转基因产品检测技术和标准物质研制

转基因生物新品种培育重大专项

转基因产品检测标准物质研制（2008ZX08012－003）

赴日本交流转基因产品检测标准物质

研制技术考察报告

沈平厉建萌

二〇一〇年十二月

赴日本交流转基因产品检测标准物质研制技术

考察报告

2010年11月15日至11月20日，根据转基因产品检测标准物质研制课题预算书的安排，我们赴日本就转基因产品检测标准物质研制、产品成分检测技术、转基因生物安全管理以及转基因水稻研发等内容进行了考察。通过听取日方专家报告、面对面交流、实地考察实验室和基地等方式，我们对日本转基因产品检测标准物质研制、转基因生物安全管理等方面有了深刻的认识，我们发现日本转基因生物标准物质研制定位明确，要求异常严格，设施配套齐全；着力加强非法释放转基因产品的转基因检测技术方法研制；在转基因生物安全管理上采取关口前移，严进宽出的做法，有许多成功的经验和做法供我们借鉴。现将有关情况报告如下：

一、考察目的

为推进转基因生物新品种培育重大专项《转基因产品检测标准物质研制》课题的研究进程，解决课题研究过程中遇到的难题，根据课题预算书的要求，特组织课题核心技术研究人员赴日进行转基因标准物质研制交流，旨在了解日本转基因产品检测标准物质的研究进展、设备条件和质量控制体系，以及转基因水稻实验室监管体系，探讨转基因生物标准物质研制和应用中的关键技术难点，如标准物质的量值确定、可替代性验证、不确定度分析、配套标准物质应用的转基因产品检测新技术方法等。

二、考察内容

（一）转基因产品检测标准物质研制

11月19日下午，听取了日本农林水产省食品综合研究所Kazumi kitta博士关于标准物质研制、检测方法研制和评价的专题报告，就拷贝数与重量比的换算、原材料的提供等内容进行了交流，实地考察了转基因检测标准物质研制实验室的结构布局。

日本农林水产省下属的食品综合研究所是日本唯一开展转基因植物标准内物质研制的单位。该所配备了一流的专业设备和标准物质研制实施环境，建有专业的转基因标准物质制备实验室。仅仅标准物质的制备实验室就分为五个部分，分别是阴性样品粉碎室、阳性样品粉碎室、标准物质混合式、储存室、称量分装室。每个功能实验室都有严格的环境质量控制措施，例如仪器专用、实验试剂专用、实验服专用、实验人员权限设置等，从而确保标准物质的制备质量。在原材料方面，该所研制标准物质的所需的转基因原材料，均由研发者提供给日本政府，再转给检测机构。

食品综合研究所主要开展基体和质粒标准物质研制工作，基体标准物质一共3种，分别是转基因大豆GTS40-3-2，转基因玉米MON810和GA21；质粒标准物质主要分为2类，分别是转基因大豆和转基因玉米质粒标准物质。在日本，转基因生物标准物质的管理评价体系和我国完全不一样，其研制的标准物质不需要通过专门的管理机构进行评定和审批，但是研制标准物质机构必须具备标准物质制

备和生产的

标准物质分装室示意图

标准物质制备候选物研磨室

资质。同时，食品综合研究所制备的标准物质只在国内进行使用，不对外销售。

基体标准物质的量值确定主要是通过重量法进行确定的，与日本基于重量比的转基因生物标识阈值设定相一致。根据制备时的转基因和转基因植物种子粉末质量进行配制。配制的标准物质质量梯度分别是5%，3%，1%，0.5%,0.1%和0.05%。制备好的标准物质在实际应用时，需要规定相应的定性、定量检测方法。

质粒标准物质中主要包括CaMV35s启动子、NOS终止子、内标准基因、构建特异性序列和转化体特异性序列等。目前，其研制的质粒标准物质一共2种，一种针对转基因大豆GTS40-3-2，另一种同时针对转基因玉米MON810、T25、Bt176、Bt11和GA21。在质粒标准物质研制过程中，食品综合研究所主要构建质粒分子，NIPPON公司负责质粒DNA的纯化和分装，质粒标准物质的均匀性、稳定性等测试主要由食品综合研究所完成。质粒标准物质的量值主要是以质粒DNA的质量和转化因子（Cf，conversion factor）表示的，需要通过多家实验室的实验验证进行确定。

（二）转基因产品检测技术方法研制

11月17-18日，听取了日本国立理化研究所、农林水产省生物资源研究所关于转基因大豆、玉米的定量PCR检测技术方法、检测

技术数据库等专题报告。

日本农林水产省和厚生省各有1个实验室开展转基因生物检测方法的研究，特别是对于非法未知转基因产品的检测方法十分关注。在前几年，他们主要研究新的转基因植物的检测方法，但随着公司提供的检测方法日益完善，日本主要采用公司提供的研究方法，进行验证后采用，上升为国家标准。同时，也将自己研发的一些检测方法上升为ISO标准。

（三）转基因安全管理

11月19日上午，听取了筑波大学基因研究中心Hiroshi kamada主任关于日本转基因生物安全管理报告，就日本转基因生物安全管理法规体系、评价内容、释放后监管等内容进行了交流，实地考察了转基因水稻、桉树的试验温室、网室。11月18日，听取了农林水产省生物资源研究所关于转基因水稻研发的专题报告，就药用转基因水稻的安全管理问题进行了交流。

日本按照卡塔赫纳法规（日本根据卡塔赫纳议定书制定）对转基因生物进行环境安全评价，该法规主要由农林水产省负责实施，厚生省、文部省、环境省、财务省等按照职能分工分别负责相关事宜。评价分两个阶段，第一阶段是隔离条件下的试验，相当于我国的中间试验阶段；第二阶段是开放环境下的栽培，获得批准后可申请用作食品和饲料。评价的内容主要有：转基因生物的生存竞争能力，主要考虑转基因植物对野生植物的竞争性，例如营养、光照、生活环境和对生长的影响；转基因生物产生有害物质对野生植物生长发育的影响；转

基因生物和野生近缘种的基因漂移。第一阶段，目前已审批了用于科学研究的耐盐桉树（2个品种、6个转化事件）和耐紫外光水稻的8个转化事件，用于商业化用途的水稻、大豆、玉米、棉花、康乃馨、玫瑰、杨树、常绿草、甜菜等67个转化事件，转基因微生物3个，转基因动物65个。第二阶段，已审批用于商业化用途的水稻、玉米、大豆、苜蓿等87个转化事件，转基因疫苗2个。日本各个地方也有一些地方法规，有可能造成农林水产省审批环境释放的转基因生物在有些地方不能种植。如截止2010年7月16日，日本已批准了商业化用途但没有商业化种植的转基因作物有3种，分别是大豆、玉米、水稻，包括20个转化事件。

农林水产省和内阁办公室食品安全委员会依据《转基因饲料安全评价指南》和《转基因饲料添加剂安全评价指南》对饲料和饲料添加剂进行安全评价。内阁办公室食品安全委员会实施风险评估,并向农林水产省提供技术建议、与公众进行信息交流;农林水产省负责受理、审批安全评价申请,并向内阁办公室食品安全委员会进行技术咨询、与公众进行信息交流。评价的重点是,与传统对照物相比转基因饲料表达新蛋白对家畜的毒性,以及转基因饲料表达新蛋白在家畜体内变为有害物质的可能性。

厚生省和内阁办公室食品安全委员会依据《转基因食品和食品添加剂安全评价指南》对食品和食品添加剂实施安全评价,评价程序和转基因饲料以及饲料添加剂基本相同。评价内容主要有:受体植物的安全性、外源基因的特性、新表达蛋白的特性、新表达蛋白的安全性、

转基因食品的营养变化和加工过程。目前，已完成了玉米、棉花、油菜、大豆等126个转化事件和7种添加剂的食用安全评价。

（四）转基因水稻研发

11月16日，听取了日本东京大学关于转基因水稻发育调控、基因克隆的专题报告，11月18日，听取了日本农林水产省先端技术研究所吴健忠副主任关于水稻起源的专题报告，并就转基因水稻功能基因组测序、基因克隆、表达等问题进行了交流。

日本在转基因水稻研发方面具有重要地位，特别是功能基因组的研究取得了较大成就。农林水产省农业生物资源研究所是日本主要的转基因水稻研究单位，其主要以药用转基因水稻研究为主，目前在转IL10基因水稻、转CTB基因和过敏源基因水稻方面取得了很好的研究成果，其中转IL10基因水稻将会在１-２年后正式批准进入应用，转CTB基因和过敏源基因水稻也正在１期和２期临床评价阶段。值得注意的是日本将药用或功能性的转基因水稻列为药品类，主要由日本药物及医疗器械管理局（PMDA）负责审批和监管。

三、主要收获

（一）日本转基因生物标准物质研制定位明确，要求异常严格

日本标准物质的研制主要着眼于满足国内转基因生物安全监管的需要，没有将研发的产品用于国际销售。在研制形式，由于质粒标准物质不受季节、地域等环境条件的影响，主要侧重于质粒标准物质的研制。日本标准物质研制无论在实验室布局设计上，还是在研磨、DNA提取等主要实验环节上都异常严格。虽然日本农林水产省食品

综合研究所生产转基因标准物质的场所非常小，仅仅只有不到400平方米，但是其设施水平非常先进，而且所有的软硬件条件都是围绕标准物质生产而展开，从而能够保证生产的标准物质的质量。但是，日本目前研制转基因标准物质种类较少，是否能够完全满足国内转基因生物安全管理需要尚需探讨，且在量值确定方面也有需进一步完善的余地，如对转化因子cf值引入尚有疑问。

（二）转基因生物检测方法研究主要侧重于非法释放转基因生物的筛查

在访问中，我们了解到，日本政府对于已经批准商业化的转基因品种并不继续进行监管，而将工作的重点维持在未批准的转基因品种中。在这些工作中，随时可能发现未获得批准的转基因产品。与已获得批准、有信息的转化事件相比，未获批准的转基因产品可能有更大的潜在危害，但也更难于检测。加强筛查元件检测技术的研究，是日本政府防范非法释放转基因生物的重要技术手段。

（三）转基因生物实验室安全控制十分规范，温室种植管理近于苛刻。

日本制定了比较完善的转基因生物研究和产业化过程的安全管理措施，并严格按照要求进行管理。例如基因生物种植环境隔离要求非常严格，在所有涉及转基因生物研究的空间、仪器和温室都有明确的标识，同时有专门的用于转基因和非转基因生物种植的温室。

日本各个从事转基因生物研究的实验室、研究所和大学都非常严格的遵守本国制定的转基因生物安全管理法规。如东京大学就专门制

定了《东京大学转基因生物使用实施规则》，规定了学校职责任务、安全管理委员会的设置、试验研究项目的审查、教育培训与健康管理、实验室管理措施和应急预案。学校成立专门的委员会协同各学院委员会负责转基因生物研究项目的审查，并制定了与之配套的转基因生物安全控制措施确认申请书和转基因生物国内外转移程序。东京大学农学生命科学院对实施细则进一步细化，制定了《东京大学农学生命科学院转基因生物使用实施规则》。

日本对于转基因生物温室的管理异常严格，有的近于苛刻。在东京大学的转基因水稻实验温室中，不仅每个温室单独隔离设计，而且温室内部设置了缓冲、风淋设施，接近国内P3实验室控制水平。

（四）日本转基因生物安全管理关口前移，严进宽出，侧重于用途管理。

日本对于转基因生物安全的审批，根据转基因生物及其产品的用途是在开放条件还是密闭条件使用，分类管理，其中类型一是指无需采取预防措施的用途（类型二之外），类型二是指需要采取措施预防转基因生物进入密闭设施、设备及其他结构外的空气、水、土壤的用途。对于类型一用途的转基因生物，只要是批准环境释放，政府将不再着重管理；截止2010年7月16日，共有大豆、玉米、油菜、苜蓿、康乃馨、玫瑰、甜菜等7种作物67个转化事件被批准释放。对于类型二用途的转基因生物，截止2010年10月12日，共有1222项被批准，主要是转基因微生物，其他还有转基因植物2项，转基因动物2项。日本具有严格的制度和完善的设施，但仅仅只有6家从

事转基因检测的机构。采取这种管理方式的原因来，主要基于以下考虑：第一，日本政府只允许有资质的机构进行转基因研究，并认为企业从事的任何转基因研究都是商业化行为，必须经政府批准。因此，拉高了转基

转基因水稻独立种植温室

明确标识的转基因研究设备和房间示意图

NAIS转基因植物安全管理体系图

因研究和商业化的门槛，严格控制了从事转基因研究的机构和人员规模，从而也实现了有效控制。第二，日本政府在批准某种转基因作物商业化种植后，不再继续跟踪监管的基础是研制该转基因作物的公司对该转基因作物后续的一切问题负全责。

（五）日本转基因水稻研究注重积累，厚积薄发。

水稻是重要的模式作物，其基因测序工作早已完成。日本是转基因水稻研发较为先进的国家之一。在考察日本东京大学转基因水稻研发的过程中，我们深受震撼的是，多数实验室面积不过60-70平方米，拥挤不堪，多数仪器设备磨损破旧，办公室也是好几个人挤在一起，少有超过20平方米的会客室，但就是在这种条件下，多个实验室曾在《科学》、《自然》等知名期刊上发表过论文。这得益于一是科研成果的长期积累和坚持不懈，如硼的调控因子的研究，从拟南芥到水稻，经历了二三十年的时间；二是得益于研究人员的创新理念，人是科学研究中最具能动性的因子，科研人员的创新理念至关重要。

四、有关建议

（一）完善转基因生物标准物质研制实验室、设备等基础设施

转基因标准物质是从事转基因检测的最基本条件之一，也是最重要的条件之一。标准物质的质和量，决定了相关工作所能达到的水准，离开了标准物质，就不能实现样品的鉴定和定值。因此，在世界范围内，标准物质的研制都是一件非常重要的工作。

在欧洲，从事转基因标准物质研制和生产的机构主要是标准物质与测量技术研究所（Institute of Reference Materials and Measurement，IRMM），在美国对应的机构是美国油脂化学家学会（American Oil Chemists' Society，AOCS），在日本是日本农林水产省食品综合研究所（National Food Research Institute，NFRI）。全世界大部分的转基因检测用标准物质都是由这些机构研制，特别是前两家，而我国则没有专门的转基因检测用标准物质研制生产单位，相关工作分散在全国各地的不同研究所。

随着我国转基因作物研制生产工作的发展，特别是在转基因重大专项启动后，转基因检测工作任务空前加大，对转基因标准物质的需求也前所未有紧迫。但是，我国分散在各地的转基因标准物质研制单位的生产条件与国际水平有非常大的差距。通过这次考察发现，日本从事转基因产品标准物质研制的机构，只有1家，且定位明确，研制要求严格；而我国标准物质研究机构则相对分散，研制机构还没有通过标准物质生产和提供者的资质。由于转基因标准物质需要的量小，相关设施建设成本高，同时在我国建立多家转基因标准物质生产机构也存在困难，也不必要。因此，建议以我国的转基因标准物质研究为契机，建立一个专门的转基因标准物质研制生产机构是我国转基因检测和检测工作的当务之急。

（二）建立适合我国转基因生物安全管理和标识制度的标准物质研制技术体系

在我国的转基因检测工作中，转基因标准物质究竟采用哪种状

态，采用什么样的定值方法，更能符合我国转基因监管的需要，是一个需要认真思考的问题。目前，我们建议质粒标准物质的研制应该着眼于满足国内转基因生物安全监管的需要，特别是定位于非法释放的转基因生物的监管，研制浓度以100%为宜；基体标准物质研制方面，应着眼长远，加强积累，不断完善，特别是量值确定是一个技术难题，需不断探索。经过十一五的攻关，我们在转基因标准物质指标规范方面已经有了初步的探索，并形成了以拷贝数百分比为基数的标准物质定值体系。继续吸收国际同类机构在原材料、量值确定等方面的经验，加快我国的转基因标准物质的研制步伐是当务之急。

转基因标准物质的研制不仅仅是一个设备问题，更是一个方法问题。当前，日本农林水产省食品综合研究所（NFRI）和欧洲标准物质与测量技术研究所（IRMM）、美国油脂化学家学会（AOCS）研制的标准物质具有完全不同的形态和特点。具体而言，日本NFRI则以质粒标准物质为特色，其优点是便于获得和繁殖，最大缺点是质粒标准物质和需要检测的样品的差异太大，绝大多数时候都与基体标准物质不能完全等同。IRMM倾向生产具有不同转基因含量的粉末标准物质，其优点是更接近实际样品的状态，缺点是该标准物质以质量百分比为基础，而应用需要拷贝数百分比，同时转基因与非转基因样品的混合过程也会引入不确定度，造成量值的精确度下降。相比之下，AOCS更倾向生产颗粒状的纯品标准物质或者100%纯的基因组DNA，由于其样品为转基因纯品，其颗粒百分比、质量百分比和拷贝数百分比等同，同时没有进一步的加工过程进入新的不确定性，因

此具有最高的定量精度，但在实际工作中，所需要检测的样品大多以深加工产品的形态出现，AOCS的标准物质与需要检测的样品存在较大差异。

（三）进一步加大非法释放转基因产品检测技术方法的研究

非法释放转基因产品的监督管理，关系到政府公信力，意义重大。日本政府的转基因生物安全管理采取有所为、有所不为的做法，特别重视对非法释放转基因产品的管理，对已经批准环境释放的转基因生物则采取无为方针，基本不管，工作重点放在了批前审查和对非法释放转基因生物的查处上。事实上，经过多年的转基因检测监测工作积累经验，我们已经意识到了非法释放转基因产品的筛查问题，并已开始起草制定相关国家标准。但已有的方法都是基于已知的基因元件进行筛查，而随着转基因研究的发展，使用植物内源元件、无选择标记技术获得的转基因作物越来越多，不断给检测和监测带来挑战。因此，在以后的工作中，建议进一步加大非法释放转基因产品检测技术方法的研究，不断跟踪转基因研究的前沿，发现可供筛选的新的特征序列，并研制新的筛查方法显得尤为重要。

（四）完善制度建设，提高转基因研发门槛

本次考察的所有从事转基因生物研究工作的实验室都有明显的标签，表明是从事遗传转化的场所，并根据所进行的工作，分为P1和P2级实验室；所有种植实验用转基因作物的温室等场合，均明确标明内部在从事转基因植物生产；并严格根据权限控制进入的人员。除制度严格外，日本的转基因研究设施相比国内有较大优势，在我们

参观的所有转基因温室中，基本都维持了50mBar的负压，对转基因研究场所内的空气收集后过滤排出，从而从根本上防止花粉飘逸的问题，在有条件的机构，更备有风淋设备，进一步清除实验人员身体上可能带出去的转基因花粉等。

日本政府只允许有资质的机构进行转基因研究，并认为企业从事的任何转基因研究都是商业化行为，必须经政府批准，从事转基因检测的机构也只有6家。而我国现阶段，仍然缺乏相关的准入规定，造成现在千军万马做转基因的局面。同时，我国商业化种子公司和育种研究机构众多，这些机构中很大一部分也在从事国外转基因品种，甚至是国内还处于试验阶段的转基因作物的育种工作，有些并已参与到转基因重大专项中。这种谁都可以做转基因的局面，一方面是加快推进我国转基因作物研制的切实需要，但另一方面也确实给监管带来了非常大的困难，带来了非法转基因作物流散等风险。而在我国，由于没有严格的准入制度，也就没办法保证转基因作物的研制者和生产商对其所做所为完全负责。因此，后续监管的任务都落到了政府机构头上，甚至责任都要由政府承担，从而极大加剧了相关部门的工作量，进一步影响了政府应该也必须承担的在研究阶段的监管工作。因此，完善我国相关法律法规，加强制度建设，尽早建立相关的责任追究机制十分必要。