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SYBR Green 实时定量PCR 检测转基因
大豆中外源基因拷贝数
冀志庚，高学军*，敖金霞，张明辉，霍楠
（东北农业大学生命科学与生物技术研究中心，哈尔滨
150030）
摘要：采用SYBR Green Ιreal-time PCR 方法检测转基因大豆中外源基因35S 边界基因的拷贝数，以大豆凝
集素基因（Lectin ）作为内参照基因，以转基因大豆基因组DNA 为内参照基因标准品，初始浓度为0.43μg ·μL -1，进行5倍梯度稀释得到内参照基因C T 值与起始模板量的相关性标准曲线：y =-2.9915x +22.3321，R 2=0.996；以含35S 边界序列的质粒DNA 为目的基因为标准品，初始浓度为0.64μg ·μL -1，同样进行5倍梯度稀释，建立目的基因C T
与起始模板量的相关性标准曲线：y =-3.4021x +17.7219，R 2=0.999。通过SYBR Green Ιreal-time PCR 获得样本中目的基因和内参基因的C T 值，将C T 值分别代入标准曲线计算该样本中内参基因和目的基因起始模板量，目的基因与内参基因起始模板量比值即是目的基因在该转基因中的拷贝数。计算结果为4份样品中，2个拷贝的1个，3个拷贝的3个。
关键词：real-time PCR ；SYBR Green Ι；转基因大豆；拷贝数；Lectin ；35边界序列中图分类号：S565.1；Q78
文献标志码：A
文章编号：1005-9369（2011）10-0011-05
Establishment of SYBR Green-base quantitative real-time PCR assay for determining transgene copy number in transgenic soybean/JI Zhigeng,
GAO Xuejun,AO Jinxia,ZHANG Minghui,HUO Nan(Life Science and Biotechnique Research Center,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)
收稿日期：2010-10-28
基金项目：国家转基因重大专项课题（2008ZX08012-001）
作者简介：冀志庚（1984-），男，硕士研究生，研究方向为转基因作物检测。E-mail:hanbo001@https://www.360docs.net/doc/3a16717608.html, *通讯作者：高学军，教授，博士生导师，研究方向为转基因检测。E-mail:gaoxj5390@https://www.360docs.net/doc/3a16717608.html, Journal of Northeast Agricultural University
东北农业大学学报第42卷第10期42(10):11~15
2011年10月
Oct.2011
实时荧光定量PCR 技术是一种新的DNA 定量方法[1]。其定量的基本原理是在PCR 反应体系中加入非特异性的荧光染料（如SYBR Green ）或特异性
的荧光探针（如Taqman 探针）[2]，实时检测荧光量的
变化，获得不同样品达到一定的荧光信号（阈值）时所需的循环次数—C T 值（Cycle threshold ）；根据C T 值与起始模板数的对数值成反比线性关系的原
理，制作标准曲线，就可知道基因线，获得C T 值与起始模板数的相关性方程，将样品的C T 值代入该方程就可获得目的基因的起始模板数，通过与大豆内源参照基因起始模板数的比较，就可知道基因组中该外源基因拷贝数[3]。
本研究以抗草甘膦（CP 4-EPSPS ）转基因大豆为材料，以CaMV35S 边界序列为外源基因，避免以CaMV35S 和nos 为外源基因出现假阳性。选择大豆凝集素基因（Lectin ）作为内源参照基因进行拷贝数估算，通过SYBR Green Ι实时荧光定量PCR 法检测转基因大豆中CaMV35S 基因的拷贝数。
1材料与方法
1.1
材料
转基因杂交大豆（由东北农业大学大豆研究所提供），非转基因大豆（购自某超市）；阳性质粒（本实验室构建）；TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit （Code No.:DRR015）SYBR Premix EX Taq TM （Code No.:DRR041S ）购自大连宝生物工程有限公司；ABI
实时定量荧光PCR 仪（ABI7300），96孔扳（AXYG-EN ）。
1.2
方法
1.2.1DNA 提取
转基因大豆基因组DNA 采用CTAB 法提取[4]，用
分光光度计检测DNA 含量及纯度。内参基因标准品选用转基因大豆基因组DNA ，浓度为0.43μg ·μL -1，稀释倍数分别为50、5-1、5-2、5-3和5-4。以含35S 边界序列的质粒DNA 为标准品，浓度为0.64μg ·μL -1，稀释倍数分别为50、5-1、5-2、5-3和5-4。以Lectin 作为大豆的内参基因，以含35S 边界序列的质粒DNA 为阳性对照，未转基因大豆为阴性对照，水为空白对照。1.2.2CaMV35S 边界序列的获得
以转基因大豆基因组DNA 为模板，利用染色
体步行法（TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit ）扩增CaMV35S 上游序列。通过测序获得CaMV35S 上游
大豆基因组序列。根据获得的序列设计特异性引物，构建pMD18-T 阳性质粒载体。1.2.3引物设计及合成
转基因大豆内、外源基因的引物由Invitrogen
公司合成。引物序列见表1。1.2.4PCR 反应体系和程序
定量PCR 反应体系：SYBR Premix EX Taq TM
（2×）10μL ，PCR 上游引物（10μmol ·L -1）0.4μL ，PCR 下游引物（10μmol ·L -1）0.4μL ，ROX Re-ference Dyer （50×）0.4μL ，模板2.0μL ，灭菌蒸馏水6.8μL ，总体积20μL 。
PCR 程序（采用两步法PCR 扩增程序）：预变
性95℃30s ；95℃5s ，60℃31s ，40个循环。5个不同稀释度的内参照基因标准品，5个不同稀释
Abstract:SYBR Green Ιreal-time PCR was developed to determine copy number of exogenous 35S/plant
gene in transgenic soybean.A conserved soybean housekeeping gene,Lectin was used as an internal contral and 5times diluted soybean genome DNA was used as an initial template copy of Lectin .So y =-2.9915x +22.3321,R 2=0.996,the standard curves of the cycle threshold (C T )relative to the log of each initial template copy of Lectin was obtained.In the same way,the standard curves of 35S/plant y =-3.4021x +17.7219,R 2=0.999,was obtained using 5times diluted plasmid DNA which contains 35S/plant gene.By SYBR Green Ιreal-time the C T values of Lectin and 35S/plant gene in each transgenic soybean was got,the transgene copy number was calculated by comparing the initial template copy of 35S/plant to Lectin gene in the same transgenic soybean.It concluded that among four PCR putative transgenic plants:one had two copies,and the other had three copies,respectively.
Key words:real-time PCR;SYBR Green Ι;transgenic soybean;copy number;Lectin ;injection sequence of
35S
东北农业大学学报·12·第42卷
度带有目的片段的质粒DNA ，空白对照同时进行扩增，均设3个平行。
1.2.5Lectin 基因和35S/plant 标准曲线的制作
Lectin 基因标准曲线的制作是将大豆基因组
DNA 做50、51、52、53和54倍稀释，并以这些稀释
的DNA 进行PCR ，得到各自的C T 值，通过C T 值与起始模板数的对数值之间存在的线性关系，获得标
准曲线。含有目的片段的质粒DNA 标准曲线的制作是将质粒DNA 做50、51、52、53和54的梯度稀释，用与Lectin 同样的方法获得标准曲线。
M 1
234
500bp 200bp M-DL2000分子质量标准；1~2-阳性子；3-阳性对照；4-阴性对照
M-DL2000DNA Marker;1-2-Positive sample;3-GM soybean;4-no-GM soybean
图1阳性质粒pMD18-T35S 阳性克隆PCR 鉴定Fig.1PCR assay of plamisd pMD18-T35S
100bp
750bp 1000bp 2000bp 表1
实时定量PCR 引物序列
Table 1Primer sequence for real-time quantitative PCR
名称Name
35S/plant-F 35S/plant-R Lectin -F Lectin -R
引物方向（5'-3'）Primer sequence
CATAGGGAACCCAAATGGAAAA CGGCAGAGGCATCTTCAAC CCAGCTTCGCCGCTTCCTTC
GAAGGCAAGCCCATCTGCAAGCC
扩增片段（bp ）Amplification fragment
9074
2
结果与分析
2.1
阳性质粒标准品的鉴定
质粒pMD18-T35S 克隆阳性子以PCR 的方式进
行鉴定，引物序列如下：大豆基因组引物：ACCCTTCAATTTAACCGAT GCT
35S 引物：TCCATCTTTGGGACCACTGTCG
PCR 反应程序：95℃，2min ；95℃，30s ；
58℃，30s ；72℃，30s ；35个循环。PCR 结果见图1。
2.2标准曲线的制作
用转基因大豆基因组DNA 做内参基因标准
品，以含35S/plant 基因的质粒作为外源基因标准
品进行梯度稀释，得到标准曲线。以C T 值为Y 轴，
以起始模板拷贝数的对数为x 轴，分别建立标准曲线。数据由ABI7300自带软件分析，由分析结果可知，模板C T 值与该模板起始浓度存在线性关系，横坐标为标准品浓度的对数值，纵坐标为循环数。Lectin 内参基因标准曲线为y =-2.9915x +22.3321，R 2=0.996；35S/plant 基因的标准曲线为y =-3.4021x +17.7219，R 2=0.999。
2.3
熔解曲线的分析
SYBR Green 是一种双链DNA 结合染料，可以
结合于所有双链DNA 双螺旋小沟区域中并受激发
产生绿色荧光的能力。因此在PCR 扩增中没有特异性，所以在进行实时荧光定量时，一般通过熔解曲线来分析其扩增特异性。理想的溶解曲线荧光是单峰型曲线，如果出现两个或两个以上的峰，说明有引物二聚体等非特异性扩增。本试验的溶解曲线如图2、3所示，图2中Lectin 基因的扩增溶解曲线为单峰，图3中35S/plant 基因的扩增溶解曲线也为单峰，在PCR 过程中都没有非特异性条带出现，由此推断定量PCR 扩增所获得的数据是可靠的。
2.4相对定量法计算转基因大豆中35S/plant 基因的拷贝数
在本试验中，选取4份PCR 检测为阳性的转基
因大豆，利用CTAB 法提取基因组，每个样品做3
个重复，定量PCR 反应，获得扩增曲线，荧光阈值的设定与制作标准曲线时相同，获得待测样品的C T 值（见表2）。
表3为根据PCR 结果得出检测样本中C T 值，代
冀志庚等：SYBR Green 实时定量PCR 检测转基因大豆中外源基因拷贝数第10期·13·
表2
待测样本中内参基因、外源基因的C T 值及T m 值
Table 2
C T and T m values of Lectin and 35S/plant genes in transgenic soybean
转基因株系
Transgenic line
1234
阴性对照Negative control
空白Blank
凝集素基因Lectin
循环阈值Cyclethreshold (C T )
27.0025.1524.5725.16N/A N/A
温度（℃）T m
82.282.782.582.5N/A N/A
35S/植物基因35S/plant
循环阈值Cyclethreshold (C T )
27.4726.8826.2926.25N/A N/A
温度（℃）T m
81.481.781.781.4N/A N/A
表3转基因植株中外源基因拷贝数的估算
Table 3
Estimation of copy number of 35S/plant gene in each transgenic line
转基因株系Transgenic line
1234
35S/plant 基因计算结果Calculation result of
35S/plant
-2.8653-2.6918-2.5184-2.5067
凝集素基因计算结果Calculation result of
Lectin gene
-1.5606-0.9422-0.7483-0.9456
35S-植物基因/凝集素基因35S-plant/Lectin
1.83
2.85
3.362.65
拷贝数Copy number
2333
入标准曲线分别计算源基因Lectin 和外源基因35S/plant 的起始模板数，由外源基因相对于内参基因
的比值估算拷贝数。经估算4份样品中2个拷贝的为1个，3个拷贝的为3个。
图2内参基因标准品中Lectin 基因的溶解曲线
Fig.2
Dissociation curve of Lectin gene
温度（℃）Temperature 0.450.40
0.350.300.250.200.150.100.050.00
-0.05
相对荧光强度的对数值
D e r i v a t i v
e
图335S/plant 基因标准品的溶解曲线
Fig.3Dissociation curve of 335S/plant
温度（℃）Temperature
0.50
0.400.300.200.100.00
-0.10
相对荧光强度的对数值
D e r i v a t i v e
3讨论
目前在转基因植株中用于确定外源基因拷贝数的方法多见于Southern blot 、CGH 、FISH 、Micro-array 等方法。传统的方法耗时多、价格昂贵，
Taqman 探针法也可用于确定外源基因的拷贝数[5]，我国已经初步建立了以Taqman 为探针的荧光定量PCR 法，在部分口岸已进行转基因产品的定量检测，目前Taqman 探针已经被用在转基因农作物或
初加工制品（玉米、棉花、水稻、大豆、烟草、豆
东北农业大学学报·14·第42卷
粉）进行定量检测，检测灵敏度均达到了0.1%[6]。
探针的设计和试剂的应用仍限制此方法的应用。目前用SYBR Green荧光染料的实时定量PCR方法检测转基因植株外源基因拷贝数的报道很少[7]。
SYBR Green有荧光染料的价格相对比较便宜，可以识别任意的DNA双链，具有广泛的通用性[8]。
与Southern blot相比[9]，SYBR Green检测转基因拷贝数的结果有时不一致。主要表现为荧光定量PCR法检测的转基因外源拷贝数常多于Southern blot结果[10-11]。这可能是由多种原因造成的，从试验原理上来说，荧光定量PCR的高灵敏性所得到的结果更接近于客观事实。
因为SYBR Green燃料可以结合任何双链DNA，因此在PCR过程中可能会出现假阳性植株，为了能有效检测转基因植株中的外源基因，可以采用四步法来消除假阳性，即在检测荧光信号前选用介于引物二聚体T m值和特异产物T m值之间的中间温度84℃进行读板，消除了因无二聚体产生的荧光喜好引起的试验误差，消除假阳性植株。
利用实时荧光定量PCR法来检测外源基因的拷贝数是近几年迅速发展起来的新方法，它以快速、安全、成本低等优点渐渐取代了代价昂贵、操作复杂的Southern blot等传统方法[12]。目前已经建立了大豆、玉米、水稻等转基因作物的Taqman探针法检测外源基因拷贝数。但是Taqman探针的设计也是很昂贵的，不适合大范围的推广，本研究利用SYBR Green法所具有的非特异性和试剂价格低廉的优势，将DNA双链结合染料应用实时荧光定量PCR测定外源基因拷贝数的研究中，建立一种高效并且价格低廉的检测外源基因拷贝数的方法来用于各种研究。
4结论
SYBR Green检测转基因大豆的外源基因的拷贝数具有快速、简便、准确的优点，同时试剂相对便宜，可以作为检测转基因作物外源基因拷贝数的选择。
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第10期·15·
转基因安全性评价
转基因安全性评价 对转基因植物食品未知物质风险的主要担忧有：①致病性物质的出现，即转基因生物产品食用后是否会致病；②营养成分的 变化及抗营养因子的出现，如蛋白酶抑制剂、脂肪氧化酶 的产生或含量的变化；③新的过敏原的出现，如大豆中的 致敏性蛋白和巴西坚果中的2s清蛋白¨u；④天然有毒物的产生，如茄碱、葫芦素、Ot一番茄素等u2棚1。其中，最令人关注的是有可能会产生毒素、抗营养物质、过敏原以及致癌物质或联合致癌物质。转基因奶牛生产的激素(rbGH)在美国投入商业化使用后，使用者很快发现这类药物导致了奶牛乳房炎发病率加繁殖率低。由于药物的作用，奶牛新陈代谢加快，导致能耗增加而引起死亡，牛奶的营养价值也降低了。对获准在西班牙和美国商业化种植的转基因玉米和棉花进行针对性研究后认为，转基因作物可能引起脑膜炎和其它新病种。也有资料证实，转基因食品可能诱发癌症并传递给下一代以及导致失调，可能需要30年或更长的时间。转基因治疗性药物、人体组织器官等是否对人体健康造成影响，尚无法检测证实¨转基因的管理 我国对转基因产品的管理主要是针对农业转基因生物的管理。全国农业转基因生物安全的监督管理工作由农业部负责；卫生部依照《食品卫生法》的有关规定，负责转基因食品卫生安全的监督管理工作；此外，国务院还建立了由多个有关部门组成的农业转基因生物安全管理际联席会议制度，负责研究和协调农业转基因生物安全管理工作中的
重大问题。为了促进我国生物技术的发展，对作为其核心技术的重组DNA技术的研究和开发，必须加强安全性管理。早在1990年，中国政府就制定了《基因工程产品质量控 制标准》，成为我国第一个有关生物安全的标准和办法。1993年，原国家科学技术委员会发布了《基因工程安全管理办法》，对基因工程的定义、安全等级及安全性评价的划定、申报及审批程序等作了规定。在这一技术在国际上开始进入商品化的1996年，农业部又相应制定《农业生物基因工程安全管理实施办法》，具体规定农业生物基因工程安全等级的划分标准，明确各阶段的审批权限，以及相应的安全性控制措施；对农业生物技术的全过程，从实验研究，到中间试验，遗传工程体及其产品的环境释放，到遗传工程体及其产品的商品化生产实施管理，其适用范围涵盖我国自己研发的工作，也包括国外研制的相应产品在我国境内的各个阶段的试验、研究、应用。在联合国环境规划署(UNEP)和全球环境基金(GEF)的支持和资助下，2000年国家环保总局牵头编制了《中国国家生物安全框架》ⅢJ，提出了我国生物安全管理体制、法规建设和能力建设方案。2000年通过的《种子法》，要求转基因植物品种的选育、试验、审定和推广必须进行安全性评价，并采取严格的安全控制措施。销售转基因植物品种种子的，必须用明显的文字标注，并提示使用时的安全控制措施。这是我国第一次要求对转基因产品进行标识。2001年国务院颁布实施《农业转基因生物安全管理条例》。2002年，农业部发布施行《农业转基因生物安全评价管理办法》、
转基因大豆进口对我国生物安全的影响及对策研究
转基因大豆进口对我国生物安全的影响及对策研究 一、目前已经商业化或正在研发阶段的转基因大豆 （一）耐除草剂基因的大豆 孟山都公司的耐草苷膦大豆是在1994年5月19日得到商品批准的。这是最早获准推广的转基因大豆品种（Roundup Ready Soybean，简称 RR大豆）。RR大豆对非选择性除草剂农达（Roundup）有高度耐受性。目前世界上种植最多的是RR大豆。Aventis公司耐膦丝菌素大豆是在 1996年7月31日得到商品批准的。种植抗草苷膦大豆可节约劳力、降低成本，在杀灭杂草后可使大豆增产，因此，在劳力昂贵的美国对RR大豆进行了大面积推广。 （二）豆油脂肪酸改变的大豆 杜邦公司的豆油脂肪酸改变大豆是1998年4月30日获美国食品药物管理局批准，目前杜邦公司利用基因工程方法用反义的油酸脱饱和酶基因转入大豆，已培育出了油酸含量达70%以上的大豆品种。此外，在美国低亚麻酸大豆、低棕榈酸大豆、高硬脂酸大豆、高棕榈酸大豆等转基因品种也已培育成功。 在大豆油脂中，单不饱和脂肪酸是对人体最为有益的营养成份。利用基因工程方法培养出了高油酸含量，提高了对人体最佳的营养成份，同时也降低了多不饱和脂肪酸含量，而且也不存在反式双键的脂肪酸，因此是一种理想的植物油。 （三）转抗虫基因大豆 由于大豆食心虫的危害，抗虫转基因大豆的研究在国内外广泛开展，研究者多采用苏云金芽孢干菌(Bt)伴孢晶体蛋白基因提高大豆抗虫性。目前，在国际上还未见有抗虫转基因大豆被批准商品化的报道。抗虫大豆可以有效地控制大豆食心虫的发生，从而提高大豆产量，显著提高豆粒品质。 二、转基因大豆的发展及其在全球转基因作物中的地位 （一）转基因大豆在全球转基因作物种植面积中占据主要地位 目前世界上种植最多的转基因作物是玉米、大豆、棉花和油菜籽。转基因作物种植面积由1996年的170万公顷猛增到2001年的5260万公顷，其中转基因大豆由50万公顷猛增到3330万公顷，在全球转基因作物种植面积中占63%，比2000年增加750万公顷，增长29%（见表1）。
转基因大豆发展状况及其安全性
题目：《转基因大豆发展状况及其安全性》 201230440316 12家具1班莫智辉101号摘要：世界转基因作物发展迅猛, 其中转基因大豆无论种植面积还是作物产量方面均占 有较大比例，但其安全性受到人们极大关注。本文将从转基因大豆发展现状、转基因方法、转基因大豆种类及其安全性等方面对其做一简单蛛述，并对转基因大豆前景进行展望。 关键词:转基因大豆；安全性；展望； 1 转基因大豆概述及现状 转基因大豆可以抵抗杀草剂——草甘膦（毒滴混剂）。草甘膦会把普通大豆植株与杂草一起杀死。这种大豆被称为转基因大豆。而这种转基因技术终于走出实验室和试验田，进入像玉米、大豆和棉花作物的日常耕作。 转基因大豆的研制是为了配合草甘膦除草剂的使用。除草剂有选择性的和非选择性的，草甘膦是一种非选择性的除草剂，抗草甘膦转基因作物是目前全球播种面积最大的转基因作物。草甘膦杀死植物的原理在于破坏植物叶绿体或者质体中的EPSPS(5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶)。通过转基因的方法，让植物产生更多的EPSPS酶，就能抵抗甘草膦，从而让作物不被草甘膦除草剂杀死。有了这样的转基因大豆，农民就不必像过去那样使用多种除草剂，而可以只需要草甘膦一种除草剂就能杀死各种杂草。当前除了大豆之外，还有很多其他抗甘草膦的转基因作物，包括油菜、棉花、玉米等。除了抗草甘膦作物之外，还有抗草丁膦除草剂的作物，不过草丁膦与草甘膦杀灭植物的原理并不相同，而培养这两类作物所转的基因也不同。而当前转基因大豆主要用来提炼大豆油。 在农业生物技术领域, 转基因作物研究与开发在全球范围内取得举世瞩目进展。目前种植转基因作物的主要国家有美国、阿根廷、加拿大、中国、巴西和南非。2003年, 美国转基因作物种植面积为4280万公顷, 比上一年增加10%, 占全球转基因作物总种植面积的63%；阿根廷居第二, 占21%；加拿大占6%；巴西和中国各占4%；南非占1%。这六个国家占全球种植总面积的99%。其中转基因大豆无论种植面积还是作物产量方面均占有较大比例, 而且一直保持着增长趋势[1]。营养学家称21世纪是“大豆的世纪”, 可见转基因大豆在转基因物及未来食品中占有重要地位。 2 转基因大豆研究概况 大豆高效遗传转化一直是植物基因工程领域的难点之一。其主要原因是转化以后从转化组织的细胞上再生植株比较困难。虽然已经有了再生频率相对较高的再生系统包括体细胞胚胎发生和器官发生再生系统, 然而, 这些再生系统尚不能与现有的植物转化方法很好地结合, 转化效率依然没有显著提高。
转基因大豆检测技术研究进展
转基因大豆检测技术研究进展 [摘要]大豆的转基因研究是国内外植物分子生物学研究的热点之一。转基因大豆已成为世界大豆主产国大豆产业发展的主要动力。由于转基因产品的安全性在世界范围内引起广泛关注，对转基因检测技术的要求也越来越高，因此,对转基因大豆检测技术的研究成为近年来研究的热点。重点介绍以蛋白质和核酸为目标的检测技术，如EI。ISA、PCR和基因芯片技术的最新进展，并对不同方法的优缺点进行比较，为转基因大豆快速检测方法的选择、改进和后续研究提供参考。[关键词]转基因大豆；检测技术；蛋白质；核酸 Abstract：Soybean transformation research is a/hot spot0in the area of plant molecular genetics. Transgenic soybean has become the important power of soybeans industry development in the worlds' major producers of soybean. The different points on potential ecological risks and the impact of transgenic products on human health attracted worldwide attention． With the increase of transgenic products， the transgenic detection technology requirements should be established and perfected． The advance in detection techniques of transgenic soybean were summarized focusing on the protein and nucleic acid for target detection technology，such as new research on ELISA，PCR and gene chip techn0109y，and their characteristic were compared to provide references for transgenic soybean fast detection selection，improvement and subsequent research． Key words：transgenosis soybean；detection technology；protein；nucleic acid. 转基因大豆，是指利用转基因技术，通过基因工程方法导入外源基因所培育的具有特定性状的大豆品种。转基因大豆是种植面积最大的转基因作物，而随着转基因作物及其产品的大规模商业化，其安全性以及对人类健康和生态环境的潜在威胁受到国际社会和广大民众的广泛关注，对转基因成分的检测越来越受到重视。为此，对转基因大豆检测技术进行了综述，并对其优缺点进行比较，以期对转基因大豆快速检测方法的选择、改进和后续研究提供参考。
转基因大豆安全性研究
转基因大豆安全性研究 【摘要】 转基因大豆是世界上最早商品化、推广应用速度最快的转基因作物,但其遗传转化仍然是基因工程领域的难点之一,如何建立高效稳定的遗传转化体系是转基因大豆的研究重点,同时随着转基因大豆走上人们的餐桌,关于其安全性也引起了人们的质疑。本文将从目前研究的各个方向来阐述转基因大豆的发展现状、转基因大豆的优势、转化技术、安全性评价以及对未来转基因生物的展望。【关键字】转基因大豆、环境安全、生物多样性、基因漂移
【正文】 一、转基因大豆生产的现状 近年来,美国的转基因大豆商业化速度进展很快,1994年美国Monsanto公司研制的抗草甘膦转基因大豆被批准进行商业化生产,1997年DuPont公司研制的高十八烯酸(油酸)大豆被批准进行商业化生产,1998年AgrEvo公司研制的抗草丁膦大豆被批准进行商业化生产。2001年,世界种植大豆总面积7 200万公顷,而转基因大豆有3330万公顷占据全球转基因作物的63%,且均为抗除草剂大豆。目前种植转基因大豆的国家主要是美国(转基因大豆约占97%)、阿根廷(转基因大豆约占90%)和巴西(转基因大豆约占25%)等,我国还没有转基因大豆生产。 二、转基因大豆的优势 1、转基因大豆的主要特性 大豆是植物蛋白、油脂、食品、饲料及工业原料的重要来源作物。仅排在水稻，小麦和玉米之后，是世界四大粮食作物之一。当前，转基因大豆商业化种植的主要品种美国抗除草剂草甘膦转基因大豆是通过农杆菌介导方法，将矮牵牛Ti质粒（GaMy）中35s启动子控制EPSPE基因导入到大豆植株，进而培育成的新品种[1]。其含有的4个来源于土壤细菌的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-膦酸合成酶（epsps）基因，是草甘膦抗性的主要来源[2]。此基因与大豆酚类、生物碱和芳香族氨基酸等代谢相关。抗草甘膦转基因大豆的特性主要表现为：较好控制草害、大豆产量高、抗虫性较强、护土壤、降低污染、改善环境、防止土壤养分及水土的流失、减少除草剂活性成分及能有效地控制杂草的生长与繁育，转基因大豆食品使大豆油的产量与品质得到改良、延长食品贮藏时间。 2、转基因大豆的营养价值 金红等对非转基因大豆W28544与美国转基因大豆GTS40-3-2种子中的部分营养指标进行差异检测,结果表明,转基因大豆中的粗脂肪、粗蛋白、脂肪酸、黄酮和酚酸的含量都明显高于非转基因大豆。并且，这些物质均具有提高植物对物理环境的适应性，增强植物抵御天敌侵袭及抵抗病害的能力，monsanto公司对培育转基因大豆品种GTS40-3-2进行食品安全评价的结果表明：转基因大豆中所有氨基酸的含量与非转基因大品种之间不存在显著性差异，内源蛋白过敏源及含量与非转基因大豆之间也不存在差异性，相同品质改良的转基因大豆也取得重
中国转基因食品现状
中国转基因食品现状 【摘要】转基因技术成熟，使转基因在全球应用范围大幅度提高。本文写了转基因在中国的应用及政府的态度和潜在危害及转利弊,以及对转基因前景进行展望。 【关键词】转基因食品发展现状安全 转基因食品是指利用基因工程（转基因）技术（Transgene technology）在物种基因组中嵌入了外源基因的食品，包括转基因植物食品、转基因动物食品和转基因微生物食品。目前，转基因生物技术的研究，大多分布在抗虫基因工程、抗病基因工程、抗逆基因工程、品质基因工程、品质改良基因工程、控制发育的基因工程等领域。 生物技术成为20世纪末发展最为迅速的高新技术之一。生物技术的发展，特别是以基因工程、发酵工程、细胞工程为代表的现代生物技术的发展促使发酵、食品、轻工等传统产业发生了深刻的变革，同时为人类解决人口膨胀、食物短缺、能源匮乏、疾病防治和环境污染等问题带来了新的希望。可以预期以生物技术为基础的转基因食品产业将在本世纪得到更规范、更深层的发展，它的进步将推动整个食品业的发展，并对提高人类的身体素质起到举足轻重的作用。 1转基因食品的发展现状 1.1国际转基因食品发展现状 自世界上第一例转基因烟草1983年问世以来，转基因技术研究范围不断扩大，研究内容包括抗虫、抗病、抗除草、品质改良等大面积种植的转基因作物有棉花、大豆、水稻、玉米等。 国际农业生物技术应用服务组织说，2014年全球转基因作物种植面积1.815亿公顷。转基因作物种植面积前六位为美国(7310万公顷)、巴西(4220万公顷)、
阿根廷(2430万公顷)、印度和加拿大(各1160万公顷)和中国(390万公顷) 。 近十几年来，现代生物技术的发展在农业上显示出强大的潜力，并逐步发展成为能够产生巨大社会效益和经济利益的产业。但是，转基因食品在世界各个国家和地区之间的发展是不均衡的。美国是应用转基因技术最多的国家，在转基因动物研究方面，加拿大、阿根廷是继美国之后大量采用转基因技术的国家。世界上应用转基因技术比较多的国家还有墨西哥、西班牙和南非等。 1.2我国转基因食品发展现状 我国同样很重视转基因技术的应用研究，中国的基因改良作物研究始于20世纪80年代，并得到了国家重点科技攻关项目的支持。经过30多年的努力，我国己经形成了从基础研究到产品研发的较为完整的技术体系。中国农业部已经批准种植的转基因农作物有：甜椒、西红柿、土豆；主粮作物有玉米、水稻。今后可能陆续批准的农作物有小麦、甘薯、谷子、花生等。进口的转基因食品有大豆油、菜子油、大豆等。 目前，我国转基因作物研究在发展中国家中居领先地位，在水稻、棉花等领域已达到了国际先进水平。应用于棉花、水稻等大田作物的转基因技术集中代表了中国转基因作物的研发状况。 2 转基因食品的安全性评价 自从转基因技术问世以来，关于转基因食品是否安全，即食用转基因食品对人类健康是否有不良影响，转基因技术对环境、物种的进化是否有影响等、科学界一直争论不休。建立农业转基因食物评价制度是世界各国的普遍做法。 目前几乎每个发展中国家都面临着人口增长与耕地面积减少的巨大压力，解决这一问题的唯一办法就是通过高新技术来提高农业生产效率。转基因技术的大规模应用可以显著地降低生产成本，提高生产效率。从这个角度看转基因作物存在是必要的我们要对转基因食品有一个客观的认识。 但是转基因作物可能本身成为杂草、转基因作物的亲缘野生种成为杂草或超级杂草、转基因作物可能产生新的病毒疾病、转基因作物对非目标生物的危害、破坏生物多样性、转基因作物对生态系统及生态过程的影响、其他一些不可预计
转基因大豆发展现状
转基因大豆发展现状 摘要：大豆起源于中国，不仅是人类主要的油料作物和植物性蛋白来源，而且是重要的工业原料，在我国粮食安全及国民经济中占有重要地位。人们对大豆的需求量逐年增加，但与玉米、水稻等禾谷类作物相比，大豆绝对产量很低，如按能量转换计算，大豆产量只有玉米的1/3，加上大田除草等工作量大，导致大豆比较效益低，制约大豆生产。育种工作者利用杂交、诱变等手段已培育大量优良新品种，但进步相对较慢，不能满足人类对大豆产量和品质的需求。但大豆生产受病、虫害和干旱等不利因素的影响,产量很不稳定,虽然常规育种技术在抗性品种中发挥了重要作用,但是由于受物种间杂交不亲和性及与不良性状连锁等因素影响而难以利用, 使常规育种受到了限制,因此,现代生物工程技术可以打破生物之间的界限来实现遗传物质的重新组合,因而可按照人类预先设计来改造生物,成为解决农业问题的一条重要出路。大豆比其它作物在遗传操作技术的某些方面难度较大,但随着现代生物技术的飞速发展,大豆的生物技术研究取得了较大的突破。80年代以来,已分别建起细胞、组织和原生质体水平的植株再生体系。 关键词：转基因大豆外源基因遗传转化方法 1转基因大豆类别 1．1抗虫转基因大豆 农作物害虫给农业生产带来严重的危害。在世界范围内,虫害造成的损失约占农作物总收获量的13%,每年大约损失数千亿美元大豆生育期间受害虫侵害严重,常给大豆生产造成巨大损失。大量喷施化学杀虫剂,不仅会增强害虫的抗药性,使益虫及其它生态区系遭受破坏,而且严重污染环境,提高生产成本,破坏生态平衡。常规的育种时限较长，但利用生物工程技术可缩短时限，并且局限性小。抗虫转基因研究涉及到来自苏云金杆菌的Bt基因和豇豆胰蛋白酶基因。 1.1.1含苏云金杆菌的Bt基因的转基因大豆
转基因大豆加工安全管理制度
第一章总则 第一条为规范农业转基因生物加工活动，确保转基因生物在装卸、运输、储存以及加工过程中的封闭式管理，防范转基因生物对人类、动物、微生物和生态环境构成危险或潜在风险，根据农业部《转基因生物安全条例》、《农业转基因生物安全管理办法》、《农业转基因生物进口安全管理办法》，结合本公司实际情况，制定本制度。 第二条本办法所称农业转基因生物，是指用于农产品加工的转基因动植物、微生物及其产品，具体指进口转基因大豆及其加工的产品（包括豆油、豆粕）。 第三条本办法所称农业转基因生物加工是指以具有活性的农业转基因生物为原料生产农业转基因产品的活动。具体指以进口转基因原料，生产豆油、豆粕等活动。 第二章组织保障 第四条成立进口转基因大豆安全管理小组。 为确保进口转基因大豆在原料采购、运输、贮藏、加工及产品销售等环节的安全性，明确相关部门及人员的职责，将各项工作落实到实处，公司特成立进口转基因大豆安全管理小组（以下简称“安全管理小组”），主要负责进口转基因大豆加工过程中的安全管理、日常监督及
突发事件的应急指挥等工作。 第五条职责分工 （一）组长 1、职责 （1）负责公司进口转基因大豆各环节安全工作的总体策划。 （2）负责进口转基因大豆加工过程中及突发事件处理过程中相关资源（人力、物力，必要时财力等）的配备工作。 （3）负责转基因生物扩散突发事件的总指挥及突发事件后与上级主管部门之间的协调沟通工作。 （4）对本公司采购加工的进口转基因大豆安全性负整体责任。 2、权限 （1）有权调动公司内一切资源。 （2）有权组织各部门定期或不定期召开进口转基因大豆相关安全工作会议。 （3）有权变更安全管理小组中所有人员及其职责和权限。 （4）有权以进口转基因大豆安全工作进行直接安排。 （5）有权对出现问题的部门和人员进行直接处理。 (二)副组长
转基因大豆的发展及其安全性评价
摘要：为探讨中国商业化种植转基因大豆的可行性,利用公布的统计数据,系统分析了全球大豆主产国转基因大豆的发展及中国种植转基因大豆可能存在的问题。结果表明:（1)1996—2004年,美国、阿根廷和巴西转基因大豆种植率分别从2%、1.7%和0增至85%、98%和22%。（2)美国和阿根廷转基因大豆快速发展的主要原因是种植转基因大豆可使杂草管理便利化和高效率。（3)可能存在问题是:提高单产和增加利润存在不确定性;中国是大豆原产地并具有独特的消费结构,而转基因大豆生物安全和食品安全隐患会对中国大豆产业产生重大影响;中国生产转基因大豆缺乏竞争优势。因此建议:继续禁止在中国商业化种植转基因大豆。 关键词：安全；危害；平衡发展 所谓转基因食品，就是利用分子生物学技术，将某些生物的基因转移到其它物种中去，改造生物的遗传物质，使其在性状、营养品质、消费品质方面向人类所需要的目标转变，以转基因生物为直接食品或为原料加工生产的食品就是转基因食品。它的研究已有几十年的历史，但真正的商业化是近十年的事。90年代初，市场上第一个转基因食品出现在美国，是一种保鲜番茄，这项研究成果本是在英国研究成功的，但英国人没敢将其商业化，美国人便成了第一个吃螃蟹的人，让保守的英国人后悔不迭。 此后，转基因食品一发不可收。据统计，美国食品和药物管理局确定的转基因品种已有43种。美国是转基因食品最多的国家，60％以上的加工食品含有转基因成分，90％以上的大豆、50％以上的玉米、小麦是转基因的。转基因食品有转基因植物，如：西红柿、土豆、玉米等，还有转基因动物，如：鱼、牛、羊等。虽然转基因食品与普通食品在口感上没有多大差别，但转基因的植物、动物有明显的优势：优质高产、抗虫、抗病毒、抗除草剂、改良品质、抗逆境生存等。 面对越来越多的转基因食品，人们的认识并非一致，以美国为首的主吃派和欧洲为首的反对派在全球范围内形成了两大阵营。不久前调查表明，美国、加拿大两国的消费者大多已接受了转基因食品，仅有27％的消费者认为食用转基因食品可能会对健康造成危害。而在欧洲，大多数人是反对转基因食品的，英国尤为明显。缘由是1998年英国的一位教授的研究表明，幼鼠食用转基因的土豆后，会使内脏和免疫系统受损，这是对转基因食品提出的最早质疑，并在英国及全世界引发了关于转基因食品安全性的大讨论。虽然英国皇家学会于1999年5月发表声明：此项研究“充满漏洞”，得出转基因土豆有害生物健康的结论完全不足为凭。但是，转基因食品的安全性问题已引起了消费者的怀疑。79％的英国人反对试种基因改良作物，抵制转基因食品进入市场。 那么，转基因食品的安全性到底怎么样？是否能吃？从本质上讲，转基因生物和常规
转基因大豆食用安全性探究及检测
摘要 由于基因工程技术的迅速发展，于是食品工业中产生了转基因食品，但是转基因食品的食用安全性一直受到人们的质疑。本文对转基因大豆进行了概述，并介绍了转基因大豆在食用中可能产生的安全性问题以及一些与转基因大豆安全性相关的实验探究，然后总结了转基因大豆的一些检测技术。最后对转基因大豆食用安全性的评价方法作了展望。 关键词：转基因大豆安全性基因 Abstract As the rapidly development of genetic engineering technology technology，it is applied to the food industry to produce a genetically modified food but the genetically modified food safety has been questioned．This paper describes the safety problems in the consumption of transgenic soybean and some security exploration experiments about transgenic soybeans，and summarizes the safety evaluation of these issues and testing methods． Keywords:transgenic soybean; security; gene
目录 1 转基因大豆概述 (1) 2 转基因大豆的安全性 (1) 2.1 外源基因毒性 (1) 2.2 抗药性 (1) 2.3 过敏性 (2) 2.4 产生有毒物质 (2) 2.5 转基因大豆营养组成及生物利用率的变化 (2) 2.6 抗营养因子的变化 (2) 3 转基因大豆食用安全性的实验探究 (2) 3.1 转基因与非转基因大豆营养及次生物质的比较 (2) 3.2 转基因大豆对雄性鼠生殖系统的安全性评估 (2) 3.3 转基因大豆膳食纤维食用安全性研究 (3) 3.4 摄食转基因大豆罗非鱼各组织中转基因成份的检测研究 (3) 4 转基因大豆检测技术 (3) 4.1 蛋白质检测 (4) 4.2 核酸检测 (4) 5 展望 (5) 参考文献 (6)
转基因大豆进口对资源环境和食品安全的可能风险论文图文稿
转基因大豆进口对资源环境和食品安全的可能 风险论文 集团文件版本号：（M928-T898-M248-WU2669-I2896-DQ586-M1988）
摘要：我国目前是最大的大豆进口国，其中进口的80%都是转基因大豆。进口转基因大豆对我国具有重要的意义，也有很大的风险。通过分析进口转基因大豆对我 国资源环境和食品安全存在的可能风险，指出我国要正确认识和对待转基因大豆 进口及研发，妥善解决转基因大豆的安全问题。 关键词：转基因大豆，进口，资源环境安全，食品安全，风险 一、转基因大豆及我国进口基本情况 转基因大豆，是指利用转基因技术，通过基因工程方法导入外源基因所培育的具 有特定性状的大豆品种，转基因大豆可能同时具有高产、优质、抗病毒、抗虫、 抗寒、抗旱、抗涝、抗盐碱、抗除草剂等多重优点。1994年5月，美国孟山都公 司培育的抗草甘膦除草剂转基因大豆(商品名为RoundupReady大豆，简称RR大豆)首先获准在美国商业化种植。此后转基因大豆得到迅猛发展。2005世界上种植转 基因大豆的国家已超过了7个，转基因大豆种植面积所占比例情况如下：美国81%，阿根廷100%，巴西20%，乌拉圭100%，巴拉圭、南非、罗马尼亚、加拿大等国转基因大豆也在发展。目前国际市场上转基因大豆主要有两种，即抗除草剂转 基因大豆，主要是抗草甘膦、草甘二膦和抗虫转基因大豆。目前应用面积较大的 是抗草甘膦除草剂的转基因大豆[1]。2006年，转基因大豆依然是最主要的转基因作物，占全球转基因作物总种植面积的57%（5860万公顷）[2]。 目前我国大豆种植面积和产量均居世界第4位。由于大豆供不应求，我国从1995 年开始批量进口大豆，1996年由出口国变成进口国，随后进口量迅速上涨，2001