大豆脲酶活性的两种不同测定方法的研究

脲酶活力测定(纳氏试剂比色法)

实验四 脲酶活力测定（纳氏试剂比色法） 一、实验原理 脲酶催化尿素水解成氨和二氧化碳，最适反应pH 7.0 。反应式： (NH 2)2CO+ H 2 O 脲酶 2NH 3 + CO 2 氨与纳氏试剂反应生成黄色配合物，其吸光度与氨浓度成正比，故可用以测定服酶的活力大小。反应式： NH 3·H 2O ＋2K 2HgI 4 + 3KOH HgO ·HgNH 2I ＋7KI + 3H 20 （纳氏试剂） （碘化氨氧合汞） 二、实验步骤 将待测酶液用磷酸盐缓冲液适当稀释后，按下述顺序操作： 取3 支干净干燥试管，编号：1、空白；2、标准；3、样品。按下表步骤加入实（7）从样品管加尿素开始计时，准确反应5min ，立即向样品管（3号管）加1 mol ·L -1 H 2SO 4 1.00mL ，终止反应。 三、结果计算 脲酶活力（U · mL -1) = ( A 3 - A 1 ）* 标准管中的NH 3微摩尔数 ( A 2 - A 1 ) * min * 酶样品毫升数 式中：n 为酶样品的稀释倍数 四、仪器和试剂 1 、分光光度计、恒温水浴器、试管等。 2 、“有机溶剂沉淀法制备大豆脲酶”实验中制备的脲酶提取液和粗酶液，用磷

酸盐缓冲液适当稀释。 3 、3 ％尿素底物溶液：3g 高纯尿素用磷酸盐缓冲液溶解，并定容至100mL 。 4 、磷酸盐缓冲液（pH7.0）：6.70 g Na2HPO4 ·2 H2O , 3.2 5 g KH2PO4 ，溶于蒸馏水并定容至100 mL 。 5 、1 mol·L -1 H 2SO 4 溶液：56mL 浓硫酸，缓慢加入盛有约600 mL 蒸馏水的容 量瓶中，冷却后加水定容至1000mL。 6 、硫酸铵标准溶液：称取在60°C干燥至恒重的分析纯硫酸铵1.322g，蒸馏水溶解，并定容至100mL 。此溶液含NH3为40μmol·mL-1。 7 、纳氏试剂：分别溶解3 . 5g 氯化高汞（HgCl2）于20mL热蒸馏水，10g碘化钾于5 mL水中，再将前者慢慢倒入碘化钾溶液中，不断搅拌，直至出现微红色的少量沉淀为止。向此液中加70 mL30% KOH ，不断搅拌，再滴HgCl2溶液至出现红色沉淀为止。混匀，静置过夜，倾出清液贮于棕色试剂瓶（用橡皮塞）中放置暗处保存。 在有碘化汞情况下，可溶10 g HgI2和7 g KI于少量蒸馏水中，另溶16 gNaOH 于50mL 水中，待冷却后，将前者慢慢倒入其中，边加边搅拌，最后用水定容至100 mL 。过夜澄清后，倾出上清液存于棕色试剂瓶中。（配置方法之二）

脲酶活性的测定

大豆制品中脲酶活性的测定 定性法： 酚红法 一、原理： 酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶在pH=7.0，T=30℃时可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红的时间长短来判断脲酶活性的大小。 二、仪器和试剂： 粉碎机：粉碎时不产生强烈发热； 分析天平； 25ml纳式比色管； 恒温水浴锅； 0.1%酚红指示剂：0.1g苯酚红溶于100ml 95%乙醇溶液； 结晶尿素； 三、方法： 将试样粉碎，准确称取0.05±0.001g试样于25ml纳式比色管，加入0.2g结晶尿素及5滴酚红指示剂，加入25ml蒸馏水，摇动10s，立即置于30±0.5℃水浴锅中，开始计时，观察溶液颜色变化， 5min 后，取出比色管，摇匀，观察溶液颜色。 空白试验：不加尿素，其他同上。 品质判定：如果溶液为明显的粉红色，则认为该大豆制品脲酶活性超标，为不合格产品。

?0-1min变红，活性非常强（＞1.0）； ?1-2min变红，活性大概0.5-1.0； ?2-5min变红，活性大概0.3-0.5。 四、注意事项： 1.粉碎样品时，不应产生大量热，否则会影响结果判定； 2.称量样品时，一定要将样品混合均匀，否则会造成试验误差； 3.试样和空白试验同时操作，过程要迅速，防止时间影响。

尿素-酚红法 一、原理： 酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红样品占所有样品的比例来判断脲酶活性的大小。 二、仪器和试剂： 表面皿； 0.2N氢氧化钠溶液：称取0.8g氢氧化钠溶于100ml蒸馏水； 1.0N硫酸溶液：移取7.0ml浓硫酸溶于500ml蒸馏水； 尿素-酚红试剂：用500ml烧杯将0.8g酚红溶于20ml 0.2N氢氧化钠溶液，用蒸馏水稀释至约300ml，加入60g尿素，并溶解之，转移至2L容量瓶，冲洗烧杯数次,加蒸馏水至约1.5L，加入9.4ml 1.0N 硫酸溶液，用蒸馏水定容至2L；此时溶液应具有明亮的琥珀色；（过段时间溶液会变为深橘红色，可滴入稀硫酸溶液搅拌之，直至溶液再次变为琥珀色） 三、方法： 将一满匙样品放入表面皿中，摊平，将以调好的尿素-酚红试剂滴入表面皿中的样品上，直至完全浸湿，停留5min，观察样品的颜色反应。如果红斑面积多于20%，则认为该样品脲酶活性超标，为不合格产品。 四、注意事项： 1.对于样品较粗、具有大块状的样品，最好将其稍微粉碎，亦不

实验五 固定化脲酶活力的测定

实验五固定化脲酶活力的测定 一、实验原理 固定化酶的活力测定方法，有振荡测定法、酶柱测定法和连续测定法等多种方法。常用的振荡测定法，是将一定质量的固定化酶放在一定形状和大小的容器中，加入一定量的底物溶液，在固定化酶的最适反应条件下，振荡或搅拌反应系统，反应一定的时间后，取出一定量的反应液，进行酶活力测定。酶活力测定的反应原理和方法与溶液酶活力的测定方法相同：脲酶催化尿素水解生成氨和二氧化碳，最适反应pH 7.0。氨与纳氏试剂反应生成黄色配合物，其吸光度与氨浓度成正比。故可测定脲酶活力的大小。 二、仪器和试剂 1、水浴锅，分光光度计，移液管，比色皿及其他常规仪器 2、实验四制备的固定化脲酶 3、磷酸缓冲液（pH 7.0）：6.7 g Na2HPO4.2H2O，3.25 g KH2PO4，溶于蒸馏 水并定容至100 ml 4、3%尿素溶液：3 g尿素溶于磷酸缓冲液中，并定容至100 ml 5、标准氨溶液：称取在60℃干燥至恒重的分析纯硫酸铵1.322 g，蒸馏水溶 解并定容至100 ml。此溶液含NH3为40 μM 6、1 M H2SO4溶液：56 ml浓硫酸，缓慢加入盛有600 ml蒸馏水容量瓶中， 冷却后加水定容至1000 ml 7、纳氏试剂：称取16 g氢氧化纳，溶于50 mL水中，充分冷却至室温。另 称取7 g碘化钾和10 g碘化汞(HgI2)溶于水，然后将此溶液在搅拌下徐徐 注入氢氧化纳溶液中，用水稀释至100 mL，过夜澄清后，倒出上清液贮 于棕色瓶中，密塞保存。 三、实验步骤 1、将实验四中得到的凝胶包埋脲酶重新称重（m1）。取0.3-0.5 g，切碎。 2、取两支试管编号（1号空白管，3号样品管），分别称取凝胶包埋脲酶100 mg（m2）置于两管中，各加入蒸馏水9 ml，磷酸缓冲液1 ml，于30℃水 浴中保温5 min。

豆粕中尿酶活性测定

豆粕中酶活性测定 尿酶(Urease)：生大豆中含不等量尿酶，尿酶本身无营养意义，但是它与抗胰蛋白酶含量接近，而且遇热失活的程度与抗胰蛋白酶相似，因此以尿酶活性用作豆粕加工适宜度的简单估测指标。但是加工适宜度不仅取决于畜种、年龄和畜禽阶段，也取决于大豆品种及储存状况。严寒损伤的大豆储存6个月以上，则抗胰蛋白酶含量会增加，但是未受损伤的大豆就没有这种现象。 附录A大豆制品中尿素酶活性测定方法 GB/T 8622-1988 A.1 适用范围 本标准适用于由大豆制得的产品和副产品中尿酶活性的测定。本法可确认大豆的湿热处理程度。 A.2 定义 本标准所指尿素酶活性定义如下： 在(30±0.5)℃和pH7的条件下，每分钟每克大豆制品分解尿素所释放的氨态氮的毫克数。 A.3 原理 将粉碎的大豆制品与中性尿素缓冲溶液混合，在30℃保持30min，尿素酶催化尿素水解产生氨的反应。用过量盐酸中和所产生的氨，再用氢氧化钠标准溶液回滴。 A.4 仪器设备 A.4.1 样品筛：孔径200mm; A.4.2 酸度计：精度0.02pH，附有磁力搅拌器和滴定装置;

A.4.3 恒温水浴：可控温(30±0.5)℃; A.4.4 试管：直径18mm，长150mm，有磨口塞子; A.4.5 精密计时器; A.4.6 粉碎机：粉碎时应不生强热(例如球磨机) A.4.7 分析天平：感量0.0001g; A.4.8 移液管：10mL。 A.5 试剂和溶液 A.5.1 尿素：分析纯; A.5.2 磷酸氢二钠：分析纯; A.5.3 磷酸二氢钾：分析纯; A.5.4 尿素缓冲溶液(pH6.9至7.0)：4.45g磷酸氢二钠和3.40g磷酸二氢钾溶于水并稀释至1000mL，再将30g尿素溶在此缓冲溶液中，可保存1个月。 A.5.5 盐酸：分析纯，c(HCL)=0.1mol/L溶液; A.5.6 氢氧化钠：分析纯，c(NaOH)=0.1mol/L标准溶液。 A.6 试样的制备 用粉碎机将10g试样粉碎，使之全部通过样品筛。对特殊试样(水分或挥发物含量较高而无法粉碎的产品)应先在实验室温度下进行预干燥，再进行粉碎，当计算结果时应将干燥失重计算在内。 A.7 测定步骤 称取约0.2g已粉碎的试样，称准至0.1mg，转入试管中(如活性很高只称0.05g试样),移

脲酶的测定方法

一、脲酶测定(比色法) 脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。 1、试剂配制： （1）pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g 氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7， 并用水稀释至2L。 （2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL 丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。称取27g氢 氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。使用前，取A、B 两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。 （3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，（1.9g次氯酸钠溶于1L水中）溶液稳定。 （4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。 （5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL 含0.1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。 2、操作步骤 称取5ｇ土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15ｍｉｎ; 往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ6.7),仔细混匀。在37℃恒温箱中培养24ｈ。然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。取滤液1mL置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至10mL,然后加入4mL苯酚钠溶液,并立即加入3mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后,立 即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,在波长578ｎｍ处测定吸光值。脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态 氮量。

大学创新大赛饲用大豆及其制品中脲酶活性快速检测管

第十届大学生创新大赛 竞赛作品 作品名称：饲用大豆及其制品中豚酶活性快速检测管学院：生物工程学院 申报者姓名 （集体名称）___________ 类别： □自然科学类学术论文 □哲学社会科学类社会调查报告和学术论文 □科技制作（投入较大的）

V小发明创造 饲用大豆及其制品中腮酶活性 快速检测管研究报告 摘要：饲用大豆及其制品中含有胰蛋白酶抑制剂等抗营养因子，动物采食后会出现腹泻、胰腺肿大等症状，导致生产性能下降。胰蛋白酶抑制剂的活性不易测定，但是由于蛋白酶抑制剂是一种蛋白质，对热的敏感性与腺酶相似，且两者共存，因此，本设计通过测定饲用大豆及其制品中麻酶活性来间接反映胰蛋白酶抑制剂的活性。由于麻酶在室温下可将尿素水解生成氨，氨可使酚红指示剂变红且反应时间与腺酶活性具有相关性，因此将尿素缓冲液及酚红指示剂以一定的比例制备反应体系。在比色管反应体系中直接加入待测饲用大豆及其制品，根据反应时间带入拟合方程，计算麻酶活性。应用该检测管可以快速、准确、直观的检测饲用大豆及其制品中腺酶活性，进而对胰蛋白酶活性进行监测，从而判定饲用大豆及其制品的饲用安全性。

关键词：大豆豆粕服酶活性胰蛋白酶抑制剂快速检测管

一、研究背景及意义 饲料工业是现代畜牧业和水产养殖业发展的物质基础，直接关系到农业、农村经济发展和人民生活质量，已经成为国民经济的重要基础产业之一，在促进养殖业健康可持续发展、农民增收方面和改善人民的生活质量等方面发挥了重要的作用。饲料安全问题日趋严重，有效解决饲料安全问题是保证饲料工业可持续发展的关键，也是保证动物源性食品安全的重要措施之一。因此饲料安全检测变得尤为重要，饲料安全的快速检测技术，则为饲料安全的监督和检测提供重要的技术支撑。随着饲料安全问题的相继曝光，由饲料安全问题引发的食品安全问题已经成为民众日常关心的热点和焦点。为此，国家相关部门加大了饲料的监管、监测力度。为了满足饲料安全监督的即时性需要, 迫切需要一些快速、方便、准确的检测技术，尤其是对某种或某类特别物质的快速检测，对提高饲料安全的监督和管理具有重要的作用。 大豆，及其制品是优良的植物性蛋白质饲料，同时含有丰富的矿物质与维生素，是目前世界范围内动物饲料原料中最常用的植物性蛋白饲料。但是，大豆中也含有影响动物对饲料中营养物质的消化、吸收和利用的抗营养因子和一些有毒物质，如麻酶、胰蛋白酶抑制剂、植物性红细胞凝集素、皂昔等。当抗营养因子的含量超过动物的耐受范围时会影响到动物的健康和生产性能。大豆及其制品中的胰蛋白酶抑制剂是影响动物安全食用的重要指标之一，由于其和腺酶都属于水溶性蛋白质，加热处理时都会失去活性，而且失活的速率大致相同，因此他们的活性指

两种脲酶活性定性测定方法及比较

两种脲酶活性定性测定方法及比较 随着膨化技术在饲料工业中推广普及，越来越多的饲料生产商在配方中使用膨化大豆粉，与其它蛋白资源一样，大豆的适度熟化非常重要，熟化程度低会含抗胰蛋白酶等营养抑制因子，熟化度过高又会导致氨基酸利用率低。判断膨化大豆粉是否合格的主要指标是脲酶活性。脲酶活性是指：在30±5℃和PH值等于7的条件下，每分钟每克膨化大豆分解尿素所释放的氨态氮的毫克数。脲酶本身无营养意义，但它与抗胰蛋白酶的含量接近，并且遇热变性失活的程度与抗胰蛋白酶相似，因此，尿酶活性用来作为膨化大豆加热是否合适的间接估测指标。脲酶活性没有负值，最低为0。在我国现行的国标推荐值为0.3，在美国一般认为以不超过0.2为宜，并且针对日粮中有尿素的反刍动物而言不得超过0.12，当然对于家禽和猪0.3或稍高都可以接受。国内很多大企业一般均采用0.2。 实验室定量测定脲酶活性的方法较复杂，有滴定法和pH增值法两种，已有研究表明两者对同一样品测得的数值也不相等。目前国内绝大部分企业都采用快速而简单的简易判定方法定性地估测脲酶活性，一般来说，主要有如下两种方法。 一.液态法 1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨，会使酚红指示剂改变颜色。 2.试剂 2.1尿素:GB696，分析纯。 2.2酚红指示剂 2.2.1称取0.1g酚红，加1.43mL0.1mol/L氢氧化钠溶液，在研钵中研磨以促溶解； 2.2.2转移至250mL定量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀备用。 3.操作方法 3.1取0.2g粉末样品，置于25mL比色管中。 3.2加0.02g尿素，加酚红指示剂2滴，再加水20mL，充分摇匀15s。 3.3记录粉红色出现时间，并根据时间判断尿酶活性，颜色出现时间应少于15min。 颜色出现时间脲酶活性 1min 极强 1～5min 强 5～15min 稍有 15min 无

土壤脲酶的测定方法

土壤脲酶的测定方法 脲酶试验原理：存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶、能酶促有机物质分子中酶键的水解。脲酶的作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和碳酸。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法是测定生成的氨量。 试剂： 1）甲苯 2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。 3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184克柠檬酸和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000毫升。 4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）。将AB溶液保存在冰箱中。使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。 5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。 6）氮的标准溶液：a 精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至

1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的标准液 标准曲线绘制：吸取配置好的氮溶液10ml，定容至100ml，即稀释了10倍，吸取1，3，5，7，9，11，13ml移至50ml容量瓶，加水至20ml，再加入4ml苯酚钠，仔细混合，加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。取新鲜土壤7份，每份30g，装于棕色广口瓶中，先将1，3－二氯丙烯溶于丙酮（定量），6份分别加入不同浓度均为1.5ml的1，3－二氯丙烯，使之在土壤中的浓度分别为1、10、50、100、200、500μg/g，另1份相应加入1.5ml的丙酮作为对照，然后调节土壤的含水量至最大田间持水量的60%（记录此时重量，以便补充水分）。放置于25℃恒温培养箱，培养后第0d、1d，5d，10d（前10d密封，后来测定的敞口）、20d，30d，40d，50d分别取土样检测脲酶的活性。取样前，反复旋转广口瓶，混匀土样，一个处理随机取3个重复。 1) 称取5g过1mm筛的风干土样于100ml容量瓶中 2)向容量瓶中加入1ml甲苯（以能全部使土样湿润为度）并放置15分钟 3)之后加入10ml 10％尿素溶液和20ml柠檬酸缓冲液（PH6.7），并仔细混合 4)将容量瓶放入37摄氏度恒温箱中，培养24h 5)培养结束后，用热至38摄氏度水稀释至刻度，仔细摇荡，并将悬液用致密滤纸过滤于三角瓶中。

脲酶活性

随着膨化技术在饲料工业中推广普及，越来越多的饲料生产商在配方中使用膨化大豆粉，与其它蛋白资源一样，大豆的适度熟化非常重要，熟化程度低会含抗胰蛋白酶等营养抑制因子，熟化度过高又会导致氨基酸利用率低。判断膨化大豆粉是否合格的主要指标是脲酶活性。脲酶活性是指：在30±5℃和PH值等于7的条件下，每分钟每克膨化大豆分解尿素所释放的氨态氮的毫克数。脲酶本身无营养意义，但它与抗胰蛋白酶的含量接近，并且遇热变性失活的程度与抗胰蛋白酶相似，因此，尿酶活性用来作为膨化大豆加热是否合适的间接估测指标。脲酶活性没有负值，最低为0。在我国现行的国标推荐值为0.3，在美国一般认为以不超过0.2为宜，并且针对日粮中有尿素的反刍动物而言不得超过0.12，当然对于家禽和猪0.3或稍高都可以接受。国内很多大企业一般均采用0.2。 实验室定量测定脲酶活性的方法较复杂，有滴定法和pH增值法两种，已有研究表明两者对同一样品测得的数值也不相等。目前国内绝大部分企业都采用快速而简单的简易判定方法定性地估测脲酶活性，一般来说，主要有如下两种方法。 一.液态法 1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨，会使酚红指示剂改变颜色。 2.试剂 2.1尿素:GB696，分析纯。 2.2酚红指示剂 2.2.1称取0.1g酚红，加1.43mL0.1mol/L氢氧化钠溶液，在研钵中研磨以促溶解； 2.2.2转移至250mL定量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀备用。 3.操作方法 3.1取0.2g粉末样品，置于25mL比色管中。 3.2加0.02g尿素，加酚红指示剂2滴，再加水20mL，充分摇匀15s。 3.3记录粉红色出现时间，并根据时间判断尿酶活性，颜色出现时间应少于 15min。 颜色出现时间脲酶活性 1min 极强

豆粕尿素酶活性的测定

豆粕中尿素酶活性的测定（PH差值法） 1.参考标准 无 1.适用范围 适用于用PH增值法测定豆粕中脲酶活性的方法。 2.原理 豆粕中的脲酶可以使用尿素分解产生氨，使体系中pH增加，用pH计测定pH 变化，以判断脲酶活性。 3.仪器和工具 4.1粉碎机 4.2可调节温度的恒温水浴锅 4.3酸度计：精确至0.01 4.4碘瓶：50ml 4.5天平：感量0.01g 4.6天平：感量0.1g 4.7秒表 4.试剂 5.1磷酸二氢钾（KH 2PO 4 ） 5.2磷酸氢二钾（K 2HPO 4 ） 5.3 50%磷酸二氢钾溶液5.4 50%磷酸氢二钾溶液 5.5 尿素[CO(NH 2) 2 ] 5.6 pH7.00磷酸缓冲液：用天平（4.6）称取磷酸二氢钾（5.1）17.1g溶于100ml 蒸馏水，再称取 烘干的磷酸氢二钾(5.2)21.7g于100ml蒸馏水，将这两种溶液的混合液共配制5000ml。并用酸度计(4.3)调节pH值，pH小于7.00时，加入少量50%磷酸氢二钾溶液（5.4），当pH大于7.00时，加入少量50%磷酸二氢钾溶液(5.3)，最终使得缓冲液的pH为7.00(±0.01)。 5.7 pH7.00尿素缓冲液：用天平（4.6）称取尿素（5.5）150.0g，溶于5000ml 磷酸缓冲液（5.6） 中。并用酸度计(4.3)调节pH值，pH小于7.00时，加入少量50%磷酸氢二钾溶液（5.4），当pH大于7.00时，加入少量磷酸二氢钾溶液(5.3)，最终使得缓冲液的pH为7.00(±0.01)。 5.操作步骤 用粉碎机（4.1）粉碎样品，用天平（4.5）分别称取三份样品约0.80g（± 0.02g）的样品于3 个50ml的碘瓶（4.4）中，其中两个加40ml尿素缓冲液（5.7），另一个加入40ml磷酸缓冲液(5.6)（空白），塞上塞子，摇匀后放入30℃（±1℃）的恒温水浴锅中，用秒表(4.7)准确计时，每10分钟摇匀一次，反应30分钟后，在5分钟内用酸度计(4.3)测定pH值。样品取平均值。 6.结果计算 脲酶活性（pH值上升值）=试样的pH测定值-空白的pH测定值。 7.重复性

生化实验六脲酶测定参考

实验六脲酶测定 一、实验原理 有些生物化学反应中指示反应完成，经常使用直观的指示剂指示，如氧化还原指示剂和酸碱指示剂。氧化还原指示剂是氧化状态下和还原状态下各有不同颜色；酸碱指示剂是指示生物化学反应前后溶液的酸碱度变化，不同酸碱度各有不同颜色。 这里进行一次酶促反应试验，人的血液中和尿液中都含有尿素，尿素的含量变化是许多病变的重要指标。尿酶可作用于尿素，它的反应如下： (NH2)2C=O + H2O 尿酶2NH3 +CO2 尿酶可以定量测定尿素含量，尿酶通常可从大豆粉中提取，本试验用大豆粉和玉米粉提取尿酶，通过上述反应观察两种植物种子中尿酶的含量。在与底物尿素的作用反应中，分别加入三种指示剂A、B、C，但在制备指示剂的过程中忘记了瓶号，只知道三种是中性红、百里香酚兰和亚甲兰，其中有酸碱指示剂和氧化还原指示剂。 二、实验目的 1、确定两种植物种子中谁含大量的脲酶； 2、分出谁是氧化还原指示剂，谁是酸碱指示剂。 三、实验器材及试剂 1、仪器设备 电子天平，4只100ml三角瓶，14支试管，试管架，2个三角漏斗，50ml量筒，玻璃棒，移液器及吸头，脱脂棉 2、试剂 30%乙醇溶液，2%尿素溶液，指示剂A,B,C(中性红，亚甲蓝，百里香酚蓝） 3、材料 大豆粉，玉米粉 四、实验准备 仪器设备：电子天平（每五组一个，共5个/班），4只100ml三角瓶（共需要100个/班），14支试管（共需要350支/班），试管架（25个/班），2个三角漏斗（共需要50个/班），50ml量筒（25个/班），玻璃棒（25根/班），移液器及吸头（蓝，黄吸头各一盒，每种各25盒/班），脱脂棉（若干每组，尽量多一些） 试剂：30%乙醇溶液（80ml/组，共2L/班），2%尿素溶液（12ml/组，共300ml/班），指示剂A,B,C(中性红，亚甲蓝，百里香酚蓝）（各需2滴或3滴，适合即可）

脲酶Km值测定

实验十脲酶Km值测定 一、目的 脲酶是氮素循环的一种关键性酶，它催化尿素与水作用生成碳酸铵，在促进土壤和植物体内尿素的利用上起有重要作用。对其进行多方面研究，早已引起人们重视。通过本实验，学习脲酶Km值的测定方法。 二、原理 脲酶催化下列反应： 在碱性条件下，碳酸铵与奈氏试剂作用产生橙黄色的碘化双汞铵。在一定范围内，呈色深浅与碳酸铵量成正比。故可用比色法测定单位时间内酶促反应所产生的碳酸铵量，从而求得酶促反应速度。 在保持恒定的最适条件下，用相同浓度的脲酶催化不同浓度的尿素发生水合反应。在一定限度内，酶促反应速度与脲浓度成正比。用双倒数作图法可求得脲酶的Km值。 三、仪器、试剂和材料 1．仪器 （1）试管16 ×160mm 21支 （2）吸管0.5ml×15，lml×1，Zml×1，10ml×1 （3）漏斗5个 （4）721型分光光度计 （5）电热恒温水浴 （6）离心机 （7）康氏振荡机 2．试剂 （1）1／10 mol／L脲15.015g，水溶后定容至250ml。 （2）不同浓度脲液用1／10 mol／L 脲稀释成1／20、1／30、1／ 40、l／50 mol／L的脲液。 （3）1 ／15 mo／L pH7．0磷酸盐缓冲液Na2HPO4 5.969g，水溶后定容至250ml。NaH2PO4 2.268g，水溶后定容至250ml。取Na2HPO4溶液60ml，NaH2PO4溶液40ml混匀，即为1／15 mol／L pH7.0磷酸盐缓冲液。 （4）10％硫酸锌20g ZnSO4溶于200ml蒸馏水中。 （5）0.5 mol／L氢氧化钠5g NaOH，水溶后定容至250ml。 （6）10％酒石酸钾钠20g酒石酸钾钠溶于200ml蒸馏水中。

脲酶定性的实验

脲酶定性的实验 随着膨化技术在饲料工业中推广普及,越来越多的饲料生产商在配方中使用膨化大豆粉,与其它蛋白资源一样,大豆的适度熟化非常重要,熟化程度低会含抗胰蛋白酶等营养抑制因子,熟化度过高又会导致氨基酸利用率低. 判断膨化大豆粉是否合格的主要指标是脲酶活性.脲酶活性是指：在30±5℃和PH值等于7的条件下,每分钟每克膨化大豆分解尿素所释放的氨态氮的毫克数.脲酶本身无营养意义,但它与抗胰蛋白酶的含量接近,并且遇热变性失活的程度与抗胰蛋白酶相似,因此,尿酶活性用来作为膨化大豆加热是否合适的间接估测指标.脲酶活性没有负值,最低为0.在我国现行的国标推荐值为0.3,在美国一般认为以不超过0.2为宜,并且针对日粮中有尿素的反刍动物而言不得超过0.12,当然对于家禽和猪0.3或稍高都可以接受.国内很多大企业一般均采用0.2. 实验室定量测定脲酶活性的方法较复杂,有滴定法和pH增值法两种,已有研究表明两者对同一样品测得的数值也不相等.目前国内绝大部分企业都采用快速而简单的简易判定方法定性地估测脲酶活性,一般来说,主要有如下两种方法. 一.液态法 1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨,会使酚红指示剂改变颜色. 2.试剂 2.1尿素:GB696,分析纯. 2.2酚红指示剂 2.2.1称取0.1g酚红,加1.43mL0.1mol/L氢氧化钠溶液,在研钵中研磨以促溶解； 2.2.2转移至250mL定量瓶中,加蒸馏水至刻度,摇匀备用. 3.操作方法 3.1取0.2g粉末样品,置于25mL比色管中. 3.2加0.02g尿素,加酚红指示剂2滴,再加水20mL,充分摇匀15s. 3.3记录粉红色出现时间,并根据时间判断尿酶活性,颜色出现时间应少于15min. 颜色出现时间脲酶活性 1min 极强 1～5min 强 5～15min 稍有 15min 无 同时作空白对照试验. 样品空白(不加尿素)及试剂空白(不加样品),只有上述空白正常时,即酚红指示剂不改变颜色,试验结果才是可靠的. 一般企业认为7、8分钟变色较为合适. 二、半固态法 1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨,会使酚红指示剂改变颜色. 2.试剂 2.1稀硫酸（H2SO4）0.2N.

土壤脲酶活性的测定

靛酚蓝比色法测定土壤脲酶的活性 一、实验原理 靛酚蓝比色法的基本原理是：被测物浸提剂中的NH4+，在强碱性介质中与次氯酸盐和苯酚反应，生成水溶性染料靛酚蓝，其深浅与溶液中的NH4+－N含量呈正比，线性范围为0.05~0.5mg/l之间。 靛酚蓝反应原理如下: NH3 + OCl——NH2 Cl +OH- 三、实验试剂 1） 10%尿素：称取10g尿素，用蒸馏水溶至100ml。 2）柠檬酸盐缓冲液（PH=6.7）：184克柠檬酸和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000毫升。 3）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量无水乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用无水乙醇稀释至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）。将AB溶液保存在冰箱中。使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。 4）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。（9ml—100ml中）5）氮的标准溶液（0.1mg/ml）：精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的标准液。 6）甲苯 四、实验过程 1.标准曲线的测定 吸取10ml氮的标准溶液定容至100ml，摇匀。从其中分别吸取0，1.00，3.00，5.00，7.00，10.00ml 13.00ml移至50ml比色管中，加水至20ml，再加入4ml苯酚钠的溶液，充分混合。紧接着加入3ml次氯酸钠，随加随摇匀，放置20分钟,用水稀释至刻度。将显色液在可见分光光度计上于578nm处，以1cm比色皿进行比色测定，以试剂空白为参比。以标准溶液氮含量为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。 2.土样中脲酶活性的测定 分别称取2g过1mm筛的风干土样于50ml锥形瓶中，向其中加入1ml甲苯，以使土样全部湿润为宜。放置15分钟后，加入10ml 10％尿素溶液和20ml柠檬酸缓冲液（pH=6.7），并摇匀。将锥形瓶放入37℃恒温箱中，培养24h。培养结束后，用热至38℃水稀释至刻度，充分摇荡，并将悬液用滤纸过滤到锥形瓶中。 设置有土无基质对照，即考察各种溶液和土壤中氨氮存在带来的影响。相当于其他实验中所做的空白对照。 分别吸取（1-3ml）滤液于50ml容量瓶中，加蒸馏水至20ml，充分震荡，然后加入4ml 苯酚钠，充分混合，再加入3ml次氯酸钠充分摇荡，放置20分钟，用水稀释至刻度，溶液呈

大豆制品中尿素酶活性测定方法

大豆制品中尿素酶活性测定方法 1 适用范围 本标准适用于由大豆制得的产品和副产品中尿素酶活性的测定。本法可确认大豆制品的湿热处理程度。 2 定义 本标准所指尿素酶活性定义如下： 在30±0.5℃和pH7的条件下, 每分钟每克大豆制品分解尿素所释放的氨态氮的毫克数。 3 原理 将粉碎的大豆制品与中性尿素缓冲溶液混合，在30℃保持30min, 尿素酶催化尿素水解产生氨的反应。用过量盐酸中和所产生的氨，再用氢氧化钠标准溶液回滴。 4 仪器设备 4.1 样品筛: 孔径200μm; 4.2 酸度计: 精度0.02pH, 附有磁力搅拌器和滴定装置; 4.3 恒温水浴: 可控温30±0.5℃; 4.4 试管: 直径18mm, 长150mm, 有磨口塞子; 4.5 精密计时器; 4.6 粉碎机: 粉碎时应不生强热(例如球磨机) 4.7 分析天平: 感量0.1mg; 4.8 移液管: 10ml。 5 试剂和溶液 5.1 尿素(GB 696-77): 分析纯; 5.2 磷酸氢二钠(GB 1263-77): 分析纯; 5.3 磷酸二氢钾(GB 1274-77): 分析纯;

5.4 尿素缓冲溶液(pH 6.9至 7.0): 4.45g磷酸氢二钠(5.2)和3.40g磷酸二氢钾(5.3)溶于水并稀释至1000ml, 再将30g尿素(5.1)溶于此缓冲溶液中, 可保存1个月。 5.5 盐酸(GB 622-77): 分析纯, 0.1M溶液; 5.6 氢氧化钠(GB 629-77): 分析纯, 0.1M标准溶液, 按GB 601标准溶液制备方法的规定配制。 6 试样的制备 用粉碎机(4.6)将10g试样粉碎, 使之全部通过样品筛(4.1)。对特殊试样（水分或挥发物含量较高而无法粉碎的产品）应先在实验室温度下进行预干燥，再进行粉碎，当计算结果时应将干燥失重计算在内。 7 测定步骤 称取约0.2g已粉碎的试样, 称准至0.1mg, 转入试管(4.4)中(如活性很高只称0.05g试样)移入10ml尿素缓冲溶液(5.4), 立即盖好试管并剧烈摇动, 马上置于30±0.5℃恒温水浴(4.3)中, 准确计时保持30min。即刻移入10ml盐酸溶液(5.5), 迅速冷却到20℃。将试管内容物全部转入烧杯，用5ml水冲洗试管两次, 立即用氢氧化钠标准溶液(5.3)滴定至pH4.70。 另取试管作空白试验，移入10ml尿素缓冲液（5.4），10ml盐酸溶液(5.5)。称取与上述试样量相当的试样, 也称准至0.1mg, 迅速加入此试管中。立即盖好试管并剧烈摇动。将试管置于30±0.5℃的恒温水浴, 同样准确保持30min, 冷却至20℃, 将试管内容物全部转入烧杯, 用5ml水冲洗试管两次，并用氢氧化钠标准溶液(5.3) 滴定至pH4.70。 8 测定结果的计算 8.1 计算方法 以每分钟每克大豆制品释放氮的毫克量表示的尿素酶活U, 按下式计算: 14×C(V0-V) U＝──────

脲酶测定方法

这是测得的水稻土壤的几种酶的方法，应该说许多作物酶的方法应该大同小异，我就把几种酶的测定集中在一块了。若有雷同，也是不可避免的。 脲酶urease（水解酶）： 脲酶试验原理： 存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶、能酶促有机物质分子中酶键的水解。脲酶的作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和碳酸。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。 土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法是测定生成的氨量。 试剂：1）甲苯 2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。 3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184克柠檬酸和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000毫升。 4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）。将AB溶液保存在冰箱中。使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。 5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。 6）氮的标准溶液：a 精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的标准液 标准曲线绘制：吸取配置好的氮溶液10ml，定容至100ml，即稀释了10倍，吸取1，3，5，7，9，11，13ml移至50ml容量瓶，加水至20ml，再加入4ml苯酚钠，仔细混合，加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。 取新鲜土壤7份，每份30g，装于棕色广口瓶中，先将1，3－二氯丙烯溶于丙酮（定量），6份分别加入不同浓度均为1.5ml的1，3－二氯丙烯，使之在土壤中的浓度分别为1、10、50、100、200、500μg/g，另1份相应加入1.5ml 的丙酮作为对照，然后调节土壤的含水量至最大田间持水量的60%（记录此时重量，以便补充水分）。放置于25℃恒温培养箱，培养后第0d、1d，5d，10d （前10d密封，后来测定的敞口）、20d，30d，40d，50d分别取土样检测脲酶的活性。取样前，反复旋转广口瓶，混匀土样，一个处理随机取3个重复。

实验十 豆粕中尿素酶活性的测定

实验十豆粕中尿素酶活性的测定 一、实验目的 掌握测定尿素酶活性的各种方法的基本原理及方法步骤。 二、实验原理 将粉碎的大豆制品与中性尿素缓冲溶液混合，在30℃保持30min后，尿素酶催化尿素水解产生氨的反应。用过量的盐酸溶液中和所产生的氨，再用氢氧化标准溶液回滴。 三、实验设备 1、样品筛：孔径200μm； 2、酸度计：精度0.02pH，附有磁力搅拌器和滴定装置； 3、恒温水浴：可控温30±0.5℃； 4、试管：直径18mm，长1 50mm，有磨口塞子； 5、精密计时器； 6、粉碎机：粉碎时应不生强热（如球磨机 7、分析天平．感量0.1mg； 8、移液管；10mL。 四、实验内容 称取约0.2g已粉碎的试样，称准至0.1mg，转入试管中，（如活性很高的样品，可只称0.05g试样），移入10ml尿素缓冲溶液，立即盖好试管并剧烈摇动，马上置于30±0.5℃恒温水浴中，准确计时保持30min。即刻移人10m1盐酸溶液，迅速冷却到20℃。 将试管内容物全部转入烧杯，用5ml水冲洗试管两次，立即用氢氧化钠标准溶液滴定到pH4.70 。 另取试管作空白试验，移人10ml尿素缓冲液，10ml盐酸溶液。称取与上述试样量相当的试样，也称准至0.1mg，迅速加入此试管中。立即盖好试管并剧烈摇动，将试管置于30±0.5℃的恒温水浴，同样准确保持20min，冷却至20℃，将试管内容物全部转入烧杯，用5mL水冲洗试管两次，并用氢氧化钠标准溶液滴定至pH 4.70。 以每分钟每克大豆制品释放氨的mg量来表示尿素酶的活性（UA），可按下式计算： m V V C UA ?- ?= 30) ( 14 式中：C—氢氧化钠标准溶液浓度（mo1/L）； V0一空白试验消耗氢氧化钠溶液体积（m1）； V—测定试样消耗氢氧化钠溶液体积（m1）； m—试样质量（g）。 若试样经粉碎前的预干燥处理时，则其计算如下：

尿素酶活性定性检测

尿素酶的测定（定性） 1.试剂: 1.10.62%苯酚红乙醇溶液 2、测定方法: 将试样粉碎,称0.2g试样转入试管中,加入0.2g结晶尿素,3-5滴苯酚红指示剂，加20-30mL蒸馏水摇动10秒钟，于30度水浴中观察溶液颜色，记录呈现粉红色时的时间。 3、尿素酶活性的结果表示： 1min内呈粉红为:活性很强;区 1-5 min内呈粉红为:活性强; 5-15 min内呈粉红为:有点活性; 15--30 min内呈粉红为: 无活性; 美国大豆协会方法： 1、原理：在有指示剂酚红存在的条件下，豆粕中的尿素酶活性可按尿素转变成氨 的方法定性测定。 2、试剂： 2.1 稀硫酸（H2SO4）0.2N或更稀些，带滴管。 2.2 尿素—酚红试剂： a、将1.2克酚红溶解于30毫升0.2N的NaOH中； b、用蒸馏水将之稀释至300毫升； c、加入90克尿素并溶解之，用蒸馏水稀释至2升； d、加入14毫升1.0N的H2SO4（或0.2N的H2SO4），用蒸馏水稀释至3升； e、溶液应具明亮的琥珀色。 3、测定步骤： 3.1在一个150毫升的烧杯中到入少量试剂，注意溶液必须呈明亮的琥珀色。若溶液 已转为深橘红色，滴入稀硫酸溶液并搅拌之，直至溶液再度呈琥珀色。 3.2量一汤匙粉碎好的豆粕粉，放置于培养皿中，在样品上加入两汤匙试剂，轻轻搅 拌，将样品平铺于培养皿中。若仍有干豆粕斑点，则再加入试剂，直至将豆粕浸湿。 3.3放置5分钟后观察： No.1 没有任何红点出现：再任其放置25分钟，若仍无红点出现，说明豆粕过熟。 No.2 有少数红点：少量尿素酶活性，豆粕可用。 No.3 豆粕表面约有25%为红点覆盖：少量尿素酶活性，豆粕可用。 No.4 豆粕表面约有50%为红点覆盖：有尿素酶活性。 No.5 豆粕表面约有75-100%为红点覆盖：尿素酶活性很高，不应该接受这种原料，因为豆粕过生。

大豆饼粕生熟度的快速检测

大豆饼粕生熟度的快速检测 [目的要求] 了解大豆制品中尿素酶活性测定原理及注意事项，并掌握多种快速测定饲料中尿素酶活性的方法。 一、试纸法 [原理] 大豆饼粕中的尿素酶可使尿素水解释放出氨。氨呈碱性，可使溶液PH 升高，红色石蕊试纸变成蓝色。 [仪器设备] 1、植物粉碎机 2、恒温水浴锅：2孔 3、天平：感量0.01g 4、带塞三角瓶：250ml [试剂] 1、尿素：分析纯 2、石蕊试纸：红色 [测定步骤] 取尿素0.1g置于250ml带塞三角瓶中。将被检试样磨细至0.45mm，取试样粉0.1g，加水100ml，加塞于45℃的水浴中加热，每隔15min轻轻摇晃几下，1h后从水浴中移出。取红色石蕊试纸一条浸入此溶液中，如试纸变蓝表示豆饼粕是生的，若试纸不变色，则说明豆饼粕是熟的。 二、酚红法 [原理] 酚红指示剂在PH6.4~8.2时由黄变红，大豆制品中所含的脲酶，在室温下将尿素水解，产生氨，释放出的氨可使酚红指示剂变红，根据变红时间长短来判断脲酶活性大小。 [仪器设备]

1、植物粉碎机 2、天平：感量0.01g 3、试管： [试剂与溶液] 1、尿素：分析纯 2、95%乙醇 3、酚红溶液：称取0.1g的酚红溶于100ml 95%乙醇中。 [测定步骤] 将试样粉碎至0.45mm，称取0.2g试样，移入试管中，加入0.02g 尿素及2滴酚红指示剂，再加入20~30ml蒸馏水，摇动10s。观察颜色变化，并记下呈粉红色的时间。 [尿素酶活性的测定结果判断] 1、1min内呈粉红色为活性很强，表示豆粕生。 2、1~5min内呈粉红色为活性强，表示豆粕生。 3、5~15min内呈粉红色表示活性弱，为合格。 4、15~30min内呈粉红色为没有活性，为过熟粕。 三、尿素-苯酚磺试剂法 [原理] 用苯酚磺作指示剂，按尿素转变成氨的多少及显色度，定性测定大豆饼粕中脲酶的活性。 [仪器设备] 植物粉碎机、玻璃吸管 [试剂与溶液] 1、尿素：分析纯 2、苯酚红：分析纯 3、0.2mol/L氢氧化钠溶液 4、0.1mol/L硫酸溶液 5、尿素-苯酚磺试剂：将1.2g苯酚红溶于30ml0.2mol/L氢氧化钠溶液中，

脲酶测定方法

脲酶urease（水解酶）： 脲酶试验原理： 存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶、能酶促有机物质分子中酶键的水解。脲酶的作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和碳酸。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。 土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法是测定生成的氨量。 试剂：1）甲苯 2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。 3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184克柠檬酸和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000毫升。 4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）。将AB溶液保存在冰箱中。使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。 5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。 6）氮的标准溶液：a 精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的标准液 标准曲线绘制：吸取配置好的氮溶液10ml，定容至100ml，即稀释了10倍，吸取1，3，5，7，9，11，13ml移至50ml容量瓶，加水至20ml，再加入4ml苯酚钠，仔细混合，加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。 取新鲜土壤7份，每份30g，装于棕色广口瓶中，先将1，3－二氯丙烯溶于丙酮（定量），6份分别加入不同浓度均为1.5ml的1，3－二氯丙烯，使之在土壤中的浓度分别为1、10、50、100、200、500μg/g，另1份相应加入1.5ml 的丙酮作为对照，然后调节土壤的含水量至最大田间持水量的60%（记录此时重量，以便补充水分）。放置于25℃恒温培养箱，培养后第0d、1d，5d，10d （前10d密封，后来测定的敞口）、20d，30d，40d，50d分别取土样检测脲酶的活性。取样前，反复旋转广口瓶，混匀土样，一个处理随机取3个重复。 1) 称取5g过1mm筛的风干土样于100ml容量瓶中。 2) 向容量瓶中加入1ml甲苯（以能全部使土样湿润为度）并放置15分钟 3) 之后加入10ml 10％尿素溶液和20ml柠檬酸缓冲液（PH6.7），并仔细混合 4) 将容量瓶放入37摄氏度恒温箱中，培养24h 5) 培养结束后，用热至38摄氏度水稀释至刻度，仔细摇荡，并将悬液用致密滤纸过滤于三角瓶中。