蛋白质检测方法
蛋白质的检测(参考 GB/T6432-94 )
一、原理凯氏定氮法测定试样中的含氮量，即在催化剂作用下，用浓
硫酸破坏有机物，使含氮物转化为硫酸铵。加入强碱进行蒸馏使氮溢
出，再用酸滴定，测出氮含量，将结果乘以换算系数6.25 ，计算出粗
蛋白含量。
二、试剂
( 1) 硫酸化学纯，含量为98%，无氮；
(2)混合催化剂0.4g硫酸铜，含5个结晶水，6g硫酸钾或硫酸钠，均
为化学纯，磨碎混匀；
( 3) 氢氧化钠化学纯，40%水溶液( m/V)；
( 4) 硼酸化学纯，2%水溶液( m/V)；
( 5) 混合指示剂甲基红0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为3 个月；
( 6) 盐酸标准溶液基准无水碳酸钠法标定；
a)0.1mol/l盐酸标准溶液：8.3mL盐酸注入1000mL蒸馏水中。
b)0.02mol/l盐酸标准溶液：1.67mL盐酸注入1000mL蒸馏水中。( 7) 蔗糖分析纯；
( 8) 硫酸铵分析纯，干燥；
(9)硼酸吸收液1%硼酸水溶液1000mL加入0.1%溴甲酚绿乙醇溶液
10mL 0.1%甲基红乙醇溶液7mL 4%氢氧化钠水溶液，混合, 置阴凉
处保存期为1 个月(全自动程序用)
三、仪器设备
（2）分样筛孔径0.45mm（40 目）；
（3）分析天平感重0.0001g ；
（4）消煮炉或电炉；
（5）滴定管酸式，10、25mL
（6）凯氏烧瓶250mL；
（7）凯氏蒸馏装置常量直接蒸馏式或半微量水蒸气蒸馏式；
（8）锥形瓶150、250mL
（9）容量瓶100mL；
（10）消煮管250mL；
（11）定氮仪以凯氏原理制造的各类型半自动、全自动蛋白质测定仪。
四、分析步骤
（一）仲裁法
1?试样的消煮称取试样0.5-1g （含氮量5-80mg）（精确至
0.0002g），
放入凯式烧瓶中，加入6.4g混合催化剂，与试样混合均匀，再加入12mL硫酸和2粒玻璃珠，将凯式烧瓶置于电炉上加热，开始小
火，待样品焦化、泡沫消失后，再加强活力（360-410 C）直至呈透明的蓝绿色，然后再继续加热，消化全过程至少2h。
2.氨的蒸馏
（1）常量蒸馏法将试样消煮液冷却，加入60-100mL蒸馏水，摇匀,
冷却。将蒸馏装置的冷凝管末端浸入装有25mL硼酸吸收液和2
滴混合指示剂的锥形瓶内。然后小心地向凯式烧瓶中加入50mL 氢氧化钠溶液，轻轻摇动凯式烧瓶，使溶液混匀后再加热蒸馏，直至流出液体体积为100mL降下锥形瓶，使冷凝管末端离开液面，继续蒸馏1-2min ，并用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均流入锥形瓶
内，然后停止蒸馏。
2)半微量蒸馏法将试样消煮液冷却，加入20mL 蒸馏水，转入
100mL 容量瓶中，冷却后用水稀释至刻度，摇匀，作为试样分解
液。将半微量蒸馏装置的冷凝管末端浸入装有20mL硼酸吸收液和2 滴混合指示剂的锥形瓶内。蒸汽发生器的水中应加入甲基红指示剂数滴，在蒸馏过程中保持此液为橙红色，否则需补充硫酸。准确移取试样分解液10-20mL注入蒸馏装置的反应室中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，塞好入口玻璃塞，再加10mL 氢氧化钠溶液，小心提起玻璃塞使之流入反应室，将玻璃塞塞好，且在入口处加水密封，防止漏气。蒸馏4min 降下锥形瓶使冷凝管末端离开吸收液面，再蒸馏
1mi n,用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均流入锥形瓶内，然后停止蒸馏。注：两种蒸馏法测定结果相近,可任选一种。
3)蒸馏步骤的检验精确称取0.2g 硫酸铵,代替试样,选仲裁法或推荐
法“氨的蒸馏”中的步骤进行操作,测得硫酸铵含量为
21.19%±0.2%,否则应检查加碱、蒸馏和滴定各步骤是否正确。
二) 推荐法
1?试样的消煮称取0.5-1g试样（含氮量5-80mg）（精确至
0.0002g ）, 加入消化管中，加2片消化片（仪器自备）或6.4g混合
催化剂，与420C下在消煮炉上消化1h。取出冷却后加入30mL蒸馏水。
2.氨的蒸馏采用全自动定氮仪时，按仪器本身常量程序进行测定。
采用半自动定氮仪时，将带消化液的管子插在蒸馏装置上，以25mL 硼酸为吸收液，加入2滴混合指示剂，蒸馏装置的冷凝管末端要浸入装有吸收液的锥形瓶内，然后向消煮管中加入50mL氢氧化钠溶液进行蒸馏。蒸馏时间以吸收液体积达到100mL为宜。降下锥形瓶，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均流入锥形瓶内。
3.滴定用O.1mol/L的盐酸标准溶液滴定吸收液，溶液由蓝色变成红色
为终点。
五、空白测定
称取蔗糖0.5g，代替试样，进行空白测定，消耗0.1mol/L盐酸溶液的体积不得超过0.2mL。消耗0.02mol/L盐酸标准溶液体积不得超过
0.3mL。
六、分析结果的计算和表述
计算见下式：
（V2 -VI） x c x 0.0140 x x 100%
粗蛋白质二
式中：V2——滴定试样时所需标准酸溶液体积，mL;
V 1 ---- 滴定空白时所需标准酸溶液体积，mL;
c ------ 盐酸标准溶液浓度，mol/L ;
试样质量，g
V ——试样分解液总体积，mL
V '——试样分解液蒸馏用体积，mL；
0.0140 ——与I.OOmL盐酸标准液【c (HCL =1.000mol/L ]
相当的、以克表示的氮的质量。
6.25 ——氮换算成蛋白质的平均系数。
七、重复性
当粗蛋白质含量在25%以上时，允许相对偏差为1%。
当粗蛋白质含量在10%-25%以上时，允许相对偏差为2%。
当粗蛋白质含量在10%以下时，允许相对偏差为3%。
浙江紫香糖业使用的定氮仪是上海新嘉
型号：KDN-AZ智能型定氮仪蒸馏器
KDN-A萃能型定氮仪是我公司根据用户对仪器自动化的需求进行
改进的一款半自动凯氏测定装置，在A型的基础上安装了自动蒸
馏控制元件，使原本繁琐的蒸馏控制更为简便，提升了工作效率，保证了样品测定的精准性，并且加装了自动排水系统，用户不用担心因蒸发炉水未排尽而造成下次开机出现烧保险丝的烦恼。
测定范围：0.1-200mg 氮(0.05%~95%)
重现性：1%相对误差(包括消化步骤)
回收率：99.5%-100%( 1~200mg氮)
耗能：800W
外形尺寸：380*330*750
重量( KG)：26
可根据需要搭配消化炉）
(整理)6种方法测定蛋白质含量.
6种方法测定蛋白质含量 一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： NH2CH2COOH+3H2SO4――2CO2+3SO2+4H2O+NH3(1) 2NH3+H2SO4――(NH4)2 SO4(2) (NH4)2 SO4+2NaOH――2H2O+Na2SO4+2NH3(3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。 二、双缩脲法（biuret法） （一）实验原理 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材 1.试剂： （1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（bsa）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05NaOH配制。 （2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4?5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6?4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。 2.器材： 可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。 （三）操作方法 1.标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20～25℃）下放置30分
6种方法测定蛋白质含量
6种方法测定蛋白质含量 [ 文章来源： | 文章作者： | 发布时间：2006-12-25| 字体： [大 中 小] 一、微量凯氏（kjeldahl ）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： nh 2ch 2cooh+3h 2so 4——2co 2+3so 2+4h 2o+nh 3 (1) 2nh 3+h 2so 4——(nh 4)2so 4 (2) (nh 4)2so 4+2naoh ——2h 2o+na 2so 4+2nh 3 (3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入cuso4作催化剂，k2so4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得 样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。 二、双缩脲法（biuret 法） （一）实验原理 双缩脲（nh3conhconh3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与cuso4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg 蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris 缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材
食品中蛋白质的测定方法
食品中蛋白质的测定方法 蛋白质的测定方法分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，即含氮量，肽链和折射率测定蛋白质含量，另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸、碱性基团和芳香基团测定蛋白质含量。但是食品种类很多，食品中蛋白质含量又不同，特别是其他成分，如碳水化合物，脂肪和维生素的干扰成分很多，因此蛋白质的测定通常利用经典的剀氏定氮法是由样品消化成铵盐蒸馏，用标准酸 液吸收，用标准酸或碱液滴定，由样品中含氮量计算出蛋白质的含量。由于食品中蛋白质含量不同又分为凯氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它们的基本原理都是一样的。 一凯氏定氮法 我们在检验食品中蛋白质时，往往只限于测定总氮量，然后乘以蛋白质核算系数，得到蛋白质含量，实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物，故称为粗蛋白质。 (一) 、常量凯氏定氮法 衡量食品的营养成分时，要测定蛋白质含量，但由于蛋白质组成及其性质的复杂性，在食品分析中，通常用食品的总氮量表示，蛋白质是食品含氮物质的主要形式，每一蛋白质都有其恒定的含氮量，用实验方法求得某样品中的含氮量后，通过一定的换算系数。即可计算该样品的蛋白质含量。 一般食品蛋白质含氮量为l6 ％，即1份氮素相当于6.25 分蛋白质,以此为换算系数6.25 ，不同类的食物其蛋白质的换算系数不同. 如玉米、高梁、荞麦, 肉与肉制品取6.25 ，大米取 5.95 、小麦粉取 5.7, 乳制品取 6.38 、大豆及其制品取5.17 ，动物胶 5.55 。 测定原理： 食品经加硫酸消化使蛋白质分解，其中氮素以氨的形式与硫酸化合成硫酸铵。然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收形成硼酸铵，再用盐酸标准溶液或硫酸标准溶液滴定，根据盐酸消耗量计算出总氮量，再乘以一定的数值即为蛋白质含量，其化学反应式如下。 ⑴消化反应：有机物(含C、N、H、0、P、S等元素)+H2S04 -T(NH4)2SO4+CO0 +S02f +S03+H3PO4+C02 (2) 蒸馏反应：(NH4)2SO4+2NAOH—2NH3T +2H2O+NA2SO4 2NH3+4H3B04 (NH4)2B4O7+5H2O (3) 滴定反应：(NH4)2B4O7+2HCH+5H2O T2NH4CH+4H3BC或(NH4)2B407+H2S04+5H20- (NH4)9SO4+4H2BO2 试剂与仪器： 1、硫酸钾； 2、硫酸铜；
蛋白质含量测定方法及其比较资料2
蛋白质含量测定法（一） 蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩脲法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 五种蛋白质测定方法比较
值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。 考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。 一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： NH2CH2COOH+3H2SO4——2CO2+3SO2+4H2O+NH3 (1) 2NH3+H2SO4——(NH4)2SO4 (2) (NH4)2SO4+2NaOH——2H2O+Na2SO4+2NH3 (3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。 二、双缩脲法（Biuret法） （一）实验原理 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材
研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结-实验步骤
研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结-实验步骤 蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。把原来spaces空间上的一篇蛋白质与蛋白质间相互作用研究方法转来，算是实验技巧分类目录的首篇。(另补充2：检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较) 一、酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。 二、噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。 三、等离子共振技术 表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。
蛋白质含量测定方法汇总
实验七蛋白质含量测定 测定蛋白质的定量方法有很多，目前常用的有染料法，双缩脲(Biuret)法，酚试剂法(Lowry)法及紫外吸收法。 [目的要求] 1．掌握测定蛋白质的含量基本方法。 2．了解染料法、双缩脲法、Lowry法和紫外吸收法测定原理。 一、染料法 [实验原理] 在酸性溶液中染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，此时考马斯亮蓝G-250颜色从红色变为蓝色，吸收高峰从460nm移至595nm。利用这个原理可以测定蛋白质含量。 该法近年在某些方面有取代经典的Lowry法趋势，因为它操作简单，反应时间短，染料-蛋白质颜色稳定，抗干扰性强。本法的缺点是：对于那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质，有一定误差，因为不同的蛋白质与染料的结合是不同的，故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质。 [器材] 吸量管；试管；721型分光光度计 [试剂] 1.标准牛血清白蛋白溶液：配成0.1mg/ml的溶液。 2.待测蛋白质溶液。 3.染料溶液：称取考马斯亮蓝G-250 0.1g溶于95%的酒精50ml，再加入85%的浓磷酸100ml，用水稀释至1000ml,混匀备用。
[操作步骤] 1．标准曲线的绘制： 按上表分别向各支试管内加入各种试剂，充分混匀，5min后在595nm波长处以0号管调零,测定各管吸光度值（A）。以吸光度值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。 2．样品测定： 取1ml样品溶液（约含25～250微克蛋白质），加入染料溶液5ml混匀，5min后测定其595nm吸光度值，对照标准曲线求得蛋白质浓度。 二、双缩脲(Biuret)法测定蛋白质含量 [实验原理] 在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO-NH2)，或与此相似的基团[如—CH2-NH2，—CS-NH2，—C(NH)NH2]的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH—)，可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量
蛋白质测定方法之双缩脲法(Biuret法)
一）实验原理 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材 1.试剂： （1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml 的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N NaOH配制。 （2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4?5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6?4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。 2.器材： 可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。 （三）操作方法 1.标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。 2、样品的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。 三、Folin—酚试剂法（Lowry法） （一）实验原理
蛋白质定量检测方法
Bradford法蛋白定量（Bradford Protein Assay ） Bradford Assay is a rapid and accurate method commonly used to determine the total protein concentration of a sample. The assay is based on the observation that the absorbance maximum for an acidic solution of Coomassie Brilliant Blue G-250 shifts from 465 nm to 595 nm when binding to protein occurs. Both hydrophobic and ionic interactions stabilize the anionic form of the dye, causing a visible color change. Within the linear range of the assay (~5-25 mcg/mL), the more protein present, the more Coomassie binds. Reference Bradford, M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. (1976) 72, 248-254. 考马斯亮蓝染色法(Bradford法)测定蛋白质含量 原理 1976年Bradford建立了用考马斯亮蓝G250与蛋白质结合的原理，迅速、敏感的定量测定蛋白质的方法。染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收的改变，从465nm变为595nm，光吸收增加。蛋白质-染料复合物具有高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度，最低检出量为1μg蛋白。染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约需2min，结合物的颜色在1h内是稳定的。一些阳离子，如K+，Na+，Mg2+，(NH4)2SO4，乙醇等物质不干扰测定，而大量的去污剂如TritonX100，SDS等严重干扰测定，少量的去污剂可通过用适当的对照而消除。由于染色法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。 操作 一、标准方法 取含10～100μg蛋白质溶液于小试管中，用双蒸水或缓冲液调体积到0.1mL，然后加入5mL蛋白试剂，充分振荡混合，2min后于595nm测定光吸收值。以0.1mL 双蒸水或缓冲液及5mL蛋白试剂作为空白对照。 二、微量蛋白分析法 取含1～10μg蛋白质溶液，用双蒸水调体积到0.8mL，加0.2mL蛋白试剂，充分振荡混合，2min后于595nm测定光吸收值，以0.8mL双蒸水及0.2mL蛋白试剂作为空白对照。用不同浓度的蛋白质溶液作标准曲线，以蛋白质浓度为横坐
蛋白质检测方法
蛋白质的检测（参考GB/T6432-94） 一、原理 凯氏定氮法测定试样中的含氮量，即在催化剂作用下，用浓硫酸破坏有机物，使含氮物转化为硫酸铵。加入强碱进行蒸馏使氮溢出，再用酸滴定，测出氮含量，将结果乘以换算系数 6.25，计算出粗蛋白含量。 二、试剂 （1）硫酸化学纯，含量为98%，无氮； （2）混合催化剂 0.4g硫酸铜，含5个结晶水，6g硫酸钾或硫酸钠，均为化学纯，磨碎混匀； （3）氢氧化钠化学纯，40%水溶液（m/V）； （4）硼酸化学纯，2%水溶液（m/V）； （5）混合指示剂甲基红0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为3个月； （6）盐酸标准溶液基准无水碳酸钠法标定； a)0.1mol/l盐酸标准溶液：8.3mL盐酸注入1000mL蒸馏水中。 b)0.02mol/l盐酸标准溶液：1.67mL盐酸注入1000mL蒸馏水中。（7）蔗糖分析纯； （8）硫酸铵分析纯，干燥； （9）硼酸吸收液 1%硼酸水溶液1000mL，加入0.1%溴甲酚绿乙醇溶液10mL，0.1%甲基红乙醇溶液7mL，4%氢氧化钠水溶液，混合，置阴凉处保存期为1个月（全自动程序用）。
三、仪器设备 （1）实验室用样品粉碎机或研钵； （2）分样筛孔径0.45mm（40目）； （3）分析天平感重0.0001g； （4）消煮炉或电炉； （5）滴定管酸式，10、25mL； （6）凯氏烧瓶 250mL； （7）凯氏蒸馏装置常量直接蒸馏式或半微量水蒸气蒸馏式； （8）锥形瓶 150、250mL； （9）容量瓶 100mL； （10）消煮管 250mL； （11）定氮仪以凯氏原理制造的各类型半自动、全自动蛋白质测定仪。 四、分析步骤 （一）仲裁法 1.试样的消煮称取试样0.5-1g（含氮量5-80mg）（精确至0.0002g）， 放入凯式烧瓶中，加入6.4g混合催化剂，与试样混合均匀，再加入12mL硫酸和2粒玻璃珠，将凯式烧瓶置于电炉上加热，开始小火，待样品焦化、泡沫消失后，再加强活力（360-410℃）直至呈透明的蓝绿色，然后再继续加热，消化全过程至少2h。 2.氨的蒸馏 （1）常量蒸馏法将试样消煮液冷却，加入60-100mL蒸馏水，摇匀，
蛋白质检测方法
蛋白质的检测(参考 GB/T6432-94 ) 一、原理凯氏定氮法测定试样中的含氮量，即在催化剂作用下，用浓 硫酸破坏有机物，使含氮物转化为硫酸铵。加入强碱进行蒸馏使氮溢 出，再用酸滴定，测出氮含量，将结果乘以换算系数6.25 ，计算出粗 蛋白含量。 二、试剂 ( 1) 硫酸化学纯，含量为98%，无氮； (2)混合催化剂0.4g硫酸铜，含5个结晶水，6g硫酸钾或硫酸钠，均 为化学纯，磨碎混匀； ( 3) 氢氧化钠化学纯，40%水溶液( m/V)； ( 4) 硼酸化学纯，2%水溶液( m/V)； ( 5) 混合指示剂甲基红0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为3 个月； ( 6) 盐酸标准溶液基准无水碳酸钠法标定； a)0.1mol/l盐酸标准溶液：8.3mL盐酸注入1000mL蒸馏水中。 b)0.02mol/l盐酸标准溶液：1.67mL盐酸注入1000mL蒸馏水中。( 7) 蔗糖分析纯； ( 8) 硫酸铵分析纯，干燥； (9)硼酸吸收液1%硼酸水溶液1000mL加入0.1%溴甲酚绿乙醇溶液 10mL 0.1%甲基红乙醇溶液7mL 4%氢氧化钠水溶液，混合, 置阴凉 处保存期为1 个月(全自动程序用) 三、仪器设备
（2）分样筛孔径0.45mm（40 目）； （3）分析天平感重0.0001g ； （4）消煮炉或电炉； （5）滴定管酸式，10、25mL （6）凯氏烧瓶250mL； （7）凯氏蒸馏装置常量直接蒸馏式或半微量水蒸气蒸馏式； （8）锥形瓶150、250mL （9）容量瓶100mL； （10）消煮管250mL； （11）定氮仪以凯氏原理制造的各类型半自动、全自动蛋白质测定仪。 四、分析步骤 （一）仲裁法 1?试样的消煮称取试样0.5-1g （含氮量5-80mg）（精确至 0.0002g）， 放入凯式烧瓶中，加入6.4g混合催化剂，与试样混合均匀，再加入12mL硫酸和2粒玻璃珠，将凯式烧瓶置于电炉上加热，开始小 火，待样品焦化、泡沫消失后，再加强活力（360-410 C）直至呈透明的蓝绿色，然后再继续加热，消化全过程至少2h。 2.氨的蒸馏 （1）常量蒸馏法将试样消煮液冷却，加入60-100mL蒸馏水，摇匀,
常见蛋白质测定方法的总结与比较
分析化学 结课作业 常见蛋白质测定方法的总结与比较 材料科学与技术学院 林化13-1班 刘旺衢 130534106
常见蛋白质测定方法的总结与比较 刘旺衢 （北京林业大学材料科学与技术学院林化13-1班 130534106，10083） 蛋白质是构成生物体细胞组织的重要成分。食物中的蛋白质是人体中氮的唯一来源。具有糖类和脂肪不可替代的作用。蛋白质与营养代谢、细胞结构、酶、激素、病毒、免疫、物质运转、遗传等密切相关,是对人类最重要的物质之一。准确精密的测定蛋白质，关乎人类的生产、生活、生存。目前测定蛋白质含量的方法有多种,如凯氏定氮法、紫外吸收法、双缩脲法、考马斯亮蓝染色法、酚试剂法等几种方法,下面本文将总结比较这五种蛋白质的测定方法。 一、凯氏定氮法 凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准酸滴定，就可计算出样品中的氮量。由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。蛋白质是含氮的有机化合物。蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数计算蛋白质含量，即含氮量*6.25=蛋白含量。 凯氏定氮法具有灵敏度高, 样品用量少，最低可检出0.05mg氮；精密度、准确度高,平行误差一般小于0.5%；应用范围广,适用于一切形态的食品与生物样品；仪器装置简单,试剂廉价的优点。 但也存在操作比较繁琐费时,特别是蒸馏定氮过程的效率低,不利于大批样品的测定；定氮的结果既包括有机氮,也包括无机氮,有机氮中除蛋白氮外,还包括非蛋白氮,测定的结果只能是粗蛋白质的含量；在蛋白质氨基酸构成有差异的
蛋白质测定常用的几种方法
I. 紫外分光光度法测定蛋白质的含量 一、实验目的 掌握紫外分光光度法测定蛋白质的含量的方法。 二、实验原理 蛋白质分子中存在含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，使蛋白质对280nm的光波具有最 大吸收值，在一定的范围内，蛋白质溶液的吸光值与其浓度成正比，可作定量测定。该法操 作简单、快捷，并且测定的样品可以回收，低浓度盐类不干扰测定，故在蛋白质和酶的生化 制备中广泛被采用。但此方法存在以下缺点： 1．当待测的蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基含量差别较大是会产生一定的误差，故该法适 用于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的样品。 2．若样品中含有其他在280nm吸收的物质如核酸等化合物，就会出现较大的干扰。但核 酸的吸收高峰在260nm，因此分别测定280nm和260nm两处的光吸收值，通过计算可以适 当的消除核酸对于测定蛋白质浓度的干扰作用。但因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不 同的，虽经校正，测定结果还存在着一定的误差。 三、实验器材 1．紫外分光光度计 2．移液管 3．试管及试管架 4．石英比色皿 四、材料与试剂 1．标准蛋白质溶液：准确称取经凯氏定氮校正的牛血清清蛋白，配制成浓度为1mg/mL的溶液。2．待测蛋白溶液：酪蛋白稀释溶液，使其浓度在标准曲线范围内。 五、操作方法 1．标准曲线的制作 按表1加入试剂。 表1 标准曲线的制作 度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制出血清蛋白的标准曲线。 2．未知样品的测定 取待测蛋白质溶液1mL，加入3mL蒸馏水，在280nm下测定其吸光度值。并从标准曲
线上查出待测蛋白质的浓度。 II. Bradford法测定蛋白质的含量 一、实验目的 学习考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质的原理和方法。 二、实验原理 1976年Bradford建立了用考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合的原理，迅速而准确的定量蛋白质的方法。染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收光的改变，从465nm变为595nm。蛋白质-染料复合物具有高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度（最低检出量为1μg）。染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约只需2min，结合物的颜色在1h内是稳定的。一些阳离子（如K+，Na+，Mg2+），（NH4）2SO4，乙醇等物质不干扰测定，而大量的去污剂如TritonX-100，SDS等严重干扰测定，少量的去污剂可通过用适当的对照而消除。由于染色法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛用于蛋白质含量的测定。 三、实验器材 1．天平 2．分光光度计 3．试管及试管架 4．比色皿 5．移液管 四、材料与试剂 1．考马斯亮蓝G-250：称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL95%乙醇中，加入100mL85%（W/V）磷酸，将溶液用水稀释到1000mL。[试剂的终含量为：0.01%考马斯亮蓝G-250，4.7%（W/V）乙醇，和8.5%（W/V）磷酸]。 2．标准蛋白质溶液：可用牛血清白蛋白预先经凯氏定氮法测定蛋白含氮量，根据其纯度配制成0.1mg/mL的溶液。 3．未知样品液。 五、操作方法 1．牛血清蛋白标准曲线的制作 取6支试管，编号为1、2、3、4、5、6，按表2加入试剂。 表2 牛血清蛋白标准曲线的制作
粗蛋白测定方法
粗蛋白测定方法—凯式定氮法 粗蛋白crude protein；crude matter（DM）食品、饲料中一种蛋白质含量的度量。不仅包括蛋白质这一物质，它涵盖的范围更广，包括含氮的全部物质，及真蛋白质和含氮物（氮化物）。换句话说，粗蛋白是食品、饲料中含氮化合物的总称，食物中以大豆的粗蛋白含量最高，肉类次之。所以说，粗蛋白是一种既包括真蛋白又包括非蛋白的含氮化合物，后者又可能包括游离氨基酸、尿素、硝酸盐和氨等。然而，不同蛋白质的氨基酸组成不同，其氮含量不同，总氮量换算成蛋白质的系数也不同。总之，粗蛋白是食品、饲料中一种蛋白质含量的度量。我们可以通过粗蛋白测定仪即凯氏定氮仪来测量粗蛋白的含量，测量步骤如：蛋白质含氮量约为16%（这已通过多次试验得出），再用凯氏法测出总氮量，再乘以就可求得粗蛋白的含量。 一、实验原理 蛋白质是由碳、氢、氧、氮及少量硫元素组成。这些元素在蛋白质中含量都有一定比例关系，其中含碳50～55%、氢6～8%、氧20～23%、氮15～17%和硫～%。此外在某些蛋白质中还含有微量的磷、铁、锌、铜和钼等元素。 由于氮元素是蛋白质区别于糖和脂肪的特征，而且绝大多数蛋白质的氮元素含量相当接近，一般恒定在15～17%，平均值为16%左右，因此在蛋白质的定量分析中，每测得1克氮就相当于克蛋白质。所以只要测定出生物样品中的含氮量，再乘以，就可以计算出样品中的蛋白质含量。含氮有机物与浓硫酸共热，被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，氮进一步与硫酸作用生成硫酸铵。由大分子分解成小分子的过程通常称为”消化”。为了加速消化，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高消化液的沸点(290℃→400℃)，加入硫酸铜作为催化剂，过氧化氢作为氧化剂，以促进反应的进行。反应(1)(2)在凯氏烧瓶内完成，反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行，其特点是将蒸汽发生器、蒸馏器及冷凝器三个部分融为一体。由于蒸汽发生器体积小，节省能源，本仪器使用方便，效果良好。 硫酸铵与浓碱作用可游离出氨，借水蒸气将产生的氨蒸馏到一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的H+浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来H+浓度为止，最后根据所用标准酸的量计算出待测物中总氮量。 二、仪器和试剂
蛋白质检测方法汇总
蛋白质检测方法汇总 2010-04-26 12:00:38| 分类：蛋白电泳| 标签：|字号大中小订阅 本文引用自啸月天狼《蛋白质检测方法汇总》 更多相关资料请查看https://www.360docs.net/doc/3d13471051.html, 蛋白质检测方法汇总 本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。 了解各种测定方法的基本原理和优缺点。 蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford 法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。 在选择方法时应考虑： ①实验对测定所要求的灵敏度和精确度； ②蛋白质的性质； ③溶液中存在的干扰物质； ④测定所要花费的时间。 考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。 一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： CH2COOH | + 3H2SO4--------- 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1) NH2 2NH3 + H2SO4 -------- ---(NH4)2SO4 (2) (NH4)2SO4 + 2NaOH ----------- 2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。 五种蛋白质测定方法比较如下： 方法灵敏度时间原理干扰物质说明 凯氏定氮法（Kjedahl法）灵敏度低，适用于0.2~ 1.0mg氮，误差为±2％费时8～10小时将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长 双缩脲法（Biuret法）灵敏度低1～20mg 中速20~30分钟多肽键＋碱性Cu2＋?紫色络合物硫酸铵；Tris缓冲液；某些氨基酸用于快速测定，但不太灵敏；不
蛋白质结晶方法大总结.
蛋白质结晶方法大总结 1.1结晶方法(Crystallization Techniques) 1.1.1 分批结晶(Batch Crystallization) 这是最老的最简单的结晶方法，其原理是同步地在蛋白质溶液中加入沉淀剂，立即使溶液达到一个高过饱和状态。幸运的话，不需进一步处理即可在过饱和溶液中逐渐长出晶体。一个用于微分批结晶的自动化系统已被Chayen等人设计出（1991，1992），其微分批方法中，他们在1-2μl包含蛋白质和沉淀剂的液滴中生长晶体。液滴被悬浮在油（如石蜡）中，油的作用是作为封层以防止蒸发，它并不干扰普通沉淀剂，但是干扰能溶解油的有机溶剂(Chayen, 1997; see also Chayen, 1998)。 1.1.2 液-液扩散(Liquid–Liquid Diffusion) 这种方法中，蛋白质溶液和含有沉淀剂的溶液是彼此分层在一个有小孔的毛细管中，一个测熔点用的毛细管一般即可（如图1.2）。下层是密度大的溶液，例如浓硫酸铵或PEG溶液。如果有机溶剂如MPD被用作沉淀剂，它会在上层。以1：1混合，沉淀剂的浓度应该是所期最终浓度的二倍。两种溶液（各自约5μl）通过注射器针头导入毛细管，先导入下层的。通过一个简易的摇摆式离心机去除气泡。再加入上层，进而两层之间形成一个明显的界面，它们会逐渐彼此扩散。 Garc′?a-Ruiz and Moreno（1994）已经发展液-液扩散技术至针刺法。蛋白质溶液通过毛细力被吸入狭窄的管中，管的一端是封闭的。接着，开放端被插入置于小容器的凝胶中，凝胶使得管竖直，蛋白质溶液与凝胶接触。含有沉淀剂的溶液被倒在凝胶上，整个装置被保存于封闭的盒子以防蒸发。沉淀剂通过凝胶和毛细管的扩散时间可以由毛细管插入凝胶的深度控制，从而蛋白质溶液中即可形成过饱和区域，毛细管底部高而顶部低。这也可作为一个筛选最佳结晶条件的额外信息。 1.1.3 蒸气扩散（Vapor Diffusion） 1.1.3.1 悬滴法（The Hanging Drop Method）这种方法中，在一个硅化的显微镜盖玻片上通过混合3-10μl蛋白质溶液和等量的沉淀剂溶液来制备液滴。盖玻片置于一个盘子的凹槽之上，凹槽的一部分填有所需的沉淀剂溶液约1ml。在盖玻片放好之前，小室的凹槽周围用油或油脂密封（如图3）。 1.1.3.2 沉滴法（The Sitting Drop Method）在悬滴法中，如果蛋白质溶
蛋白质测定实验报告
蛋白质测定方法——化学报告
蛋白质的检测 酚试剂法灵敏度较高 20~250mg 费时蛋白质在碱性溶 液中其肽键与 Cu2+螯合，形成 蛋白质一铜复合 物，此复合物使 酚试剂的磷钼酸 还原，产生蓝色 化合物 酚类、柠檬 酸、硫酸铵、 tris缓冲液、甘 氨酸、糖类、 甘油等均有干 扰作用
由上表可大致了解五种检测蛋白质的方法，下面以实验的形式进行详细阐述： 1 材料与方法 1.1 仪器材料 (1)仪器:凯氏定氮仪、紫外分光光度计、可见光分光光度计、工作离心机、布氏漏斗、抽滤泵。 (2)试剂及原材料:牛奶、酸奶、豆浆、0.12mol/LpH=4. 7醋酸- 醋酸钠缓冲液、乙醇-乙醚等体积混合液、浓H2SO4 、40%氢氧化钠、30%过氧化氢、2%硼酸溶液、0. 050molPL标准盐酸溶液、硫酸钾- 硫酸铜接触剂、混合指示剂、标准蛋白溶液、双缩脲试剂、考马斯亮蓝G- 250试剂。 1.2 实验方法 (1)凯氏定氮法测定蛋白质含量 将待测样品与浓硫酸共热,含氮有机物即分解产生氨(消化) ,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。为了加速消化,可以加入CuSO4 作催化剂和加入K2SO4 以提高溶液的沸点,而加入30%过氧化氢有利于消化溶液的澄清。消化好的样品在凯氏定氮仪内经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至定量硼酸溶液中,然后用标准盐酸溶液进行滴定,记录,计算出样品含氮量。每个样品做三次重复测定,取平均值。 (2)紫外吸收法测定蛋白质含量 蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收峰在280nm处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。 紫外吸收法简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。低浓度的盐,例如,
各种蛋白标签汇总
各种蛋白标签汇总 蛋白标签 蛋白标签(ｐroｔeinｔag)就是指利用DＮＡ体外重组技术,与目得蛋白一起融合表达得一种多肽或者蛋白,以便于目得蛋白得表达、检测、示踪与纯化等。随着技术得不断发展,研究人员相继开发出了具有各种不同功能得蛋白标签。目前,这些蛋白标签已在基础研究与商业化产品生产等方面得到了广泛得应用。 ?标签得分子量小,只有~０、84KD,而GSＴ与蛋白Ａ分别为～26KＤ与~3０KD,一般不影响目标蛋白得功能; ?Ｈis标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在得条件下或变性条件下纯化,前者在纯化疏水性强得蛋白得到应用,后者在纯化包涵体蛋白时特别有用,用高浓度得变性剂溶解后通过金属螯与亲与层析去除杂蛋白,使复性不受其它蛋白得干扰,或进行金属螯与亲与层析复性; ?Ｈis标签融合蛋白也被用于蛋白质—蛋白质、蛋白质－DＮA相互作用研究; ?His标签免疫原性相对较低,可将纯化得蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 ?可应用于多种表达系统,纯化得条件温与; ?可以与其它得亲与标签一起构建双亲与标签、 Flag标签蛋白
Flag标签蛋白为编码8个氨基酸得亲水性多肽(DＹKDＤDDK),同时载体中构建得Ｋoｚak序列使得带有FL ＡG得融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。ＦLAG作为标签蛋白,其融合表达目得蛋白后具有以下优点: ?FLＡG作为融合表达标签,其通常不会与目得蛋白相互作用并且通常不会影响目得蛋白得功能、性质,这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 ?融合FLAG得目得蛋白,可以直接通过FＬAG进行亲与层析,此层析为非变性纯化,可以纯化有活性得融合蛋白,并且纯化效率高、 ?FLAG作为标签蛋白,其可以被抗FＬＡG得抗体识别,这样就方便通过WｅｓterｎBｌot、ELＩSA等方法对含有FLAＧ得融合蛋白进行检测、鉴定。 ?融合在N端得FLAG,其可以被肠激酶切除(DＤＤＫ),从而得到特异得目得蛋白。因此现ＦＬAG 标签已广泛得应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等相关领域。 ＭBP(麦芽糖结合蛋白) ＭBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白大小为40kDa,由大肠杆菌K１2得mａlＥ基因编码、MBP可增加在细菌中过量表达得融合蛋白得溶解性,尤其就是真核蛋白。ＭBP标签可通过免疫分析很方便地检测。有必要用位点专一得蛋白酶切割标签。如果蛋白在细菌中表达,MBP可以融合在蛋白得Ｎ端或Ｃ端。纯化:融合蛋白可通过交联淀粉亲与层析一步纯化。结合得融合蛋白可用10mＭ麦芽糖在生理缓冲液中进行洗脱。结合亲与力在微摩尔范围。一些融合蛋白在0、2%Triｔon X—100或0.２５％Tｗｅen20存在下不能有效结合,而其她融合蛋白则不受影响、缓冲条件为ｐH7、0到8。５,盐浓度可高达1M,但不能使用变性剂。如果要去除MBP融合部分,可用位点特异性蛋白酶切除。 检测:可用MＢP抗体或表达得目得蛋白特异性抗体检测。 GST(谷胱甘肽巯基转移酶) GＳT(谷胱甘肽巯基转移酶) 标签蛋白本身就是一个在解毒过程中起到重要作用得转移酶,它得天然大小为２6KD、将它应用在原核表达得原因大致有两个,一个就是因为它就是一个高度可溶得蛋白,希望可以利用它增加外源蛋白得可溶性;另一个就是它可以在大肠杆菌中大量表达,起到提高表达量得作用。GST融合表达系统广泛应用于各种融合蛋白得表达,可以在大肠杆菌与酵母菌等宿主细胞中表达。结合得融合蛋白在非变性条件下用1０mM还原型谷胱甘肽洗脱。在大多数情况下,融合蛋白在水溶液中就是可溶得,并形成二体。GST标签可用酶学分析或免疫分析很方便得检测、标签有助于保护重组蛋白免受胞外蛋白酶得降解并提高其稳定性。在大多数情况下GＳT融合蛋白就是完全或部分可溶得。?纯化:该表达系统表达得GST标签蛋白可直接从细菌裂解液中利用含有还原型谷胱甘肽琼脂糖凝胶(Gｌｕtaｔhionｅseｐｈarose)亲与树 脂进行纯化。GST标签蛋白可在温与、非变性条件下洗脱,因此保留了蛋白得抗原性与生物活性。ＧSＴ在变性条件下会失去对谷胱甘肽树脂得结合能力,因此不能在纯化缓冲液中加入强变性剂如:盐酸胍或尿素等、?如果要去除GＳT融合部分,可用位点特异性蛋白酶切除。?检测:可用GＳT抗体或表达得目得蛋白特异性抗体检测。 ＨA HＡ标签蛋白,标签序列YPYDVＰDYA,源于流感病毒得红细胞凝集素表面抗原决定簇,9个氨基酸,对外源靶蛋白得空间结构影响小, 容易构建成标签蛋白融合到Ｎ端或者C端。易于用Anti-HA抗体检测与EＬISA 检测、 ｃ－Mｙｃ Ｃ—Ｍyc 标签蛋白,就是一个含１1个氨基酸得小标签,标签序列Glu—Glｎ－Lys—Leu-Iｌe－Ｓeｒ—Ｇlu—Ｇlｕ—Ａｓp—Ｌeu,这11个氨基酸作为抗原表位表达在不同得蛋白质框架中仍可识别其相应抗体。Ｃ—Ｍｙc tａg已成功应用在Westeｒn-ｂlot杂交技术、免疫沉淀与流式细胞计量术中, 可用于检测重组蛋白质在靶细胞中得表达。