流式细胞术
流式细胞术检测淋巴细胞表面标记
一、实验目的
1.了解流式细胞仪的组成、原理及应用：初步了解流式细胞仪的工作元件及基本应用原理；能够认识流式细胞术的应用，特别是常用的一些功能。
2. 熟悉用流式细胞术检测小鼠脾脏T细胞表面标志的基本流程
3. 学习并掌握流式细胞术结果的分析：能够基本看懂结果图，重点掌握“门”和“补偿”两个概念。
二、实验原理
1.流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性（多参数）的技术，同时可以对特定群体加以分选。
特点：可检测的样本种类多样，大小范围较广（0.2~50μm）；检测速度快，分析样本量大（快速、大量）；细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏；采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度10000个细胞(微粒)/秒与统计分析精确性。
2. 流式细胞仪组成及原理
Fluidics (液流系统)——流体动力学聚焦样本形成单细胞流。
鞘液是辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。匀速流动，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。
Optics (光学系统)——激发和收集光信号。
激发系统包括：激光器、透镜和反射镜，将激光聚焦到检测区
收集系统包括：光学镜片和滤光片、光信号检测器
流式细胞仪收集的信号：（1）散射光信号：细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为前向散射光(信号强弱与细胞体积大小成正比)和侧向散射光(检测细胞粒度和细胞内相对复杂性)。FS-SS图可对未染色的活细胞进行分析或分选，但不能分析表面分子（2）荧光信号：荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同；每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管；选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。
Electronics (电子系统)——数据处理系统，扩大信号，将光信号转化为电信号，处理信号并存储于电脑。
3.流式步骤
第一步：用带有不同荧光基团的抗体分别识别并结合细胞上不同抗原（染色）；第二步：带有荧光的细胞一个接一个通过激光；第三步：不同荧光基团有不同发射光谱，荧光染料选择原则：必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发、激发光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范围内、荧光素光谱的重叠应当尽量减少；第四步：复杂的荧光信号被不同分色镜和滤光片分解；第五步：光电倍增管（PMT）将光信号变成电信号；第六步：模数变换器（ADC）进一步将模拟信号变成计算机能处理的数字信号
4.分选基本原理
细胞悬液形成液流柱→压电晶体产生机械振动，流动室振动→液流断裂成液滴→如果为空白液滴，则不充电，弃去；如果为含细胞的液滴，则充电，偏转落入收集器。
5.门指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。根据门的形状又分为线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。
6.由于荧光波长会相互重叠，所以会出现只染了绿色荧光（FITC）的细胞，也会在橘黄色（PE）检测出信号，所以我们需要根据设各种单染管，调整每种荧光阴性群位置，凭观察判断调整补偿多少，使得类似PE与FITC的重叠比较少，
三、实验材料
单个核细胞
抗体：
CD3+ T cell FITC anti-mouse CD3
CD4+ T cell PE anti-mouse CD4
CD8+ T cell APC anti-mouse CD8a
CD3抗体、CD4抗体、CD8抗体按照1：200倍稀释作为工作浓度
吸管、试管、移液器、EP管
四、实验步骤
1.收集细胞：取细胞总数约1x106-5x106脾脏细胞于1.5ml EP 管中（在管盖上标记好组别），1500rpm， 4℃，5min（离心机需预冷）
2.染色：小心用枪吸去上清，用100ul PBS重悬细胞，然后分别加入100ul含荧光抗体的PBS（注意做好标记），混匀，避光，4℃，20-30min。（此时管中抗体为1：400，即0.5μl/200μlPBS）
上机时共需使用五管——1.No stain、2. 三染管、3. 单染CD3、4. 单染CD4、 5. 单染CD8
3.清洗：加500ul PBS，吹打混匀后， 5000rpm， 4℃，5min
4.检测：小心用枪去除上清，再加入500ul PBS吹打混匀，转入流式管，置于冰上，流式细胞仪检测
五、实验数据处理和分析
图一根据细胞大小和折光分类，圈出了所有淋巴细胞，排除细胞碎片和杂质。图二横纵轴均为前向散射光，通过比较纵轴的面积大小，圈出单个细胞，排除粘连的细胞。
图三圈出了表面分子为CD3的细胞，即全部T细胞。图四的Q1区为CD8+CD4-T cell，Q3区为CD4+CD8-T cell，Q4区为CD4-CD8-Tcell，Q2区为CD4+CD8+T cell。
如图可看出，CD4+T cell含量为69.5%，CD8+T cell为21.4%，CD4+/CD8+ 比例约为3.2，查阅得Balb/c小鼠的CD4+/CD8+ 比例约在2-3范围内，所以我认为实验结果属正常情况。
六、思考
T细胞比例在临床检测中的意义？
人体CD4+/CD8+比值正常情况下为1.4-2.0，升高或降低均与疾病相关。
升高——
常见于自身免疫性疾病中，如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、Ⅰ型糖尿病等，此外还可用于监测器官移植的排斥反应，若移植后CD4+/CD8+比值明显升高，则可能发生排异反应。
减小——
CD4+/CD8+比值减小是免疫缺陷病的重要指征。在获得性免疫缺陷综合征（AIDS）患者中，就存在着CD4+细胞数显著减少的现象
此外，CD4+／CD8+比值的严重减小甚至倒置被认为是病毒感染性疾病的重要指征：在水痘、猩红热、麻疹患者中就发现有CD3+、CD4+细胞数减少，CD8+细胞数增多，CD4+/CD8+比值降低。
急性期和复发的传染性单核细胞增多症中也有CD4+／CD8+比值降低的现象，它是由CD8+细胞数增高引起的。
骨髓造血细胞的增殖和分化障碍也可造成CD4+／CD8+比值降低，如在再生障碍性贫血与粒细胞减少症中，患者体内外周血CD4+细胞数减少，导致CD4+／CD8+比值明显下降。
CD4+/CD8+比值与肿瘤也相关：实体瘤患者像消化道癌症、肝癌、乳腺癌患者外周血中都有CD3+、CD4+细胞数降低，CD8+细胞数增多，CD4+／CD8+比值明显降低的现象。
流式细胞术原理及功能介绍
流式细胞术详解 一. 流式细胞术概述 流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术 ,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。 国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)。流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B- D公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能 ,多用于科学研究。 二.流式细胞仪主要技术指标 1．流式细胞仪的分析速度： 一般流式细胞仪每秒检测1000～ 5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。 2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。 3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～０.5μm。 4．流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，,一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。 5．流式细胞仪的分选速度：一般流式细胞仪分选速度＞1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。 三.流式细胞仪主要构造和工作原理 流动室及液流驱动系统 流式细胞仪主要由以下五部分构成:①流动室及液流驱动系统②激光光源及光束形成系统③光学系统④信 号检测与存储、显示、分析系统⑤细胞分选系统。 流动室（Flow Cell或Flow Chamber）是流式细胞仪的核心部件，流动室由石英玻璃制成，单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔,检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相交，在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。流动室里的鞘液流是一种稳定流动，控制鞘液流的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统、压力感受器组成，只要调整好鞘液压力和标本管压力, 鞘液流包绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向，能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而使激光激发的荧光信息准确无误。见图12.1流动室示意图。流动室孔径有60μm、100μm、150μm 、250μm等多种，供研究者选择。小型仪器一般固定装置了一定孔径的流动室。 图12.1流动室示意图(采自Coulter Training Guide) 四. 流式细胞仪主要构造和工作原理 激光光源及光束形成系统
翟中和《细胞生物学》(第4版)配套题库【考研真题精选+章节题库】
翟中和《细胞生物学》（第4版）配套考研真题精选一、选择题 1在英国引起疯牛病的病原体是（）。[中山大学2019研] A．阮病毒 B．RNA病毒 C．立克次体 D．支原体 【答案】A查看答案 【解析】疯牛病，又称为牛海绵状脑病，是动物传染性海绵样脑病中的一种。疯牛病为朊病毒引起的一种亚急性进行性神经系统疾病，通常脑细胞组织出现空泡，星形胶质细胞增生，脑内解剖发现淀粉样蛋白质纤维，并伴随全身症状，以潜伏期长、死亡率高、传染性强为特征。 2SARS病毒是（）。[武汉科技大学2019研] A．DNA病毒 B．RNA病毒 C．类病毒 D．朊病毒 【答案】B查看答案 【解析】A项，常见的DNA病毒有痘病毒科的天花病毒。B项，SARS属正链RNA病毒，流感病毒属负链RNA病毒，HIV属RNA病毒中的反转录病毒。C项，常见的类病毒有马铃薯纺锤块茎病类病毒。D项，引起疯牛病、羊瘙痒病、人克雅氏症的病毒为朊病毒。 3体外培养的成纤维细胞通过（）附着在培养基上。[中山大学2019研]
A．黏合斑 B．黏合带 C．桥粒 D．半桥粒 【答案】A查看答案 【解析】体外培养的成纤维细胞通过黏着斑贴附在培养皿基质上，微丝终止于黏着斑处，这种结构有助于维持细胞在运动过程中的张力以及影响细胞生长的信号传递。 4动物细胞中cAMP的主要生物学功能是活化（）。[中山大学2019研] A．蛋白激酶C B．蛋白激酶A C．蛋白激酶K D．Ca2＋激酶 【答案】B查看答案 【解析】一般认为，真核细胞内几乎所有的cAMP的作用都是通过活化蛋白激酶A，从而使其底物蛋白发生磷酸化而实现的。 5适于观察培养瓶中活细胞的显微镜是（）。[武汉科技大学2019研] A．荧光显微镜 B．相差显微镜 C．倒置显微镜 D．扫描电镜 【答案】C查看答案 【解析】A项，荧光显微镜主要用于细胞内蛋白质、核酸、糖类等组分定性定位的研究中。
流式细胞术
流式细胞术 流式细胞术是一种生物学技术，用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析。 流式细胞术（Flow CytoMetry，FCM）是对悬液中的单细胞或其他生物粒子,通过检测标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量分析和分选的技术。 基本信息 中文名称:流式细胞术 外文名称:Flow Cytometry, FCM 优点:速度快、精度高、准确性好等 作用快速测定细胞或细胞器生物学性质 特点:1.测量速度快；2.可进行多参数测量 最高速度:每秒钟3万个细胞
4.既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。 工作原理 将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。 流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。 这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，也可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。 检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。对于双参数或多参数数据，既可以单独显示每个参数的直方图，也可以选择二维的三点图、等高线图、灰度图或三维立体视图。 细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个超高频电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。 应用范围： 随着对FCM研究的日益深入，其价值已经从科学研究走入了临床应用阶段，在我国临床医学领域里已有着广泛的应用。可用于白血病的分型、肿瘤细胞染色体的异倍性测定，以及免
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流式细胞术临床应用
流式细胞术的临床应用 一、在肿瘤学中的应用 这是FCM在临床医学中应用最早的一个领域。首先需要把实体瘤组织解聚、分散制备成单细胞悬液，用荧光染料(碘化吡啶PI)染色后对细胞的DNA含量进行分析，PI可以与细胞内DNA和RNA结合，采用RNA抑制剂将RNA消化后，通过流式细胞术检测到的与DNA结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。由于细胞周期各时相的DNA含量不同，通常正常细胞的G1 / GO期具有二倍体细胞的DNA含量((2 N)，而G2/ M期具有四倍体细胞的DNA含量((4 N)，而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。因此，通过流式细胞术PI 染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G1 / GO 期，S期和G2/ M期，并可通过特殊软件计算各时相的百分率，DNA含量直接代表细胞的倍体状态，非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关。 1、发现癌前病变，协助肿瘤早期诊断 人体正常组织发生癌变要经过一个由量变到质变的漫长过程，而癌前细胞即处于量变过程中向癌细胞转化阶段。人体正常的体细胞均具有比较稳定的DNA二倍体含量。当人体发生癌变或具有恶性潜能的癌前病变时，在其发生、发展过程中可伴随细胞DNA含量的异常改变，FCM可精确定量DNA含量的改变，作为诊断癌前病变发展至癌变中的一个有价值的标志，能对癌前病变的性质及发展趋势作出估价，有助于癌变的早期诊断。有资料证实，癌前病变的癌变发生率与细胞不典型增生程度有密切关系，增生程度越重，癌变发生率越高。随着细胞不典型增生程度的加重，DNA非整倍体出现率增高，这是癌变的一个重要标志。 2、在肿瘤的诊断、预后判断和治疗中的作用 FCM在肿瘤诊断中的重要作用已经被认可，DNA非整倍体细胞峰的存在可为肿瘤诊断提供有力的依据，FCM分析病理细胞具有速度快、信息量大，敏感度高等优点，已被用在常规工作中。肿瘤细胞DNA倍体分析对病人预后的判断有重要作用，异倍体肿瘤恶性病变的复发率高、转移率高、死亡率也高，而二倍体及近二倍体肿瘤的预后则较好。FCM不仅可对恶性肿瘤DNA含量进行分析，还可根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图的变化去评估疗效，了解细胞动力学变化，对肿瘤化疗具有重要的意义。临床医师可以根据细胞周期各时相的分布情况，依据化疗药物对细胞动力学的干扰理论，设计最佳的治疗方案，从DNA直方图直接地看到瘤细胞的杀伤变化，及时选用有效的药物，对瘤细胞达到最大的杀伤效果。 3、FCM在细胞凋亡和多药耐药基因的研究中的作用 研究如何用药物诱导癌细胞死亡。通过对细胞体积、光散射、DNA含量及特异性抗原基因(如bcl-2, Fas等)测定分析出细胞凋亡情况。如可用Annexin V结合PI或7- AAD双染色法进行细胞凋亡分析。在凋亡的早期阶段，胞浆膜磷脂的不对称性丧失，导致膜内侧磷脂酞丝氨酸(PS)从细胞膜内层暴露于外层，从而可被PS特异的Annexin- V探针所标记。PS转移到细胞膜外不是细胞凋亡特有的，也可发生在细胞坏死中。但在凋亡的早期细胞膜是完整的，而细胞坏死时细胞膜的完整性被破坏。由于碘化丙锭(PI)或7-AAD对细胞膜完整的活细胞和早期凋亡细胞是拒染的，而对膜完整性被破坏的晚期凋亡细胞或坏死细胞可以染色。因此，Annexin- V结合PI或7-AAD进行双染色可以用于检测活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。正常活细胞不会被染色，凋亡细胞可被标记上Annexin-V，坏死和凋亡晚
流式细胞仪细胞分选的操作步骤
细胞分选的简要操作步骤 一、上样前的准备 FACSCalibu可以分选细胞进行培养或功能性研究，而这些研究需要清洁环境以保持分选后细胞不受污染继续培养，因此在样本制备，上机检测分选等过程中需严格按无菌技术操作。 1、应用无菌技术制备下列无菌工作液。 3L 70%乙醇（用无菌蒸馏水配制） 5L无菌蒸馏水 5L无菌PBS 2、在干净的鞘液筒中加入3L 70%乙醇。盖紧盖子，振摇鞘液筒，确保桶内壁被乙醇充分洗 涤。安好鞘液筒。 3、将过滤器短接，否则乙醇将破坏滤膜。。 4、用70%乙醇冲洗收集管接口处，并喷洒进样口处的空气。 5、在收集管接口处安装2支BD 50ml收集管（若不使用浓缩器）。 6、放上一支装有70 %乙醇的进样管。 7、设分选门（画一个空门使机器进行分选操作）。 9、从Acquire menu选择SortSetup。在Sort Gate菜单中选择步骤7设定的分选门。按液流控制 键RUN。 10、在Setup 方框中打叉，点击Acquisition Control 菜单中Acquire。。 11、跑乙醇直至2支收集管注满（每管注满需要9min ），点击Pause, Abort。 12、再重复上述步骤2次，共需要1h。 13、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入500mL无菌蒸馏水，振摇鞘液筒，倒掉液体，反复操作直 至洗净桶内壁残余乙醇。 14、在鞘液筒中加入3L无菌蒸馏水，盖紧盖子。安好鞘液筒。 15、在收集管接口处安装2支新的收集管。 16、放上一支装有无菌蒸馏水的进样管。 17、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。 18、跑无菌蒸馏水直至2支收集管注满（每管注满需要9min），点击Pause Abort。 19、再重复上述步骤2次，共需要1h。 20、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入3L无菌PBS盖紧盖子。安好鞘液筒。 21、在收集管接口处安装2支新的收集管。 22、放上一支装有无菌PBS的进样管。 23、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。 24、第一支收集管（最左）中收集15 mL PBS后取下，使PBS由左至右流入下一收集管。重复 操作至2个管都收集了15 mL PBS为止。点击Pause, Abort。 25、在收集管接口处安装2支新的收集管。若要分选动物细胞，则应用无菌技术，用无菌 PBS4 % BSA缓冲液过夜包被50mL锥型管，将包被好的锥型管安置于收集接口。 26、按下述分选步骤分选样本 二、分选细胞
流式细胞术样本制备.
样本制备实例: 细胞表面蛋白荧光染色 (Immunofluorescence Staining 原理: 对细胞表面蛋白质的染色可以分为直接染色(DIF 和间接染色(IIF 两种。直接染色是指用直接联有荧光的抗体染色;而间接染色则是采用一级抗体和蛋白先结合,然后再用带有荧光的与一级抗体有亲和力的二级抗体进行染色。荧光染色的方法在蛋白质检测中使用非常普遍,因为只要采用合适的抗体,几乎任意的蛋白都可以用指定的荧光标记。但是由于各种蛋白表达的强度和荧光染料自身荧光强度不同,以及临近通道串色的问题, 多色实验的基本原则是:最强的染料配表达最弱的蛋白,最弱的染料配表达最强的蛋白; 如果使用染料的数量不大则应尽量避免使用临近通道。还需要考虑染料之间的溢漏、以及偶联染料已降解的问题。现出现了 405nm 的激光激发的新型染料如 BV421、 BV605等为多色实验提供了更多的选择空间。 材料: ?被检测细胞 ?FACS Lysing Solution (细胞裂解液, 1倍或 10倍, 10倍的要先稀释到 1倍后使用 ?相应的蛋白荧光染色抗体 (e.g. CD4 FITC, CD8 PE, CD3 APC 步骤: 1. 在 100 μL外周血加入抗体: a. 同型对照:PB 100μL +Isotope FITC 20 μL+Isotope PE 20 μL+Isotope APC 5 μL b. 单阳管:PB 100μL +CD4 FITC 20 μL+Isotope PE 20 μL+Isotope APC 5 μL c. 单阳管:PB 100μL +Isotope FITC 20 μL+CD8 PE 20 μL+ Isotope APC 5 μL
人体流式细胞术参数的正常参考值资料讲解
人体流式细胞术参数的正常参考值 外周血中各种流式细胞仪检测指标的正常参考值 T细胞表面标志细胞名称平均数±标准差范围 T细胞抗原 CD2 总T细胞76.28±7.68 62.5~89.0 CD3 成熟T细胞69.98±5.79 61.1~77.0 CD4 T辅助/诱导性细胞亚群32.25±5.16 15.8~41.6 CD5 T细胞（B细胞亚群）77.06±7.34 69.5~8.8 CD8 T仰制/细胞毒性细胞亚群25.08±4.34 18.1~29.6 CD28 T细胞受体共刺激分子49.59±9.30 39.5~64.8 CD8+/CD28+ 细胞毒性T细胞13.22±4.18 8.6~15.5 CD8+/CD28- T仰制性细胞15.99±5.13 9.9~24.8 CD3+/HLA-DR- 静止T细胞67.10±11.69 55.3~77.1 B细胞抗原 CD19 全部B细胞11.56±2.54 7.3~18.2 CD20 全部B细胞12.20±2.92 NK细胞抗原± CD3-/CD(16+56)+ NK细胞14.91±4.87 8.1~25.6 单核巨噬细胞 CD14+ 单核细胞 5.10±2.00 活化细胞表达抗原 CD3+/HLA-DR+活化T细胞 3.05±1.34 1.2~5.8 CD3-/HLA-DR+活化B细胞7.42±3.22 3.0~11.7 CD3+/CD2 5+活化T细胞15.94±3.67 1.01~2.20 CD5+/CD19+活性B细胞 4.65±1.51 3.1~6.6 CD69 活化诱导分子（AIM） 2.09±0.87 0.8~3.5 CD38 活化T细胞51.07±5.67 42.4~60.0 免疫调节细胞 CD4+/CD29+ T辅助性细胞诱导亚群16.92±5.35 9.8~26.0 CD4+/CD45-RA+ T仰制性细胞诱导亚群20.51±3.64 15.0~25.0 其他参数 HLA-DR MHC-Ⅱ类分子DR抗原10.93±4.51 6.1~17.0 CD45-RA 白细胞共同抗原CD45异型66.99±5.06 59.8~73.7 CD4/CD8值 1.42±0.89 0.98~1.94 I型变态反应介导分子 CD23 IgE低亲和力受体（Fc ） 3.19±0.65 1.9~4.4 IgE 膜结合IgE 1.95±0.89 0.9~3.7 造血干细胞、祖细胞 CD33 粒细胞前体25.90±3.32 21.3~30.4
流式细胞术
流式细胞术检测淋巴细胞表面标记 一、实验目的 1.了解流式细胞仪的组成、原理及应用：初步了解流式细胞仪的工作元件及基本应用原理；能够认识流式细胞术的应用，特别是常用的一些功能。 2. 熟悉用流式细胞术检测小鼠脾脏T细胞表面标志的基本流程 3. 学习并掌握流式细胞术结果的分析：能够基本看懂结果图，重点掌握“门”和“补偿”两个概念。 二、实验原理 1.流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性（多参数）的技术，同时可以对特定群体加以分选。 特点：可检测的样本种类多样，大小范围较广（0.2~50μm）；检测速度快，分析样本量大（快速、大量）；细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏；采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度10000个细胞(微粒)/秒与统计分析精确性。 2. 流式细胞仪组成及原理 Fluidics (液流系统)——流体动力学聚焦样本形成单细胞流。 鞘液是辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。匀速流动，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。 Optics (光学系统)——激发和收集光信号。 激发系统包括：激光器、透镜和反射镜，将激光聚焦到检测区 收集系统包括：光学镜片和滤光片、光信号检测器 流式细胞仪收集的信号：（1）散射光信号：细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为前向散射光(信号强弱与细胞体积大小成正比)和侧向散射光(检测细胞粒度和细胞内相对复杂性)。FS-SS图可对未染色的活细胞进行分析或分选，但不能分析表面分子（2）荧光信号：荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同；每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管；选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。 Electronics (电子系统)——数据处理系统，扩大信号，将光信号转化为电信号，处理信号并存储于电脑。 3.流式步骤 第一步：用带有不同荧光基团的抗体分别识别并结合细胞上不同抗原（染色）；第二步：带有荧光的细胞一个接一个通过激光；第三步：不同荧光基团有不同发射光谱，荧光染料选择原则：必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发、激发光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范围内、荧光素光谱的重叠应当尽量减少；第四步：复杂的荧光信号被不同分色镜和滤光片分解；第五步：光电倍增管（PMT）将光信号变成电信号；第六步：模数变换器（ADC）进一步将模拟信号变成计算机能处理的数字信号 4.分选基本原理
最详细的流式细胞仪实验方法
流式细胞仪实验方法 一、实验准备 1．标本制备： 2．最小化非特异性结合： 二、凋亡 1．凋亡的检测方法：网站和其它 2．PI染色法 3．Annexin V 法 4．TUNNEL法 三、细胞因子 1．激活的细胞因子 2．CBA 四、血小板 1．活化 2．活化检测 3．网织血小板 五、红细胞 1．网织红细胞 2．PNH 3．胎儿红细胞 六、肿瘤学 1．DNA 细胞周期 2．蛋白 3．多药耐药 4．微小残留白血病
第一部分标本处理 一、流式细胞术常规检测时的样品制备 (一)直接免疫荧光标记法 取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。 (二)间接免疫荧光标记法 取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。 二、最小化非特异性结合的方法 1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。 2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。这个步骤通过阻断第一抗体和细胞表面或胞内结构的非特异性的交互作用来降低背景。 3．在使用第一抗体之后，将样品与5%至10%的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育。这个步骤会减少不必要的第二抗体与第一抗体、细胞表面或胞内结构之间的交互作用。 通过用来自于同样的样品的血清稀释标记过的抗体可以略过此步骤。此步骤适用于很多方面，但有时候它也会导致已标记的第二抗体和正常血清中的免疫球蛋白的免疫复合体的形成。这种复合体会优先与一些细胞结构进行结合，或者它们最终会导致期望得到的抗体活性的丢失。 4．使用F(ab’)2片段会使背景决定于第一或第二抗体与FC受体的全分子结合。大多数的第二抗体的F(ab’)2片段容易利用。而第一抗体的F(ab’)2片段一般是不能利用或很难制作。因此，在NaN3存在的条件下，将新鲜组织或
流式细胞仪操作步骤(FACSCalibur)
一、开机程序： 1.检查鞘液桶和废液桶。确认鞘液充满状态（鞘液为鞘液桶体积的3/4位 置，可以连续工作3个小时左右）、盖紧黑盖、管道畅通、废液桶有足 够空间容纳本批标本排弃的废液。如果要添加鞘液，要先释放鞘液桶中 气压。 2.依次打开流式细胞仪FACSCalibur稳压器、主机开关、电脑开关，打印 机。 3.气压阀置于加压位置，待流式细胞仪处于STANDBY状态，做Prime，以 排除管路中气泡。 二、运行FACSComp软件、检查仪器状况 1.制备三色标准微球样本。一般情况向1ml鞘液（或过滤PBS）中加入 1滴质控小微球，也可以根据实际情况调节浓度。 2.机器预热5 min，打开FACSComp软件，选择保持路径。选择所需校 正内容，如果使用的微球是新一批产品要输入微球的批号。 3.在软件界面左侧Assay Selection选项中选择质控类型，即实验过 程中是否需要清洗样品。 4.上样品，微球溶液上样之前要充分混匀。功能键设置在“RUN”。 5.仪器自动检查，并做电压、补偿等设置。 6.FACSComp软件运行完毕，显示结果通过测试。 7.做Set up。 8.打印校正结果，退出FACSComp程序。 备注：在质控过程中，如果提示收集细胞速度慢可以提高细胞收集速度，但是在调节灵敏度（Sens）时，一定要用“Low”的状态上样，保证仪器灵敏度的准确。在使用仪器过程中要养成好的习惯，在上样品过程中，仪器保持在“Low”“Standby”状态。 三、样品分析软件：CellQuest Pro 软件，选择“联机”。 1.
（2）对实验样本进行命名； （3）对实验通道进行预设（FSC,SSC,FL1-FL4）。 备注：如果界面被关闭，重新调出步骤： 2.调出质控模板。 3.画图 选择画图工具（一般选择散点图），Inspect 界面会自动弹出，对几个常用选项进行设定：将散点图选中（用鼠标点击散点图边框才能够 选中图形），将 更改横纵坐 备注：第一个散点图横坐标为FSC，纵坐标为SSC 。 （1一般获取10000个细胞。 （2 （ 3）将所有补偿调为0 （4）将非 52 （5）FSC和SSC （6 4.上阴性对照 将阴性对照管混匀，上机，功能键设置在“RUN”,散点图出现细胞信 号，第一个图：让细胞信号出现在自己看上去舒服的区域；其他三个 散点图，要将细胞信号调整到阴性区域，即左下角区域。通过移动通
流式细胞术实验方法
流式细胞术实验方法 PI 染色操作步骤 1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。 2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。 3、加入2ml预冷的70%酒精，4℃固定30min，或是-20℃固定过夜。 4、离心，弃上清液。 5、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。 6、加入RNase A (工作浓度20ug/ml)于500ul 1×PBS中，37℃孵育30min，离心。 7、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。 8、加入PI(工作浓度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中，室温避光孵育30min。 9、混匀，过300目筛网，置流式管中， 4℃冰箱保存，待测。 GFP PI染色操作步骤 1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。 2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。 3、加入2ml预冷PFA，PFA的浓度根据细胞的特点进行调节，4℃固定30min。 以下步骤同PI 染色操作步骤的（4-9） 细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤 1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。 2、以冷PBA 1ml，离心洗涤，弃上清液。 3、加入用PBA稀释的荧光素标记的抗体200ul。用微量移液器轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min-1h。 4、离心弃上清液。 5、加入冷PBS1ml,离心洗涤2次，以除去未结合的多余抗体成分。 6、向细胞中加入冷PBS 500ul,吹打混匀，置流式管中，4℃避光保存，待测。 细胞表面间接免疫荧光染色操作步骤 1-2、同细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤 3、用PBA稀释的第一抗体200ul，对照管加入对应于一抗的正常实验动物IgG，轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育1、5-2h。离心，弃上清。 4、 BS1ml离心洗涤1次，以去除多余的未结合的特异性抗体。 5、 PBA适当稀释的荧光素标记的第二抗体200ul。吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min，避光。 6、 PBS 1ml离心洗涤2次。
(完整word版)流式细胞术步骤.docx
利用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡 1.细胞按每孔 4×105个的密度接种于 60 mm 细胞培养皿内，培养过夜后，用相应药物处理 细胞。 (设置实验组和对照组，实验组依辛伐他汀浓度分为 3 组，2μ mol/L、5μ mol/L、10μ mol/L 辛伐他汀组 正常对照组 (NC 组)：胰岛素终浓度 0.058mg/L A 组：辛伐他汀终浓度2μ mol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L ； B 组：辛伐他汀终浓度5μ mol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L ； C 组：辛伐他汀终浓度10μ mol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L ； 于 37℃， 5%CO2 培养箱中孵育 48h） 2. 胰酶消化收集细胞，并用 1 mL PBS 缓冲液清洗剩余细胞一次，全部加入15ML 管中。 3.800 rpm 离心 5 分钟，去除上清，加 5 mL PBS 缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复 两次，最后重悬细胞于0.5mL PBS 中。 4.用低速振荡器边震动边加入5 mL 预冷的 70%乙醇，固定， 4℃过夜。 5.次日将固定好的细胞以 1000 rpm 的转速离心 5 分钟，弃上清，加入 4 mL PBS 清洗一次，用 0.4 mL PBS 重悬细胞。 6. 加入 5 μL RNaseA（ 10 mg/ml ） 37℃消化 1 （propidium iodide PI ）4℃避光染色过夜（或者小时，加入终浓度50 mg/mL碘化丙啶37℃避光染色 1 小时），在 EPICS XL 流 式细胞仪上分析。 利用流式细胞抗体检测检测细胞膜表面蛋白的变化 1.细胞按每孔 4×105个的密度接种于 60 mm 细胞培养皿内，培养过夜后，用相应药物处理 细胞。 2．胰酶消化收集细胞，并用 1 mL PBS 缓冲液清洗剩余细胞一次，全部加入15ML 管中。 3 . 800 rpm 离心 5 分钟，去除上清，加 5 mL PBS 缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复 两次，最后重悬细胞于0.1mL PBS中，并转移到 1.5 mL离心管中。 4. 按照1:100加入1UL一抗（如下图对应），置于垂直混合液上室温孵育1-2小时。 5. 1500rpm ，小型离心机离心 5 分钟，去除上清，加 1 mL PBS 缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复 3 次，最后将洗好的细胞重悬于0.1mL PBS 中。
流式细胞仪操作流程
查看文章 流式细胞仪-细胞凋亡检测Ⅰ 2008-11-01 10:20 一PI单染色法 基本原理 其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面： 1. 细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。 2. 光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。也可用于活细胞的分类。 试剂与仪器 l PBS溶液（配制方法见附录）； l PI染液：将PI溶于PBS（pH7.4）中，终浓度为100ug/ml。用棕色瓶4℃避光保存。 l 70%乙醇 l 400目筛网 l 流式细胞仪 实验步骤 1. 收集细胞｛数目约（1~ 5）×106个/mL｝，500 ~ 1000 r/min离心5min，弃去
免疫学实验：流式CBA多因子检测详解
简介：优宁维实验服务之CBA流式检测服务 提供商：上海优宁维生物科技有限公司 服务名称：流式细胞术CBA流式检测技术服务 服务名称标本要求实验周期单位备注CBA 可溶性蛋白50ul 1周每个样BD C6 FCM检测服务 Cytometric Bead Array简称CBA，那么什么是CBA呢？CBA，即微量样本多指标流式蛋白定量技术是一个基于流式细胞检测系统的多重蛋白定量检测方法，它能够同时对单个样品中的多个指标进行检测。 CBA的原理 通过利用一系列带有荧光标记的微小、分散的微球连接特定 的捕获抗体以捕捉溶液系统中的待测物，通过对应各种不同 检测物的特异微球上所带有荧光强度不同从而同时测定分析 样本中多种可溶性成分的数量。
CBA强大的优势 ?能够同时对单个样本进行多种检测。 ?较传统检测节省样本量9倍。 ?灵敏度高、重复性好。 ?所有分析只需一组标准曲线。 ?避免酶联反应所致人工假象。 ?节省操作时间。 ?节省检测时间。 革新的CBA技术与传统的蛋白定量相比有下列优点： 传统ELISA流式CBA检测技术 单项检测多参数检测 每项实验样本用量50-200ul样本用量少于50ul 需要抗原包被操作方便，节省时间 实验时间大于24h流式细胞仪自动检测，标准曲线自动测定，专用软件自动计算酶-底物背景干扰无酶-底物背景干扰 优宁维抗体相关实验技术服务 WB/IP/COIP、IHC、IF、FC、ELISA、多因子检测(CBA/MSD/luminex)、抗体芯片，流式检测… univlab@https://www.360docs.net/doc/397650495.html, 优宁维优势： 1、专业的抗体公司 2、博士后领衔团队 3、先进的实验仪器平台 4、可靠、放心 的结果 5、实惠、亲民的价格 6、认真、严谨的工作态度 优宁维公众平台：优宁维抗体专家
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤 取对数生长期的A549细胞，按1×106 cells/mL以1mL接种于 100mm培养皿内 ↓ 24h后，进行所需的处理（比如加药,照射） ↓ 特定时间后终止培养，进行下一步的实验 ↓ 收集原培养液，洗后的PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入15ml 离心管中 ↓ 1000rpm离心5min（短时低速离心） ↓ 弃上清，用1.5ml预冷PBS，1000rpm离心5min后去除PBS和细胞 悬液内的细胞碎片 ↓ 加入1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下加入3.5ml无水乙醇，混匀后，于4℃固定30min,或-20℃长期保存。 ↓ 1000r/min,离心5min ↓
将乙醇吸除，加PBS清洗混匀 ↓ 1000r/min,5min再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去 ↓ 吸除离心管内PBS，加入200ul PBS和2ul的RNA酶（0.25mg/ml）(37℃下孵育30min) ↓ 加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室温下避光染色30min ↓ 将离心管内的细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS的EP管中（PI 具有很强的粘附性，容易使细胞聚团），标记EP管 ↓ 提前一天网上预约 ↓ 开机（先开仪器后开软件） ↓ 流式细胞仪的结构一般分为5部分：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束成形系统；③光学系统；④信号检测、存贮、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。 ↓ 检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后插入流式细胞仪上
↓ 流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱 ↓ 液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光（488nm激 发光源） ↓ 荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析（荧光染料和细胞DNA分子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例） ↓ 在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出 结果分析——Modfit软件分析
流式细胞术及其应用教程
流式细胞术及其应用教程 The course of flow cytometry and its application 课程简介 该课程包括理论和实习两部分，理论课程重点介绍与流式细胞术密切相关的基本原理、结构及其在临床和科研工作中的应用。内容包括流式细胞术的基本原理、流式细胞仪数据的采集和分析、血细胞分化发育过程、流式细胞术在免疫学、血液学、肿瘤学及科研工作中的应用。通过理论授课使研究生能够掌握上述领域的基本理论和最新研究进展，达到提高研究生流式细胞术应用水平、拓展研究生思路、开阔眼界，为培养复合型人才打下基础。实习内容包括标本制备、仪器的调节与质控、淋巴细胞亚群分析、HLA-B27检测、胞膜、内抗原检测、红细胞CD55、CD59检测、血小板膜糖蛋白分析、DNA倍体分析及细胞因子检测。通过实习使研究生进一步熟悉流式细胞仪的使用程序，操作规程，为今后的工作、学习提高帮助。 This course includes in lecture teaching and practice lesson. The lecture teaching will be focused on flow cytometric basic theory, structure, data collection and analysis, application in clinic and research. The practice lesson will be focused on sample preparation, instrument setting, analysis of lymphocytes, HLA-B27，extracellular antigen and intracellular antigen, analysis of CD55,CD59, DNA ploidy analysis and cytokine detection. 教学大纲 一、课程名称：流式细胞术及其应用教程 二、总学时数：38学时，2学分 理论课18学时 实验课20学时 三、授课对象： 博士生、硕士生，专业不限
BD FACSCalibur流式细胞仪简易操作步骤_corr_ZYH_20140520
电子版本: \\NOVOPUBLIC\NovoBio\流式细胞仪\BD FACSCalibur 流式细胞仪简易操作步骤 _corr_ZYH_20140520 - 1 - BD FACSCalibur 流式细胞仪 简易操作步骤 一、开机 1） 先打开净化交流稳压电源，其次打开110V 稳压输出电源，再次打开流式细胞仪，最后打开计算机。 2） 向前拉开储液箱抽屉，检查鞘液筒、废液筒水量，如需充填鞘液，先将减压阀（红色箭头所示）方向调在VENT 位置（箭头方向），再加入超纯水，保持水位在鞘液桶的3/4左右，加好后拧紧桶盖并将减压阀方向调在RUN 位置。 二、开启CellQuest 软件、编辑实验文件 1） 在屏幕下方点击CELLQuest （第四个图标） 启动软件。桌面会出现一’Untitled’ 实验文件，可点击实验文件的左上角的放大钮（绿色），将实验文件窗口放大。
2）从工具板中点击散点图图示。在实验文件的空白区点击，拖曳对角线至适当大小，然后放开鼠标。出现散点图对话方框（当所要编辑的图窗口被选中时，会在其四角出现四个小黑块）。 3）在出现的散点图对话方框中点击Plot Source，选择Acquisition and Analysis (收取、分析) ，确认X和Y轴参数预设为FSC-H 1024、SSC-H 1024。 4）从屏幕上方Plots菜单中选择Dot Plot功能，可复制一个同样大小的散点图，在出现的对话方框内选择X轴：FL1-H 1024；如果是双标，Y轴选择：FL2-H 1024(根据实验检测样品确定所选通道，本步骤选FL1/FL2来说明)，如果是单标，Y轴选择：SSC-H。 点击OK，FL1/FL2的散点图出现。完成后可将重制图移至原图右方。