组为0.816 Mb, G+C占40％，大约677 ORF；生殖器支原体基因组为0.58Mb，G+C占32％，大约470 ORF。 （三）培养特性
支原体的营养要求比一般细菌高，一般都以牛心浸液为基础，除无胆甾原体外培养基中必须加入10%～20%人或动物血清，用于提供支原体合成胆固醇和其他长链脂肪酸，且能稳定细胞膜。支原体对pH要求较严格，一般在pH7.8～8.0间生长，低于7.0则死亡。溶脲脲原体因其分解尿素产氨，可使培养基pH升高，故它的最适pH 为6.0～6.5。支原体一般为兼性厌氧，仅个别菌株专性厌氧。绝大多数的支原体生长的温度范围为22～41℃，最适温度为36～37℃。 支原体主要以二分裂繁殖为主，由于基因组小，代谢能力有限，故繁殖缓慢，在含1.4%琼脂的固体培养基上孵育2～3天（有的需要2周）后形成细小菌落，直径为50～500μm，肉眼不易观察，低倍镜下绝大多数支原体的菌落呈荷包蛋样菌落，菌落核心较厚，向下长入培养基，周边为一层薄薄的透明颗粒区（图18-1）。肺炎支原体的菌落较大，直径100～150μm。溶脲脲原体的菌落最小，仅10～40μm，故曾称“T”株 (tiny strain)。 有的支原体以出芽、分枝或由球体延伸成长丝，然后分节段成为许多球状或短杆状的颗粒。 在液体培养基中支原体的生长量较少，且个体小，一般不易见到混浊，只有小颗粒沉于管底。溶脲脲原体在生长量最大时每ml不超过106～107个菌落形成单位（CFU），故液体清亮。支原体在固体和液体培养基中生长达高峰后，若继续培养，则很快死亡。在低温下可延长存活时间。 图18-1支原体菌落（×10）（肖家祁提供） 支原体是污染细胞培养的一个重要因素，支原体在细胞培养中不一定都引起细胞病变，但可影响这些细胞用于病毒培养。 （四）生化反应 支原体可根据是否能利用葡萄糖、水解精氨酸和尿素来进行鉴别。 表18-1 人类主要支原体及生化反应 支原体葡萄糖精氨酸尿素吸附细胞 肺炎支原体＋－－红细胞 人型支原体－＋－－ 生殖器支原体＋－－－ 穿透支原体＋＋－红细胞、CD4+ T细胞、巨噬细胞
禽支原体病诊断技术
禽支原体病诊断技术 禽支原体病(avian mycoplasmosis)又称鸡败血支原体(mycoplasm gallisepticum，简称MG)，常引起鸡的慢性呼吸道疾病。MG也可感染火鸡，引起传染性窦炎。世界动物卫生组织[World Organization for Animal Health(英)，Office Intentional des Epizootic(法)，OIE]将本病例B类动物疫病，我国将其列为二类疫病。 本标准规定的方法与OIE《诊断试验与疫苗标准手册》推荐相应方法一致。 本标准的附录A为规范性附录。 本标准由农业部畜牧兽医局提出。 本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位:农业部动物检疫所。 本标准起草人:郭福生、尹燕博、蒋正军、孙淑芳、陆明哲、龚振华。 1范围 本标准规定了禽支原体(MG)分离鉴定和快速血清凝集试验(RSA)的技术要求。 本标准适用于鸡和火鸡及其产品MG的检测。 2禽支原体的分离和鉴定 2.1材料准备 2.1.1培养基制备见附录A(规范性附录)。 2.1.2兔抗MG阳性血清和抗兔荧光抗体结合物。 2.2分离 2.2.1采样 活禽从鼻腔、食管、气管、泄殖腔和交合器中取样。死禽从鼻腔、眶下窦、气管或气囊采样，也可吸取眶下窦和关节渗出物或结膜囊内冲洗物。对于鸡胚从卵黄囊内表面、口咽和气囊采样。 2.2.2样品的处理 采样后应尽快培养。如须运输，小块组织置于支原体培养基中，拭子在培养基中用力搅拌数次，将培养基运回实验室尽快培养。 2.2.3接种 将样品0.2mL接种于1.8mL支原体液体培养基中，依次10倍稀释至10-3，密封，37℃培养。同时将样品接种于支原体固体培养基中，置于含5%～10%二氧化碳(CO2)培养箱中培养。 2.2. 3.1每天检查液体培养基酸碱度，一旦发现pH值变化，立即接种于固体培养基中培养。若培养基酸碱度没有变化，每隔3d～5d盲传一代，共传3代，培养10d后接种于固体培养基上培养。 2.2. 3.2固体培养基上若有菌落生长，用低倍显微镜观察菌落，可见中央突起呈荷包蛋样(有时不典型)，需进一步作血清学鉴定。 2.3鉴定 2.3.1用间接荧光抗体试验(IFA)鉴定MG。取1.0cm～1.5cm的琼脂块，菌落面朝上置于载玻片上，第一块载玻片上放一块待检分离物、一块已知MG菌落(S6或R株)、一块已知其他支原体菌落，第二块载玻片上放一块待检分离物。 2.3.2第一块载玻片上每块琼脂块上加一滴适当稀释的兔抗MG血清，第二块载玻片上琼脂块上加一滴正常兔血清。 2.3.3琼脂块在湿盒中室温条件下反应30min后，分别放到含有磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.2)的不同器皿
病毒的分离与测定
第二十九讲病毒的分离与测定 教学目的：掌握病毒效价的测定方法 教学重点：噬斑法、终点法 教学难点：病毒的分离与鉴定 课时分布：1学时 教学过程： 一、病毒的分离与纯化 1、病毒的分离 病毒的分离是将疑有病毒的样品经处理后，接种于敏感的宿主，经培育后，通过检查其特异性病理表现或其它方法以肯定病毒的存在。 （1）标本的采集与处理标本应含有足够量的活病毒；加入抗菌素除细菌；研磨或超声波处理破碎细胞，让病毒充分释放出来；标本处理后立即接种，否则冷冻保藏。 （2）标本接种与感染表现接种实验宿主（动植物、细菌）、鸡胚或细胞（要求：操作简单、易于培养、产生的感染结果易判定）。噬菌体以噬菌斑为标记；动物病毒产生致细胞病变效应；植物病毒致敏感质感植物出现坏死斑或枯斑。 2、病毒纯化 通过分离得到的是病毒感染的宿主机体、组织或破细胞后的抽提物，或感染的宿主的体液、血液和分泌物，或培养液，须将杂质成分除去。 （1）病毒纯化的标准：纯化的病毒制备物应保持其感染性；纯化的病毒毒粒应具有均一性。 （2）病毒纯化的方法毒粒的主要成分是蛋白质，故可利用蛋白质提纯方法纯化；毒粒具一定的大小、形状和密度，可离心提取。 二、病毒的测定 在谷氨酸、抗菌素、酶制剂等生产中，经常出现不正常的发酵现象。发酵缓慢、发酵液含菌数下降、菌体畸形、耗糖缓慢或停止，镜检时发现有云雾状碎片，严重时以致倒罐。
1、病毒的物理颗粒计数 （1）电镜下直接计数 （2）血细胞凝集试验许多有包膜的动物病毒能在一定条件下凝集一定种类的脊椎动物红血球，凝集量与病毒浓度成正比。 此外，可根据病毒的抗原性质，与抗体发生特异性结合，利用分光光度计对病毒进行定量。但灵敏度较低，多在特殊情况下使用。总之，该方法测得的是有活力与无活力病毒数量的总和。 2、病毒的感染性测定 测定的是因感染所引起宿主或细胞发生某一特异性病理反应的病毒数量。 病毒感染单位：能引起宿主或宿主细胞一定特异性反应的病毒最小剂量。 病毒效价：指单位体积病毒悬液的感染单位数目。 （1）噬菌斑的测定 噬菌斑：噬菌体感染敏感细胞后，通过复制使宿主细胞裂解，释放大量噬菌体，扩散到周围的细胞中，继续侵染，从而在有噬菌体的地方形成一个透亮无菌近似圆形的空斑。它是phage存在的一种指示性指标。 在液体培养基中培养物变清。一个phage产生一个噬菌斑，故可根据在固培上形成的噬菌斑数测得phage的效价。通常是将噬菌体悬液分别与高浓度的敏感细菌以及半固体琼脂均匀混合后涂布在较高浓度的营养琼脂上，培养后计算噬菌斑数便可算出噬菌体效价。 ①双层平板法 底层培养基10ml 上层培养基4ml、凝固 指示菌0.2 ml、检样0.1 ml →32℃16-24h 测定前，事先配制含2%和1%的琼脂底层培养基和上层培养基，将铺成平板，用无菌吸管吸取一定量的指示菌和被测样品与上层培养基混合，冷到45℃迅速倒在底层平板上铺平，凝固后恒温培养16—20小时，如有phage存在，则在双层琼