人脐血间充质干细胞来源的外泌体_分离鉴定及生物学特性_张娟
中国组织工程研究 第18卷 第37期 2014–09–03出版
Chinese Journal of Tissue Engineering Research September 3, 2014 Vol.18, No.37
ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH
5955www.CRTER
.org
张娟，女，1988年生，河北省玉田县人，汉族，内蒙古医科大学免疫学在读硕士，医师，主要从事干细胞的基础与临床应用研究。
通讯作者：王彩生，硕士，主任医师，内蒙古医科大学研究生学院，内蒙古自治区呼和浩特市 010110；呼和浩特市第二医院，内蒙古自治区呼和浩特市 010031
并列通讯作者：魏来，博士，教授，北京大学人民医院，北京大学肝病研究所，丙型肝炎和肝病免疫治疗北京市重点实验室，北京市 100044
doi:10.3969/j.issn.2095-4344. 2014.37.009 [https://www.360docs.net/doc/3918313850.html,]
中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2014)37-05955-06 稿件接受：2014-07-31
Zhang Juan, Studying for master’s degree, Physician, Faculty of Graduate Studies, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, Inner Mongolia Autonomous Region, China
Corresponding author: Wang Cai-sheng, Master, Chief physician, Faculty of Graduate Studies, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, Inner Mongolia Autonomous Region, China; the Second Hospital of Hohhot City, Hohhot 010031, Inner Mongolia Autonomous Region, China
Corresponding author: Wei Lai, M.D., Professor, Peking University People’s Hospital, Peking University Hepatology Institute, Beijing Key Laboratory of Hepatitis C and Immunotherapy for Liver Diseases, Beijing 100044, China
Accepted: 2014-07-31
人脐血间充质干细胞来源的外泌体：分离鉴定及生物学特性
张 娟1，刘 峰2，张 薇2，丛 旭2，王彩生1，
3，魏 来2(1内蒙古医科大学研究生学院，内蒙古自治区呼和浩特市 010110；2北京大
学人民医院，北京大学肝病研究所，丙型肝炎和肝病免疫治疗北京市重点实验室，北京市 100044；3呼和浩特市第二医院，内蒙古自治区呼和浩特市 010031)
文章亮点：
1 研究发现间充质干细胞是通过旁分泌有效生物学活性物质外泌体在细胞间进行信息传递，进而通过某种机制发挥组织损伤修复作用。外泌体是间充质干细胞分泌的膜性小囊泡，含有来源细胞的膜蛋白成分，可以选择性地将含有的蛋白质、RNA 等递送至受体细胞，调节细胞间的信号传导。故可将间充质干细胞来源的外泌体开发成为一种既具有间充质干细胞的作用特点，又能规避其不良分化和肿瘤形成缺陷的新型治疗手段。因此，通过间充质干细胞来源的外泌体促进组织损伤修复是今后具有重要探讨价值的研究方向。
2 分离提取及鉴定外泌体是进行深入研究的基础，实验主要通过超滤及差速离心法分离出外泌体，通过透射电镜及流式鉴定相结合来鉴定，为后续的外泌体功能研究奠定基础。
3偏倚或不足：人脐血间充质干细胞源性外泌体生物学功能及相关机制还需要进一步分析；人脐血间充质干细胞的外泌体最终要移入体内研究，所以尚需建立动物模型。 关键词：
干细胞；脐带脐血干细胞；外泌体；人脐血间充质干细胞；分离鉴定；活性 主题词：
胎血；间质干细胞；外泌体；膜蛋白质类
摘要
背景：外泌体是间充质干细胞分泌的膜性小囊泡，越来越多的研究表明，间充质干细胞可能通过旁分泌外泌体而发挥对组织损伤的修复作用，目前人脐血间充质干细胞来源的外泌体分离鉴定尚未见报道。 目的：分离纯化人脐血间充质干细胞来源的外泌体，并鉴定其生物学特性。
方法：收集人脐血间充质干细胞培养上清，采用超滤及梯度离心法分离并纯化外泌体，通过透射电镜观察其形态，流式细胞术检测其表面标志 CD63、CD81、CD90、CD73、CD105、CD29、CD166。 结果与结论：人脐血来源的间充质干细胞能够分泌外泌体，电镜下呈椭圆或碟状的囊泡结构，直径40-100 nm 。外泌体表达其共性表达标志CD63、CD81及间充质干细胞表面黏附分子CD90、CD73、CD105、CD29、CD166。结果表明采用超滤及梯度离心法可以成功从间充质干细胞培养上清中分离纯化外泌体，间充质干细胞分泌的外泌体具有外泌体的胞膜蛋白组分。
张娟，刘峰，张薇，丛旭，王彩生，魏来. 人脐血间充质干细胞来源的外泌体：分离鉴定及生物学特性[J].中国组织工程研究，2014，18(37):5955-5960.
Exosomes derived from human umbilical cord blood mesenchymal stem cells: isolation, identification and biological characteristics
Zhang Juan 1, Liu Feng 2, Zhang Wei 2, Cong Xu 2, Wang Cai-sheng 1, 3, Wei Lai 2 (1Faculty of Graduate Studies, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, Inner Mongolia Autonomous Region, China; 2
Peking University People’s Hospital, Peking University Hepatology Institute, Beijing Key Laboratory of Hepatitis C and Immunotherapy for Liver Diseases, Beijing 100044, China; 3the Second Hospital of Hohhot City, Hohhot 010031, Inner Mongolia Autonomous Region, China)
Abstract
BACKGROUND: Exosomes are membrane vesicles secreted by mesenchymal stem cells. Increasing studies have shown that mesenchymal stem cells can secrete exosomes via paracrine function to play a role in tissue injury. However, reports on how to isolate and identify exosomes derived from human umbilical cord blood mesenchymal stem cells are few.
OBJECTIVE: To extract, purify and identify exosomes derived from human umbilical cord blood mesenchymal stem cells.
METHODS: The cell culture supernatant of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells was collected. Exosome was extracted and purified with ultrafiltration and gradient centrifugation methods. The morphology of exosome was observed by transmission electronic microscope, and the expressions of CD63, CD81, CD90,
CD73, CD105, CD29, and CD166 in exosome of mesenchymal stem cells were analyzed by fluorescent activated cell sorting.
RESULTS AND CONCLUSION: Mesenchymal stem cells from human umbilical cord blood secreted exosome
which exhibited elliptic or saucer-like shape and its diameter ranged from 40 to 100 nm with membrane structure. Exosome could express the common surface adhesion molecules CD63, CD81 and the surface adhesion molecules CD90, CD73, CD105, CD29, CD166 of mesenchymal stem cells. These findings indicate that exosome may be secreted by mesenchymal stem cells of human umbilical cord blood, which contains plasma membrane proteins of umbilical cord blood mesenchymal stem cells.
Subject headings: fetal blood; mesenchymal stem cells; exosomes; membrane proteins
Zhang J, Liu F, Zhang W, Cong X, Wang CS, Wei L. Exosomes derived from human umbilical cord blood mesenchymal stem cells: isolation, identification and biological characteristics. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2014;18(37): 5955-5960.
0 引言 Introduction
干细胞是一类具有自我复制能力和多向分化潜能特性的细胞，可以作为治疗性克隆的研究与治疗资源，并用于糖尿病、帕金森病和心脑血管病等复杂人类疾病模型的研究，成为了世界上最受人瞩目的前沿科技领域之一。干细胞按其发生学来源可分为胚胎干细胞和成体干细胞，胚胎干细胞来源于早期胚胎内细胞团，具有全能性，但存在伦理学争议及取材困难等问题，在研究方面受到一定限制；成体干细胞是指已分化组织中的未分化细胞，包括造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、皮肤干细胞等。目前中国对成体干细胞的研究较为广泛，尤其是对间充质干细胞的研究。
间充质干细胞是一群中胚层来源的具有多向分化潜能的多能干细胞，现阶段已经证明间充质干细胞存在于骨髓、肝脏、脾脏、成人和老年人的骨骼肌、外周血、脂肪、韧带、胎盘、脐带、脐血、皮肤等组织中[1]。人脐血间充质干细胞是一类来源于脐血，具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，这类细胞与其他来源的间充质干细胞相比，具有来源丰富，易于采集和运输，增殖能力强，移植后无异体排斥反应、不涉及伦理问题等诸多优点，近年来逐渐成为倍受关注的成体干细胞。目前研究显示，人脐血间充质干细胞可作为多种疾病治疗的细胞来源，修复组织损伤[2-3]，但是长期移植入体内后，存在着不良分化或致瘤的缺点[4]，限制了其在临床广泛应用。
外泌体(exosomes)是一种由真核细胞的多泡内涵体(multivesicular bodies，MVBs)与细胞膜融合后释放到细胞外环境中的纳米量级的膜性小囊泡，可由多种类型细胞分泌，其内含有不同种类的蛋白质、脂质、mRNAs、microRNAs、信号分子等具有生物学活性的物质，较易与邻近细胞的细胞膜发生融合，将生物学活性物质选择性地递送至受体细胞，在不同细胞间进行信息传递，调节细胞间的信号传导，发挥多种生物学功能[5-6]。有文献报道，移植间充质干细胞能够通过旁分泌有效生物学活性物质-外泌体，从而在组织损伤中起到修复效果[7-9]。因此，若能深入研究人脐血间充质干细胞来源的外泌体的功能，将其开发成为一种既具有间充质干细胞特点而又能克服其缺陷的新型治疗方式，是今后具有重要探讨价值的研究方向。
为此，本研究提取人脐血间充质干细胞来源的外泌体，并通过透射电镜和流式细胞术鉴定外泌体的特点，旨在为进一步研究人脐血间充质干细胞来源的的外泌体在组织损伤修复中的生物学功能和相关机制提供实验基础。
1 材料和方法 Materials and methods
设计：细胞学体外实验。
时间及地点：于2013年9月至2014年4月在北京大学人民医院肝病研究所完成。
材料：
脐血：取自北京大学人民医院产科足月剖腹产或足月正常产健康产妇，产妇平均年龄(28±5)岁，均经当事人知情同意并签订协议书。实验经医院伦理委员会同意，符合医学伦理学标准。
实验方法：
人脐血间充质干细胞原代分离培养：参考文献方法提取人脐血间充质干细胞[10-12]，无菌条件下采集(60±20) mL 脐静脉血到一次性无菌塑料采血袋中，于采集后12 h内进行脐血单个核细胞分离。将脐血按1∶1比例沿管壁缓慢加入含有Ficoll-Paque分离液上层，尽可能保持界面清晰，进人脐血间充质干细胞来源的外泌体分离鉴定及生物学特性检测试剂与仪器： 试剂及仪器 来源
Ficoll-Paque分离液美国GE Healthcare公司
间充质干细胞培养基美国ScienCell公司
BCA蛋白定量试剂盒美国Pierce公司
0.05%Trypsin-EDTA 美国Gibcol公司
PE标记小鼠抗人 CD166、CD44、
CD73、CD90、CD81、CD63；FITC标
记小鼠抗人CD29、CD45；APC标记小
鼠抗人CD73、CD105、CD34、CD90
美国Ebioscience公司
ND-2000 超微量紫外可见分光光度计美国Therom公司
5810R台式高速冷冻离心机德国Eppendorf公司
HITACHI 55P-72超速冷冻离心机日本HITACHI公司
流式细胞仪美国BD公司
二氧化碳孵育箱美国Forma scientific公司OLYMPUS-IX71倒置显微镜日本Olympus公司
透射电子显微镜德国Leica公司
分离磁珠Exosome-Human CD63 美国Invitrogen公司
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行梯度离心，1 900 r/min离心30 min，离心后液体分为4层，从上到下依次为血浆层、单个核细胞层、Ficoll层、红细胞层，小心缓慢吸取中间界面层白色云雾状或团状单个核细胞层到PBS中，1 600 r/min，低温离心15 min，然后加于PBS重悬，1 200 r/min，低温离心8 min，按此操作重复2次，计数单个核细胞的数量，将单个核细胞以1×106/cm2的密度接种于25 cm2的培养瓶中。
人脐血间充质干细胞的培养、纯化及传代：将细胞培养瓶置于37 ℃，体积分数为5%CO2饱和湿度孵育箱中培养，72 h首次全量换液，以后每隔三四天换液。换液用间充质干细胞培养基。倒置显微镜下观察细胞生长情况及形态变化，待细胞长至培养瓶底80%-90%面积时，用0.05%胰酶常规进行细胞消化，传代培养。
人脐血间充质干细胞的形态学观察及鉴定：取第4代人脐血间充质干细胞，用0.05%胰酶消化1.0-2.0 min，待细胞变圆加入血清培养基中和胰酶作用，吹打管壁至细胞脱落，制成细胞悬液，以1 200 r/min，离心5 min，使细胞沉淀，PBS冲洗细胞，室温下分别与 CD34、CD45、CD166、CD44、CD105、CD29、CD73、CD90单克隆抗体避光孵育60 min，PBS清洗细胞，洗去未结合抗体，离心，弃去上清液，用同型对照单克隆抗体作为阴性对照组，流式细胞仪检测各标志的表达。
外泌体的分离和纯化：选择增殖能力强、状态好的第3-5代人脐血间充质干细胞，无血清培养48 h后，收集培养上清液30 mL，1 000×g离心15 min除去细胞碎片等，再经0.45 μm无菌滤膜过滤到20 mL规格的超滤离心管中，4 ℃条件下1 000×g离心70 min，得到含外泌体的浓缩液，将浓缩液移至加有200 μL质量浓度为300 g/L蔗糖的超速离心管中，4 ℃条件下，100 000×g离心70 min，收集底部沉淀用PBS稀释后，再次100 000×g离心70 min，洗涤1次，最后将收集的外泌体浓缩液蛋白定量，0.22 μL滤膜过滤除菌，分装，于-80 ℃冷藏备用。
外泌体的形态学观察：取上述PBS悬浮液50 μL，向样品中滴入染色剂醋酸铀水溶液(1%，pH=4.0)，混匀，用移液枪滴加1滴在复膜铜网上，自然干燥后在透射电子显微镜上进行观察，并拍摄电镜照片。
外泌体蛋白质浓度测定：采用BCA蛋白定量试剂盒，ND-2000超微量紫外可见分光光度计检测外泌体总蛋白量。参数：标本 0.1 mL+试剂 2.0 mL；反应时间30 min；反应温度37 ℃；波长为562 nm。
流式细胞术检测人脐血间充质干细胞来源的外泌体表面标志：将20 μL磁珠(CD63)加入到1.5 mL EP管中，混匀，加入200 μL 0.1%BSA溶液冲洗磁珠，将EP管置于磁极上1 min，吸取上清，加入100 μL分离纯化后的外泌体浓缩液，混匀，4 ℃过夜。加入300 μL 0.1%BSA清洗，置于磁极上1 min，吸掉上清，所得悬液与CD81、CD63、CD166、CD90、CD73、CD105、CD29单克隆抗体温育，同时用同型IgG作阴性对照，经流式细胞仪检测。
主要观察指标：①倒置显微镜观察人脐血间充质干细胞形态变化。②流式细胞仪鉴定人脐血间充质干细胞表面相关抗原。③透射电镜观察外泌体形态。④流式细胞仪鉴定外泌体表面相关抗原。
2 结果 Results
2.1 人脐血间充质干细胞的形态学观察用Ficoll-Paque 分离液密度梯度离心后，从脐血中分离出单个核细胞，将之接种于间充质干细胞培养基中，观察发现，原代分离的脐血单个核细胞经过6 h的体外培养后仅有极少量细胞贴壁，早期贴壁的细胞形态异质性较大，以梭形和多角形为主，有的细胞甚至接近圆形，细胞体积较大。72 h首次换液后，细胞呈单层贴壁生长，形态主要为梭形、圆形，梭形细胞呈短纤维状或纺锤形，数量少，分布稀疏。14 d后基本达70%融合。经传代培养后，细胞分布均匀，呈成纤维样细胞形态，四五天后可达80%融合(图1)。
2.2 脐血间充质干细胞表面标记物的表达流式细胞仪检测结果显示，培养的第4代人脐血间充质干细胞均一表达CD166、CD44、CD105、CD29、CD73、CD90，阳性率分别为97.29%、94.54%、9
3.20%、97.77%、98.69%、99.27%，而CD34、CD45呈阴性，阳性率分别为1.86%、2.48%(图2)。
2.3 人脐血间充质干细胞来源的外泌体的形态特征透射电镜下可见一群大小具有较明显异质性，直径介于40-100 nm，呈圆形或椭圆形的膜性小囊泡，囊泡外周可见其膜性结构，中央为低电子密度成分(图3)。
2.4 人脐血间充质干细胞分泌外泌体的含量 30 mL人脐血间充质干细胞无血清培养上清可分离获得约500 mL 外泌体悬液，其蛋白质浓度为(2.50±0.05) g/L。
2.5 人脐血间充质干细胞来源的外泌体表面标记物的表达流式细胞仪检测结果显示，人脐血间充质干细胞来源的外泌体表达外泌体共性标志CD63、CD81，及间充质干细胞的表面黏附分子CD90、CD73、CD105、CD166、CD29(图4)。
3 讨论 Discussion
外泌体最初是Johnstone等[13]在网织红细胞向成熟红细胞分化过程中发现的。早期被认为是网织红细胞在成熟过程中调整膜功能而释放的一些多余的质膜蛋白。随着对外泌体的来源、功能和作用机制进一步的深入研究发现，外泌体并不是简单的细胞残片，而是一种特异性的亚细胞结构。外泌体的主要特性有：①由多种细胞分泌，包括B 细胞[14]、T细胞[15]、树突细胞[16]、上皮细胞[17]、肿瘤细胞[18]、许旺细胞[19]，也存在于血浆、尿液、恶性腹水、唾液，母乳、滑膜液、肺泡灌洗液等多种体液中[20-23]。②电镜下外观为具有双层脂质围绕的碟形小体，直径介于40-100 nm。③
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P .O. Box 10002, Shenyang 110180 https://www.360docs.net/doc/3918313850.html,
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图1 人脐血间充质干细胞形态变化
Figure 1 Morphological changes of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells
图注：A 为人脐血间充质干细胞培养7 d ，呈梭形(倒置显微镜，×200)；B 为人脐血间充质干细胞培养14 d ，排列呈网状、辐射状(倒置显微镜，×100)；C 为第4代人脐血间充质干细胞，细胞分布均匀，呈成纤维样细胞形态(倒置显微镜，×200)。
A B C
图2 第4代人脐血间充质干细胞表面标志物的表达
Figure 2 Surface marker expression of passage 4 human umbilical cord blood mesenchymal stem cells
图注：培养的第4代人脐血间充质干细胞均一表达CD166、CD44、CD105、CD29、CD73、CD90，而CD34、CD45呈阴性表达。 图4 流式细胞仪检测外泌体表面标志物的表达 Figure 4 Surface marker expression of exosome
图注：人脐血间充质干细胞来源的外泌体表达外泌体共性标志CD63、CD81，及间充质干细胞的表面黏附分子CD90、CD73、CD105、CD166、
CD29。
具有来源细胞的胞质和脂质胞膜成分。④可通过蔗糖梯度密
度超速离心获得，在30%蔗糖溶液中密度梯度离心时，外泌
体以脂质囊形式漂浮在1.13-1.19 g/mL密度层之间[24]。⑤典
型的外泌体膜蛋白主要有 CD63、CD81，MFGE8，GAPDH
以及热休克蛋白，不同细胞来源的外泌体含有其来源细胞
关键的蛋白标记物[25-27]，例如源于网织红细胞的外泌体富
含转铁蛋白受体，源于抗原提呈细胞的外泌体含有主要组
织相容性复合体Ⅰ、Ⅱ类分子及其共刺激分子，肿瘤细胞
自身分泌的外泌体表面富含主要组织相容性复合体分子，
伴侣分子热休克蛋白和肿瘤相关抗原。
本实验首先通过密度梯度离心法分离出人脐血间充质
干细胞，表面抗原鉴定结果显示，阴性表达造血细胞系
CD34，CD45，阳性表达间充质干细胞特征性标志CD44，
CD105。因此认为以上方式提取到的细胞为人脐血间充质干
细胞。采用超滤及梯度离心法分离纯化得到人脐血间充质干
细胞分泌的外泌体，透射电镜对其形态学观察可以发现，其
为圆形或椭圆形膜性小囊泡，直径介于在40-100 nm，有
完整的包膜结构。流式细胞术检测显示，外泌体表面共性
表达标志CD63、CD81为阳性，说明此实验分离得到间充
质干细胞来源外泌体，其表面CD90、CD73、CD105、
CD166、CD29均为阳性，表明其含有间充质干细胞的膜
表面标志，提示本方法分离的人脐血间充质干细胞来源的
外泌体含有其来源间充质干细胞的成分及特征。
间充质干细胞已被证实具有明确的组织再生修复作用
以及潜在的免疫调节调控细胞生长分化等功能[28-31]，但是
间充质干细胞长期移植入体内，存在着异常分化及肿瘤形
成等问题[32]，这促使学者寻求新的治疗途径。研究发现间
充质干细胞是通过旁分泌有效生物学活性物质外泌体在细
胞间进行信息传递，进而通过某种机制发挥组织损伤修复
作用。间充质干细胞来源的外泌体与间充质干细胞相比，
具有易于保存，避免细胞复苏等优点，同时也克服了间充
质干细胞移植后异常分化及肿瘤的问题，故可将间充质干
细胞来源的外泌体开发成为一种既具有间充质干细胞作用
特点而又能规避其缺陷的新型治疗手段。
2010年Camussia等[33]研究发现，间充质干细胞可通
过微泡介导的基因信息从而起到修复肾损伤的作用。Lai
等[34]研究发现骨髓间充质干细胞来源的外泌体能改善心肌
缺血再灌注损伤，减小梗死心肌的范围[35]，胚胎干细胞分
泌的外泌体可以缩小猪缺血再灌注模型中心肌梗死的范
围，改善心功能[36]。2013年，研究人员发现脐带间充质干
细胞来源的外泌体可以修复肝脏纤维化，恢复肝功能[7]。
目前，对人脐血间充质干细胞来源的外泌体的研究尚无相
关报道。脐血间充质干细胞较脐带、骨髓、脂肪等来源的
间充质干细胞易取材、分化能力更强、免疫原性低，对供
者无影响，避免伦理争议等优势[37-38]，所以深入研究人脐
血间充质干细胞来源的外泌体，有望能取代间充质干细胞
在组织损伤修复中发挥重要作用。
实验通过简单实用的方法分离出人脐血间充质干细胞
来源的外泌体。后续实验将进一步探讨外泌体在组织损伤
修复中的的生物学功能及相关机制，从而为外泌体在临床
医学等方面的应用提供有力的理论依据。
作者贡献：实验设计为刘峰、王彩生、魏来，实验实施为张
娟、刘峰，实验评估为其他作者共同完成，资料收集为张娟。张
娟成文，刘峰审校，所有作者对文章负责。
利益冲突：文章及内容不涉及相关利益冲突。
伦理要求：脐血取自北京大学人民医院产科足月剖腹产或足
月正常产健康产妇，均经当事人知情同意并签订协议书。实验经
医院伦理委员会同意，符合医学伦理学标准。
学术术语：外泌体(exosome)-活细胞吞噬异源物质后，在细
胞内形成内吞泡，其中一部分内吞泡可以与溶酶体结合而降解，
另一部分则在相关刺激因子的作用下，以出芽的方式向内凹陷，
形成一个膜包围的结构，内含多个小囊泡，称其为多泡内涵体
(multivesicular bodies，MVBs)，小囊泡里主要成分是细胞质，
由脂质双分子层包绕。多泡内涵体泡膜最终与细胞膜融合，通过
胞吐作用释放其中的小囊泡至泡外空间，即成exosome。
图3 透射电镜下脐血间充质干细胞来源的外泌体形态
Figure 3 Characterization of exosome from umbilical cord blood mesenchymal stem cells under transmission electron microscope
图注：透射电镜下可见一群大小具有较明显异质性，直径介于40-100 nm，呈圆形或椭圆形的膜性小囊泡，囊泡外周可见其膜性结构，中央为低电子密度成分。A图标尺为100 nm，B图标尺为200 nm，C图标尺为500 nm。
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作者声明：文章为原创作品，无抄袭剽窃，无泄密及署名和专利争议，内容及数据真实，文责自负。
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脐带干细胞综述
脐带间充质干细胞的研究进展 间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC S ）是来源于发育早期中胚层 的一类多能干细胞[1-5]，MSC S 由于它的自我更新和多项分化潜能，而具有巨大的 治疗价值 ,日益受到关注。MSC S 有以下特点：(1)多向分化潜能，在适当的诱导条件下可分化为肌细胞[2]、成骨细胞[3、4]、脂肪细胞、神经细胞[9]、肝细胞[6]、心肌细胞[10]和表皮细胞[11, 12]；(2)通过分泌可溶性因子和转分化促进创面愈合；(3) 免疫调控功能，骨髓源（bone marrow ）MSC S 表达MHC-I类分子，不表达MHC-II 类分子，不表达CD80、CD86、CD40等协同刺激分子，体外抑制混合淋巴细胞反应，体内诱导免疫耐受[11, 15]，在预防和治疗移植物抗宿主病、诱导器官移植免疫耐受等领域有较好的应用前景；(4)连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于组织工程和细胞替代治疗。1974年Friedenstein [16] 首先证明了骨髓中存在MSC S ，以后的研究证明MSC S 不仅存在于骨髓中，也存在 于其他一些组织与器官的间质中：如外周血[17]，脐血[5]，松质骨[1, 18]，脂肪组织[1]，滑膜[18]和脐带。在所有这些来源中，脐血(umbilical cord blood)和脐带(umbilical cord)是MSC S 最理想的来源，因为它们可以通过非侵入性手段容易获 得，并且病毒污染的风险低，还可冷冻保存后行自体移植。然而，脐血MSC的培养成功率不高[19, 23-24]，Shetty 的研究认为只有6%，而脐带MSC的培养成功率可 达100%[25]。另外从脐血中分离MSC S ，就浪费了其中的造血干/祖细胞(hematopoietic stem cells/hematopoietic progenitor cells,HSCs/HPCs) [26, 27]，因此，脐带MSC S (umbilical cord mesenchymal stem cells, UC-MSC S )就成 为重要来源。 一．概述 人脐带约40 g, 它的长度约60–65 cm, 足月脐带的平均直径约1.5 cm[28, 29]。脐带被覆着鳞状上皮，叫脐带上皮，是单层或复层结构，这层上皮由羊膜延续过来[30, 31]。脐带的内部是两根动脉和一根静脉，血管之间是粘液样的结缔组织，叫做沃顿胶质，充当血管外膜的功能。脐带中无毛细血管和淋巴系统。沃顿胶质的网状系统是糖蛋白微纤维和胶原纤维。沃顿胶质中最多的葡萄糖胺聚糖是透明质酸，它是包绕在成纤维样细胞和胶原纤维周围的并维持脐带形状的水合凝胶，使脐带免受挤压。沃顿胶质的基质细胞是成纤维样细胞[32]，这种中间丝蛋白表达于间充质来源的细胞如成纤维细胞的，而不表达于平滑肌细胞。共表达波形蛋白和索蛋白提示这些细胞本质上肌纤维母细胞。 脐带基质细胞也是一种具有多能干细胞特点的细胞，具有多项分化潜能，其 形态和生物学特点与骨髓源性MSC S 相似[5, 20, 21, 38, 46]，但脐带MSC S 更原始，是介 于成体干细胞和胚胎干细胞之间的一种干细胞，表达Oct-4, Sox-2和Nanog等多
脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定
脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定 【摘要】目的分离培养脐带血间充质干细胞并检测其生物学特性。方法在无菌条件下用密度梯度离心的方法获得脐血单个核细胞，接种含10%胎牛血清的DMEM培养基中。单个核细胞行贴壁培养后，进行细胞形态学观察，绘制细胞生长曲线，分析细胞周期，检测细胞表面抗原。结果采用Percoll(1.073 g/mL)分离的脐血间充质干细胞大小较为均匀，梭形或星形的成纤维细胞样细胞。细胞生长曲线测定表明接后第5天细胞进入指数增生期，至第9天后数量减少;流式细胞检测表明50%～70%细胞为CD29和CD45阳性。结论体外分离培养脐血间充质干细胞生长稳定，可作为组织工程的种子细胞。 【关键词】脐血;间充质干细胞;细胞周期;免疫细胞化学 Abstract: Objective Isolation and cultivation of mesenchymal stem cells (MSCs) in human umbilical cord in vitro, and determine their biological properties. Methods The mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation from human umbilical cord blood in sterile condition, and cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum. After the adherent mononuclear cells were obtained, the shape of cells were observed by microscope, then the cell growth curve, the cell cycle and the cell surface antigens were obtained by immunocytochemistry and flow cytometry methods. Results MSCs obtained by Percoll (1.073 g/mL) were similar in size, spindle-shaped or star-shaped fibroblasts-liked cells. Cell growth curve analysis indicated that MSCs were in the exponential stage after 5d and in the stationary stages after 9d. Flow cytometry analysis showed that the CD29 and CD44 positive cells were about 50%～70%. Conclusions The human umbilical cord derived mesenchymal stem cells were grown stably in vitro and can be used as the seed-cells in tissue engineering. Key words:human umbilical cord blood; mesenchymal stem cells; cell cycle; immunocytochemistry 间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)在一定条件下具有多向分化的潜能，是组织工程研究中重要的种子细胞来源。寻找来源丰富并不受伦理学制约的间充质干细胞成为近年来的研究热点[1]。脐血(umbilical cord blood, UCB)在胚胎娩出后，与胎盘一起存在的医疗废物。与骨髓相比，UCB来源更丰富，取材方便，具有肿瘤和微生物污染机会少等优点。有人认为脐血中也存在间充质干细胞(Umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells，UCB-MSCs)。如果从脐血中培养出MSCs，与胚胎干细胞相比，应用和研究则不受伦理的制约，蕴藏着巨大的临床应用价值[2,3]。本研究将探讨人UCB-MSCs体外培养的方法、细胞的生长曲线、增殖周期和细胞表面标志等方面，分析UCB-MSCs 作为间充质干细胞来源的可行性。
脐带间充质干细胞综述(转)
脐带间充质干细胞概述 医学实验班70080103 王雪彤 脐带是胎儿时期连接母体与胎儿的索状结构,其外被羊膜,内含2条脐动脉、1条脐静脉,在动静脉之间含有特殊的胚胎粘液样结缔组织———华尔通氏胶(Whartonps Jelly) ,从华尔通氏胶分离得到的基质细胞即为人脐带间充质干细胞(HUMSCs) 。 1人脐带间充质干细胞(HUMSCs) 的形貌分析: 倒置显微镜下观察人脐带间充质干细胞贴壁生长, 为形态相对均一的梭形细胞,呈平行排列生长或旋涡状生长,低密度时较扁平, 密度增加趋于融合时细胞变细长。扫描电镜下观察呈长条状纤维样, 细胞膜表面不光滑, 有小结节状物, 细胞无明显突起,细胞间无网络状连接。透射电镜观察核大, 不规则, 核仁明显, 常染色质多, 异染色质少, 胞浆少。胞质内细胞器较少, 以粗面内质网和线粒体为主, 内有大量游离核糖体, 部分细胞可见内质网肿胀。 ——植块法培养获得的人脐带间充质干细胞(×200) 例如三代细胞的形态学特征——人体脐带间充质干细胞离体培养后，培养至第三代。第三代人脐带间充质干细胞以均一长梭形的细胞为主，细胞周边有较多的丝状伪足，见图1，2；并形成毗邻细胞之间的网状连接，见图3；细胞核较大，核膜清晰，含两三个核仁，核质比较小，见图4。 图1图
2图3 图4 2人脐带间充质干细胞(HUMSCs) 的生物学特性： HUMSCs既非胚胎干细胞又非成体干细胞,是别于两者之间的一类新的多能间充质细胞,它们之间既有联系又有差异。根据国际细胞疗法间充质与组织干细胞委员会( the Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the Internation2 al Society for Cellular Therapy)制定的最低标准, 脐带间充质干细胞（MSCs）需满足以下条件: 1)MSCs在标准培养条件下呈贴壁生长; 2 )MSCs表达CD105, CD73和CD90,不表达CD45, CD34, CD14或CD11b, CD79a或CD19和HLA2DR; 3)MSCs在体外至少能向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化。和其他来源的 MSCs一样HUMSCs呈长条梭形贴壁生长,表达CD73、CD90、CD105、CD166、CD10、CD13、CD29、CD44 及HLA2ABC ,不表达CD34、CD45、CD31等造血干细胞标记或CD33、CD14、CD56及HLA2DR、2DA、2DP、2DQ ,体外诱导培养能向多种成体细胞分化。比照这些条件,表明华尔通氏胶来源的间质细胞具有MSCs特性。HUMSCs还表达原始干细胞标记,如白血病抑制因子受体通路、胚胎干细胞特异基因Ⅰ及端粒逆转录酶及Nanog、STAT3、AP、Oct24、BMP4、PAX6、ADAM12、Nestin、HLA2Ⅰ。另外, HUMSCs低表达移植相关的细胞表面标记CD80、CD86、CD40 和CD40 l等。在混合淋巴细胞检测中呈免疫抑制,并抑制T细胞的增殖,异体移植该细胞可产生免疫耐受性,表明其为一类免疫缺陷细胞,异基因移植不会发生免疫排斥反应。 3脐带间充质干细胞(UMSCs)的移植治疗作用: 骨髓MSCs用于改善心、脑功能的机制主要在于其分泌SDF一1和VEGF 等局部细胞因子, 诱导微血管的生成, 改善缺血组织微环境。UMSCs表达SDF 一1和VEGF, 提示了UMSCs治疗心脑梗塞、脊髓损伤的可能。 1)UMSCs对脑损伤的治疗作用 外源性UMSCs对脑组织的修复机理可能涉及到诱导内源性VEGF表达, 局部微血管增生, 抑制细胞凋亡等。利用液压冲击脑损伤模型, 证明
脐带血造血干细胞库管理办法(试行)
脐带血造血干细胞库管理办法（试行） 第一章总则 第一条为合理利用我国脐带血造血干细胞资源，促进脐带血造血干细胞移植高新技术的发展，确保脐带血 造血干细胞应用的安全性和有效性，特制定本管理办法。 第二条脐带血造血干细胞库是指以人体造血干细胞移植为目的，具有采集、处理、保存和提供造血干细胞 的能力，并具有相当研究实力的特殊血站。 任何单位和个人不得以营利为目的进行脐带血采供活动。 第三条本办法所指脐带血为与孕妇和新生儿血容量和血循环无关的，由新生儿脐带扎断后的远端所采集的 胎盘血。 第四条对脐带血造血干细胞库实行全国统一规划，统一布局，统一标准，统一规范和统一管理制度。 第二章设置审批 第五条国务院卫生行政部门根据我国人口分布、卫生资源、临床造血干细胞移植需要等实际情况，制订我 国脐带血造血干细胞库设置的总体布局和发展规划。 第六条脐带血造血干细胞库的设置必须经国务院卫生行政部门批准。 第七条国务院卫生行政部门成立由有关方面专家组成的脐带血造血干细胞库专家委员会（以下简称专家委
员会），负责对脐带血造血干细胞库设置的申请、验收和考评提出论证意见。专家委员会负责制订脐带血 造血干细胞库建设、操作、运行等技术标准。 第八条脐带血造血干细胞库设置的申请者除符合国家规划和布局要求，具备设置一般血站基本条件之外， 还需具备下列条件： （一）具有基本的血液学研究基础和造血干细胞研究能力； （二）具有符合储存不低于1 万份脐带血的高清洁度的空间和冷冻设备的设计规划； （三）具有血细胞生物学、HLA 配型、相关病原体检测、遗传学和冷冻生物学、专供脐带血处理等符合GMP、 GLP 标准的实验室、资料保存室； （四）具有流式细胞仪、程控冷冻仪、PCR 仪和细胞冷冻及相关检测及计算机网络管理等仪器设备； （五）具有独立开展实验血液学、免疫学、造血细胞培养、检测、HLA 配型、病原体检测、冷冻生物学、 管理、质量控制和监测、仪器操作、资料保管和共享等方面的技术、管理和服务人员； （六）具有安全可靠的脐带血来源保证； （七）具备多渠道筹集建设资金运转经费的能力。 第九条设置脐带血造血干细胞库应向所在地省级卫生行政部门提交设置可行性研究报告，内容包括：
脐带血间充质干细胞体外分离_纯化及培养
脐带血间充质干细胞体外分离、纯化及培养 陈 镭1,惠国桢2,栾文忠1,苗宗宁3,王 玲3,陆 华3,吴智远2,芦 奕2 (1.天津医科大学,天津,300070; 2.江苏省无锡市第三人民医院细胞实验室,江苏无锡,214019; 3.苏大学附属第一医院神经外科,江苏苏州,215006) 摘 要:目的 研究脐带血(HUCB)中含有的间充质干细胞(M S Cs)体外分离、纯化及培养条件,探究其作为种子细胞应用于实验和临床的可行性。方法 无菌条件下取正常足月剖腹产的脐带血,经肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,以偏酸性的M esen cult T M 作为培养基进行培养和纯化获得贴壁细胞层,用流式细胞仪检测M SCs 表面抗原。结果 来源于脐血的单个核细胞经体外培养贴壁后出现破骨样及间充质样的细胞,间充质细胞为成纤维样的细胞形态,并表达M SCs 相关的抗原(CD 29、CD 44、CD 166),但不表达造血细胞抗原(CD 34、CD 45),这与源于骨髓的M SCs 一致。结论 脐带血来源的M SCs 能在体外培养、扩增,而用于满足实验和临床的需要。 关键词:脐带血;间充质干细胞;体外培养 中图分类号:R 329 2 文献标识码:A 文章编号:1672 2353(2004)01 0012 03 THE ISOLATION PURIFICATION AND CULTURE OF HUCA MSCs CHEN Lei,HUI Guo zen,RUAN Wen zong,MIAO Zong ning,WANG Ling, LU HUA,W U Zhi yuan,LU Li (1.T ianj in M edical Univer sity ,T ianj in,300070;2.Cell Dep ar tment,T hir d H osp ital of W ux i ,W ux i ,Jiangsu ,2140001;3.Dep ar tment of Neurosur gery ,First A f f iliated H osp ital of Suz hou University ,Suz hou,Jiangsu ,215006) ABSTRAC T Objective:To investig ate the isolation,purification and culture of hum an umbil ical cord blood(HUCB)mesenchymal stem cells(M SCs)in vitro,and to observe the feasibility of using M SCs as seed cells in experiment and clinic.Methods:HUCB w ere collected from full term deliveries scheduled for cesarean section,all specimens w as obtained sterilely w ith preservative free heparin,the cord blood mononuclear cell w as isolated by lymphocyte separation medium,and puri fied and culture with M esencult T M medium and acidic environment to produce adherent layer,the surface antig en ex pression of MSCs was detected by flow cytometry.Results:The UCB derived mononuclear cells,when set in culture,gave rise to adherent cells,w hich ex hibited either an osteo clast or mesenchym al like phenoty pe,cells w ith the M SCs displayed a fibroblast like morpholog y and ex pressed several MSCs related antigens (CD 29,CD 44,CD 166),but did not ex press haematopoi etic cells antigens(CD 34,CD 45),which w as identical to human bone marrow derived M SCs.C on clusion:M SCs in H UCB can culture and expand in vitro,which could be regarded as an alternative source of MSCs for experimental and clinical needs. KEY WORDS umbilical cord blood;mesenchymal stem cells;culture in v itro 脐带血(human umbilical cord blood,HUCB)是胎儿出生时脐带内及胎盘近胎儿一侧血管内的 血液,含有丰富的干细胞和祖细胞,其主要包含造血干细胞和间充质干细胞(mesenchy mal stem 收稿日期:2003-12-16 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30271325)、江苏省自然科学基金资助项目(BK2001170)作者简介:陈镭(1965-),男,天津市人,在读博士研究生。 12 实用临床医药杂志 Journal of Clinical M edicine in Practice 2004年第8卷第1期
人脐血间充质干细胞来源的外泌体_分离鉴定及生物学特性_张娟
中国组织工程研究 第18卷 第37期 2014–09–03出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research September 3, 2014 Vol.18, No.37 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 5955www.CRTER .org 张娟，女，1988年生，河北省玉田县人，汉族，内蒙古医科大学免疫学在读硕士，医师，主要从事干细胞的基础与临床应用研究。 通讯作者：王彩生，硕士，主任医师，内蒙古医科大学研究生学院，内蒙古自治区呼和浩特市 010110；呼和浩特市第二医院，内蒙古自治区呼和浩特市 010031 并列通讯作者：魏来，博士，教授，北京大学人民医院，北京大学肝病研究所，丙型肝炎和肝病免疫治疗北京市重点实验室，北京市 100044 doi:10.3969/j.issn.2095-4344. 2014.37.009 [https://www.360docs.net/doc/3918313850.html,] 中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2014)37-05955-06 稿件接受：2014-07-31 Zhang Juan, Studying for master’s degree, Physician, Faculty of Graduate Studies, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, Inner Mongolia Autonomous Region, China Corresponding author: Wang Cai-sheng, Master, Chief physician, Faculty of Graduate Studies, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, Inner Mongolia Autonomous Region, China; the Second Hospital of Hohhot City, Hohhot 010031, Inner Mongolia Autonomous Region, China Corresponding author: Wei Lai, M.D., Professor, Peking University People’s Hospital, Peking University Hepatology Institute, Beijing Key Laboratory of Hepatitis C and Immunotherapy for Liver Diseases, Beijing 100044, China Accepted: 2014-07-31 人脐血间充质干细胞来源的外泌体：分离鉴定及生物学特性 张 娟1，刘 峰2，张 薇2，丛 旭2，王彩生1， 3，魏 来2(1内蒙古医科大学研究生学院，内蒙古自治区呼和浩特市 010110；2北京大 学人民医院，北京大学肝病研究所，丙型肝炎和肝病免疫治疗北京市重点实验室，北京市 100044；3呼和浩特市第二医院，内蒙古自治区呼和浩特市 010031) 文章亮点： 1 研究发现间充质干细胞是通过旁分泌有效生物学活性物质外泌体在细胞间进行信息传递，进而通过某种机制发挥组织损伤修复作用。外泌体是间充质干细胞分泌的膜性小囊泡，含有来源细胞的膜蛋白成分，可以选择性地将含有的蛋白质、RNA 等递送至受体细胞，调节细胞间的信号传导。故可将间充质干细胞来源的外泌体开发成为一种既具有间充质干细胞的作用特点，又能规避其不良分化和肿瘤形成缺陷的新型治疗手段。因此，通过间充质干细胞来源的外泌体促进组织损伤修复是今后具有重要探讨价值的研究方向。 2 分离提取及鉴定外泌体是进行深入研究的基础，实验主要通过超滤及差速离心法分离出外泌体，通过透射电镜及流式鉴定相结合来鉴定，为后续的外泌体功能研究奠定基础。 3偏倚或不足：人脐血间充质干细胞源性外泌体生物学功能及相关机制还需要进一步分析；人脐血间充质干细胞的外泌体最终要移入体内研究，所以尚需建立动物模型。 关键词： 干细胞；脐带脐血干细胞；外泌体；人脐血间充质干细胞；分离鉴定；活性 主题词： 胎血；间质干细胞；外泌体；膜蛋白质类 摘要 背景：外泌体是间充质干细胞分泌的膜性小囊泡，越来越多的研究表明，间充质干细胞可能通过旁分泌外泌体而发挥对组织损伤的修复作用，目前人脐血间充质干细胞来源的外泌体分离鉴定尚未见报道。 目的：分离纯化人脐血间充质干细胞来源的外泌体，并鉴定其生物学特性。 方法：收集人脐血间充质干细胞培养上清，采用超滤及梯度离心法分离并纯化外泌体，通过透射电镜观察其形态，流式细胞术检测其表面标志 CD63、CD81、CD90、CD73、CD105、CD29、CD166。 结果与结论：人脐血来源的间充质干细胞能够分泌外泌体，电镜下呈椭圆或碟状的囊泡结构，直径40-100 nm 。外泌体表达其共性表达标志CD63、CD81及间充质干细胞表面黏附分子CD90、CD73、CD105、CD29、CD166。结果表明采用超滤及梯度离心法可以成功从间充质干细胞培养上清中分离纯化外泌体，间充质干细胞分泌的外泌体具有外泌体的胞膜蛋白组分。 张娟，刘峰，张薇，丛旭，王彩生，魏来. 人脐血间充质干细胞来源的外泌体：分离鉴定及生物学特性[J].中国组织工程研究，2014，18(37):5955-5960. Exosomes derived from human umbilical cord blood mesenchymal stem cells: isolation, identification and biological characteristics Zhang Juan 1, Liu Feng 2, Zhang Wei 2, Cong Xu 2, Wang Cai-sheng 1, 3, Wei Lai 2 (1Faculty of Graduate Studies, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, Inner Mongolia Autonomous Region, China; 2 Peking University People’s Hospital, Peking University Hepatology Institute, Beijing Key Laboratory of Hepatitis C and Immunotherapy for Liver Diseases, Beijing 100044, China; 3the Second Hospital of Hohhot City, Hohhot 010031, Inner Mongolia Autonomous Region, China) Abstract BACKGROUND: Exosomes are membrane vesicles secreted by mesenchymal stem cells. Increasing studies have shown that mesenchymal stem cells can secrete exosomes via paracrine function to play a role in tissue injury. However, reports on how to isolate and identify exosomes derived from human umbilical cord blood mesenchymal stem cells are few. OBJECTIVE: To extract, purify and identify exosomes derived from human umbilical cord blood mesenchymal stem cells. METHODS: The cell culture supernatant of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells was collected. Exosome was extracted and purified with ultrafiltration and gradient centrifugation methods. The morphology of exosome was observed by transmission electronic microscope, and the expressions of CD63, CD81, CD90, CD73, CD105, CD29, and CD166 in exosome of mesenchymal stem cells were analyzed by fluorescent activated cell sorting. RESULTS AND CONCLUSION: Mesenchymal stem cells from human umbilical cord blood secreted exosome
人脐带间充质干细胞操作规范
人脐带间充质干细胞操作规范 一、人脐带间充质干细胞的分离和培养 1. 准备4~5个培养皿，打开放在超净台中，将消毒过的平剪×1，弯剪×2， 有齿镊子×4，放入超净台，紫外照射30 min，通风10 min; 2. 在1#、3#和4#号培养皿倒入25 ml生理盐水，在2#培养皿倒入25 ml酒精; 3. 将盛放脐带的器皿用酒精消毒外表面后放入超净台，用弯嘴钳取出脐带放入1# 培养皿，清洗残留血渍，用第2把弯嘴钳配合挤出脐带血管内的积血; 4. 将脐带 转移至2#培养皿，完全浸泡，计时1 min; 5. 将脐带转移至3#培养皿，用平剪剪成3 cm左右的小段，清洗脐带内的积血(如果积血较多，可再次转入另一加盐水的培养皿); 6. 用有齿镊子分离2根动脉和1根静脉，剥离华尔通氏胶，放入4#培养皿; 7. 将剥离的胶体转移至50 ml离心管中，2000 rpm离心5 min; 8. 弃上清液，将胶 体倒入干净的培养皿中，用小剪刀将其剪成糊状并转移至50 ml离心管中; 9. 以0.5 ml/瓶的量将胶体组织块接种至T75培养瓶，每瓶加入4 ml脐带有 血清培养液(DMEM/F12 + 10% FBS + 1% L-Glutamine + 1% MEM NEAA + 10 ng/ml bFGF)，水平摇晃培养瓶使组织块分布均匀; 10. 第2天观察是否有污染，每3天换一次液，并观察细胞爬出情况(过程中 须注意平稳地拿放培养瓶，避免组织块发生移动); 11. 培养14天左右，倒去上清培养液，加生理盐水(3 ml/瓶)洗涤，用0.25% 胰酶(2 ml/瓶)消化下爬出细胞及组织块，并用上清培养液(1 ml/瓶)终止消化; 12. 收集细胞及组织块悬液，2000 rpm离心5 min; 13. 弃上清液，加入适量生理盐水混匀，用70 μm滤网过滤去除组织块，即 得到P0代脐带间充质干细胞;
脐带间充质干细胞(MSCS)抗衰老的临床实验
脐带间充质干细胞（MSCS）抗衰老的临床实验 作者：Simon Sun Isa Li 【摘要】目的：观察脐带间充质干细胞对人体衰老的影响和安全性，对比观察脐带间充质干细胞对衰老的逆转现象。方法：抽取20名健康人作为志愿者，进行脐带间充质干细胞静脉回输（其中男性6人，女性14人，年龄为50-80岁），实验组10名志愿者进行静脉滴注3个疗程脐带间充质干细胞，对照组滴注生理盐水。实验组和对照组志愿者均为双盲实验，疗程结束后3个月、6个月、12个月的对比观察。结论：治疗组有效率为90%，从外表、内分泌、精神状态、体能、睡眠均表现出有效性。 Abstract: Objective: To observe the effect and safety of umbilical cord mesenchymal stem cells (MSCs) on human aging. Methods: a total of 20 healthy volunteers, of umbilical cord mesenchymal stem cells reinfusion (6 males, 14 females, aged 50-80 years old), the experimental group of 10 volunteers were intravenous infusion of 3 cycles of umbilical cord mesenchymal stem cells, the control group of normal saline drip. The experimental group and the control group were double blind experiment, 3 months after the end of treatment, and the observation of 6 months and 12 months. Conclusion: the effective rate of the treatment group was 90%, which was effective from the appearance, endocrine, mental state, physical fitness and sleep. 对抗衰老延长寿命是人类的梦想，但以往的方法以失败见终，究其原因均是不能针对衰老的根本原因所致。而人类衰老的原因一是衰老的细胞不能被代替，正常的新陈代谢因为干细胞的补充不足所致。随着干细胞和研究的发展，以及进行临床治疗中所带来的抗衰老表现，提示脐带间充质干细胞会对衰老的过程产生正影响，具有良好的市场应用价值。本实验就是采取双盲实验的方法来进行对证，验证MSCS对衰老的逆转影响。 脐带间充质干细胞（Mesnchymal Stem Cells，MSCs）是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应
人脐带源间充质干细胞分离培养方法的改进_李艳琪
中国组织工程研究 第18卷 第10期 2014–03–05出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research March 5, 2014 Vol.18, No.10 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 1609www.CRTER .org 李艳琪，女，1988年生，山东省淄博市人，汉族，天津大学在读硕士，主要从事脐带间充质干细胞分离培养等方面的研究。 通讯作者：靳继德，博士，副研究员，军事医学科学院放射与辐射研究所，北京市 100039 并列通讯作者：吴祖泽，研究员，中国科学院院士，天津大学化工学院制药工程系系统生物工程教育部重点实验室，天津市300072；军事医学科学院放射与辐射研究所，北京市 100039 doi:10.3969/j.issn.2095-4344. 2014.10.021 [https://www.360docs.net/doc/3918313850.html,] 中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2014)10-01609-06 稿件接受：2014-01-18 Li Yan-qi, Studying for master’s degree, Key Laboratory of Systems Bioengineering, Ministry of Education, and Department of Pharmaceutical Engineering, School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China Corresponding author: Jin Ji-de, M.D., Associate investigator, Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 10039, China Corresponding author: Wu Chu-tse, Academician, Investigator, Key Laboratory of Systems Bioengineering, Ministry of Education, and Department of Pharmaceutical Engineering, School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China; Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 10039, China Accepted: 2014-01-18 人脐带源间充质干细胞分离培养方法的改进 李艳琪1，王洪一2，姚 尧2，刘晶晶3，徐 潇2，张 宇2，刘 洋3，吴祖泽1， 4，靳继德4(1天津大学化工学院制药工程系系统生物工程教育部重点实验室，天津市 300072；2解放军沈阳军区总医院，辽宁省沈阳市 110016；3北京工业大学生命科学与生物工程学院，北京市 100022；4军事医学科学院放射与辐射研究所，北京市 100039) 文章亮点： 在脐带干细胞的培养过程中，实验特色性的对传统的组织块贴壁法进行了改进，将传统组织贴壁法中本应丢 弃的组织转移到新的培养瓶中，进行二次贴壁培养，在较短时间内获得更多数量的间充质干细胞。通过二次 贴壁法得到的细胞经流式细胞仪检测符合间充质干细胞的特性，且增殖能力旺盛，具有体外多向分化潜能， 可成为临床研究和应用的细胞来源。 关键词： 干细胞；脐带脐血干细胞；脐带；间充质干细胞；分离培养；二次贴壁 主题词： 干细胞；脐带；间质干细胞；细胞培养技术 摘要 背景：脐带来源的间充质干细胞因其具有高度的自我更新和多向分化潜能，以及取材方便等优点而日益受到 关注。 目的：建立一种改进的人脐带间充质干细胞分离、培养方法，并对其生物学特性进行分析。 方法：无菌条件下获取足月妊娠分娩胎儿脐带，利用改良的组织块贴壁法分离培养脐带间充质干细胞，即将 传统组织贴壁法中本应丢弃的组织转移到新的培养瓶中进行二次贴壁培养，取第3代脐带间充质干细胞进行 生物学特性分析。 结果与结论：组织贴壁后第5-7天可见有梭形细胞从组织块边缘爬出，第10天左右可形成明显的细胞克隆。 将组织块转移到新培养瓶中继续培养，2 d 后即可见有细胞爬出，细胞生长速度较快，5 d 即可形成细胞克隆。 传代后的细胞形态均一，呈成纤维细胞样的长梭形。流式细胞仪检测细胞高表达CD90、CD105，不表达CD34、 CD45、HLA-DR 。细胞增殖能力旺盛，平均倍增时间为50 h 左右，41.24%的细胞处于G 2/S 期。体外可诱导 分化为成骨细胞和脂肪细胞。上述实验结果证明二次贴壁培养出的细胞也具有间充质干细胞的生物学特性， 而且通过这种培养方法获得的原代间充质干细胞数是传统方式培养的2倍。 李艳琪，王洪一，姚尧，刘晶晶，徐潇，张宇，刘洋，吴祖泽，靳继德. 人脐带源间充质干细胞分离培养方法 的改进[J].中国组织工程研究，2014，18(10):1609-1614. An improved method for isolation of human umbilical cord mesenchymal stem cells Li Yan-qi 1, Wang Hong-yi 2, Yao Yao 2, Liu Jing-jing 3, Xu Xiao 2, Zhang Yu 2, Liu Yang 3, Wu Chu-tse 1, 4, Jin Ji-de 4 (1Key Laboratory of Systems Bioengineering, Ministry of Education and Department of Pharmaceutical Engineering, School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China; 2the General Hospital of Shenyang Military Region, Shenyang 110016, Liaoning Province, China; 3College of Life Sciences and Bio-engineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China; 4Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 10039, China) Abstract BACKGROUND: Human umbilical cord mesenchymal stem cells with capabilities for self-renewal and multi-differentiation have attracted widespread attention. OBJECTIVE: To develop an efficient method for isolation and culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells, and to analyze the cell biological features. METHODS: Mesenchymal stem cells were isolated and cultured from human umbilical cord by improved tissue cultivation. Immunophenotype and cell cycle were analyzed by flow cytometry. Growth curve was determined by MTT assay, and differentiation ability was evaluated by in vitro osteogenic and adipogenic induction as well. RESULTS AND CONCLUSION: Some fusiform cells crawled out from human umbilical cord tissues after cultivation for 5 days and formed colonies about 10 days later. When the removed tissues were further cultured, more cells appeared again within 2 days and formed colonies after 5 days. The isolated cells exhibited similar morphology of fibroblast-like shape after passage. Furthermore, the cells expressed CD90, CD105, but were negative for the markers of CD34, CD45, HLA-DR. Population doubling time of the cells calculated from the result of MTT was about 50 hours and cell cycle analysis showed that 41.24% cells were in the G 2/S phrase. Therefore, the isolated cells had a high prolification ability. In addition, the isolated cells could be induced into osteoblasts