ABC法亲和素与生物素系统的操作流程
ABC法亲和素与生物素系统的操作流程
亲和素—生物素—过氧化物酶复合物法是许世明于1981年在BAB法和LAB法的基础上改良的，其特点是利用亲和素分别连接生物素标记的第二抗体和生物素标记的酶。ABC法与LAB法、BAB法不同的是第一抗体不为生物素所标记，生物素标记的第二抗体与ABC复合物相连接，最后进行显色反应定位。
复合物是将过氧化物酶结合在生物素上，再将生物素—过氧化物酶连接物与过量的亲和素反应而制备的。ABC法与LAB法、BAB法相比较具有敏感性高、特异性强、背景染色淡等优点。
ABC法染色流程如下。
(1)4um石蜡切片常规脱蜡至水，PBS洗3X3min。
(2)IHC的前处理视特异性一抗不同，可采用蛋白酶消化或热诱导的微波抗原修复(AR)，PBS洗3X3min。
(3)3％过氧化氢孵育10min(可省略)，以阻断内源性过氧化物酶活性。
(4)PBS洗3X3min。
(5)10％非免疫性动物血清孵育10min(可省略)，以减少非特异性背景，无需冲洗只需吸去多余血清。
(6)滴加适当稀释的第一抗体，37℃孵育60min或4℃过夜。
(7)PBS洗3X3min。
(8)滴加生物素标记的二抗，37℃孵育30～60min。
(9)PBS洗3X3min。
(10)滴加ABC复合物(提前30min，A液与B液等量混合)，37℃孵育30～60min。
(11)PBS洗3X3min。
(12)0．04％DAB(含0．03％H：02)显色5～10min。
(13)复染，脱水，常规树胶封固和结果观察。
链霉亲和素琼脂糖凝胶6FF使用说明
链霉亲和素琼脂糖凝胶6FF使用说明 货号：S5810 产品说明： 链霉亲和素琼脂糖凝胶6FF利用生物素与链霉亲和素配体之间的相互作用纯化生物素或生物素化的蛋白、抗体等物质。链霉亲和素与生物之间的亲和力很强，需要在变性条件下洗脱，链霉亲和素对亚氨基生物素的亲和力相对较弱，可以在pH9.5-11.0结合，pH4.0时洗脱，不需要使用变性剂所以能更好的保持亲和素偶联物的活性。具体性能见表1。 性能指标 基质4%琼脂糖微球 配体链霉亲和素 载量>120nmol/ml介质；生物素化白蛋白6mg/ml介质 粒径（μm）45-165 最大流速0.1MPa，1bar PH稳定范围2-10 储存缓冲液含20%乙醇的1×PBS 储存温度2°C-8°C 纯化流程： 1.Buffer的准备 所用水和Buffer在使用之前建议用0.22μm或0.45μm滤膜过滤。 生物素或生物素化物质的纯化： 结合/洗杂Buffer：20mM NaH2PO4，0.15M NaCl，pH7.4
洗脱Buffer：8M盐酸胍，pH1.5 亚氨基生物素标签物质的纯化： 结合/洗杂Buffer：50mM碳酸铵，0.5M NaCl，pH10.0 洗脱Buffer：50mM碳酸铵，0.5M NaCl，pH4.0 2.样品准备 上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH值，可以用结合/洗涤缓冲液对血清样品、腹水或细胞培养液稀释，或者样品用结合/洗涤缓冲液透析。 样品在上样前建议离心或用0.22μm或0.45μm滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。 3.样品纯化 （1）将链霉亲和素琼脂糖凝胶6FF装入合适的层析柱，层析用5倍柱体积的结合Buffer 进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用。 （2）将样品加到平衡好的链霉亲和素琼脂糖凝胶6FF中（保证目的蛋白与链霉亲和素琼脂糖凝胶6FF充分接触，提高目的蛋白的回收率），收集流出液。 （3）用10-15倍柱体积的洗杂Buffer进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。 （4）使用5-10倍柱体积的洗脱Buffer，收集洗脱液，即目的蛋白组分。 （5）依次使用3倍柱体积的结合Buffer和5倍柱体积的去离子水平衡填料，最后再用5倍柱体积的20%的乙醇平衡，然后保存在等体积的20%的乙醇中，置于4度保存，防止填料被细菌污染。 4.SDS-PAGE检测 将使用纯化产品得到的样品（包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分）以及原始样品使用
链霉亲和素Streptavidin 说明书
链霉亲和素Streptavidin说明书 货号：S9170 规格：1mg/5mg/10mg 保存：-20℃干燥保存，有效期至少保持2年。 纯度：≥95% 活性：≥15Units/mg，（Green改良法测定）。 产品来源：大肠杆菌发酵工程菌株。 分子大小：60kDa 产品简介： 链霉亲和素（SA）是阿维丁链霉菌（Streptomyces avidinii）分泌的一种同型四聚体蛋白。与生物素具有很高的亲和力，本制品为127AA最佳核心结构，每分子SA结合4个生物素分子，国际比活性12-15 U/mg。SA与禽类亲和素（Avidin，AV）相比特异性更强，与生物素结合后半衰期长达6小时，而AV半衰期仅为1小时。由于SA不含糖基且等电点接近于中性，因此SA在检测应用中具有比AV更低的非特异性背景。 本制品已广泛应用于包被免疫检测用微孔板，制备SA偶联酶制剂（如SA-HRP、SA-AP等），SA偶联荧光素（即荧光染料，如SA-FITC，SA-Cy2，SA-Cy3等）、SA偶联磁珠等，进而参与酶联免疫吸附和酶催化放大实验，免疫组化化学、亲和色谱填料制备、含StrepTagⅡ标签（8-AA寡肽）的蛋白纯化、生物传感器、生物纳米微球、预靶向制药研究和生物芯片被料等生物技术领域。 使用方法： 一、微孔板包被 1.用碳酸钠缓冲溶液（pH9.6）溶解冻干粉，将浓度稀释成3-10ug/ml（客户可设定梯度进行实验） 注意：由于SA等电点是7.4，包被不建议使用中性缓冲液。 2.用移液器吸取100ul/孔，4℃过夜包被或者37℃包被2h；
3.洗涤：倒尽板孔中液体，加200ul洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使 孔中洗涤液流尽，扣干 4.后续进入封闭、洗涤、抗原抗体结合流程 若不立即进入下游实验，包被板需要进行烘干保存时。包被前，将包被液中加入20%蔗糖作为活性保护剂。 二、SA偶联磁珠 2.1NHS活化 1.充分混匀磁珠后，取100μl PangoBeads COOH磁珠到1.5ml离心管中，置于磁性分离上，待固液分 离后去除上清液； 2.取200μl MES溶液（25mM，pH 5.0）加入到离心管中，置于磁性分离上，待固液分离后去除上清液。 重复该步骤1次； 3.迅速加入新配制的50μl EDC溶液和50μl NHS溶液（均为50mg/ml，以上述MES配制）到装有磁 珠的离心管中，漩涡混匀使磁珠充分悬浮，室温下垂直混合30min； 4.反应结束后，加入100μl上述MES溶液洗涤2次；（活化状态不宜长时间保存，建议立即进行偶联）2.2蛋白偶联 1.将离心管置于磁性上，分离去除上清液，加入100μl蛋白溶液（25mM MES，pH 5.0）轻柔地混匀； （蛋白浓度在0.1-2.0mg/ml） 2.在室温下垂直混合反应2h，或在4℃条件下垂直混合过夜； 3.反应结束后将离心管置于磁分离架上，磁性分离去除上清液，加入1ml乙醇胺溶液（3M，pH9.0）洗涤 磁珠2次； 4.加1ml乙醇胺溶液（3M,pH9.0）于离心管中，涡旋30s，将离心管置于垂直混合仪中室温反应1-2h； 5.反应结束后，将离心管置于磁力架上，待固液分离后移除上清液，然后加入100μl纯化水轻柔涡旋30s， 磁吸分离，重复该步骤1次；
高中生物素的生理作用
生长素的生理作用 【引言】 经过多位科学家的研究，发现了生长素，那生长素到底有什么样的作用呢？这正是我们这节课所要讨论的话题。生长素能调节细胞的生长，但是其发挥作用时具着它的特殊性——两重性，既能促进生长，也能抑制生长；既能促进发芽，也能抑制发芽；既能防止落花落果，也能疏花疏果。在我们生产生活中，最常见的反映生长素两重性的事例就是顶端优势，植物的顶芽优先生长而侧芽生长受到抑制的现象。生长素和农业密切相关，在农业上，它既可以促进扦插枝条生根，也可以促进果实的发育，还可以防止落花落果。总之，植物体的生命活动是通过植物体内的激素调节来实现的，尽管植物激素的含量极少，但是却是植物的生长，发育和繁殖等生命活动能有条不紊，正常进行，使植物体更好的适应不断变化的环境。 【教学目标】 知识目标： 1、掌握生长素的生理作用，理解顶端优势的原理。 2、通过分析“生长素浓度与所起作用的关系”图，能够简述生长素作用的两重性；植物不同器官对生长素的敏感性不同。 3、描述植物顶端优势的现象、原因、解除方法及应用。 4、了解生长素及其类似物在农业生产实践中的应用。 能力目标： 1、学会用已学知识来分析问题、解决问题。 情感态度与价值观： 1、通过生长素的生理作用，训练学生将知识运用于实践的能力。 2、通过课后探究活动，培养协作精神。 【重点】·突破策略： 重点： 1、生长素在发挥生理作用时的特点——两重性。 2、生长素在农业生产中的应用。 突破策略： 1、分析图表，引导学生总结生长素发挥作用时所表现的特点。 2、通过日常生活中的事例的分析，让学生更加深刻的理解生长素在农业生产中的应用。 3、共同探究扦插枝条生根时所需的生长素类似物最适的浓度。 【难点】·突破策略： 难点： 1、顶端优势产生的原因以及在生产生活中常见的实例分析。 2、生长素生理作用的两重性及应用问题。 突破策略： 1、通过生产生活中常见实例让学生分析理解顶端优势。 2、借助“同一株植物的不同器官对生长素浓度的反应”曲线图，突破生长素生理作用的两重性。 【教具准备】 多媒体教学软件：松树的塔形树冠；去顶芽后侧芽的生长情况；植物某一器官对不同浓度生长素反应图；根、茎、芽三个器官对不同浓度生长素反应图。 【学法指导】：本节内容可读性强，实验性强，动态性强。在教学过程中，引导学生学会运用理论知识于实验设计中；科学指导学生通过阅读、观察、课后实验等方法去落实知识。
链霉亲和素磁珠
链霉亲和素磁珠 保存：2~8℃保存，有效期1年。 产品说明： 链霉亲和素-生物素（SA-Biotin）系统具有极高的结合亲和力（Kd=10^-15），在生物领域具有广泛的应用。Streptavidin采用蛋白偶联技术将SA共价连接于固相载体表面，可高效结合生物素化抗体、核酸、蛋白等配体分子。本产品采用超顺磁性微球，粒径均一、形貌规整，有利于方便、快捷地捕获目标分子以及实现磁性分离。本产品可配套自动化设备进行高通量操作。 产品信息： 产品信息SA磁珠（1μm）SA磁珠（2μm） 游离生物素1100pmol/mg磁珠1000pmol/mg磁珠 生物素化单链寡核苷酸(24nt)500pmol/mg磁珠400pmol/mg磁珠 生物素化IgG20μg/mg磁珠20μg/mg磁珠 磁珠浓度10mg/mL 磁珠表面亲水基团 保存溶液1×PBS，含0.1%（v/v）Tween-20，0.1%（w/v） NaN3 产品应用范围： （1）免疫检测、分离蛋白、细胞分选等。Streptavidin可特异性地结合生物素化抗体或抗原，作为免疫检测、ELISA等固相反应载体，或用于分选细胞等。 （2）分离核酸、制备核酸探针等。Streptavidin可特异性地结合生物素化的核酸探针，广泛应用于DNA、RNA的杂交实验。 （3）DNA-蛋白质相互作用研究。Streptavidin可特异性地结合生物素化的靶点DNA或RNA片段，可用于蛋白质与核酸相互作用研究。 结合生物素化分子操作流程（本操作以适用于链霉亲和素磁珠系列所有产品） 1.使用前准备 1.1缓冲液：以下为常用的缓冲液成分，用户可根据需要调整缓冲液的盐浓度及pH
链霉亲和素商品化应用简介
链霉亲和素商品化应用简介 一、链霉亲和素性质 链霉亲和素（streptavidin，SA）是由链霉菌streptomyces avidinii分泌的一种蛋白质，分子量为65kD。链霉亲和素分子由4条相同的肽链组成，其氨基酸组成中，甘氨酸和丙氨酸的含量较大，而且结合生物素的活性基团也是肽链中的色氨酸残基；链霉亲和素是一种稍偏酸性（pH6.0）的蛋白质，并且不带任何糖基。 链霉亲和素分子中每条肽链都能结合一个生物素，因此与亲和素一样，一个链霉亲和素分子也能结合4个生物素分子，二者亲和常数（K）亦为1015L／mol。在蛋白水解酶作用下，链霉亲和素可在N端10～12和Ｃ端19-21间断裂，形成的核心链霉亲和素仍然保持完整的结合生物素的能力。链霉亲和素的活性单位也是以结合1μg生物素所需的量来表示，１mg链霉亲和素的最高活性可达18U。 二、亲和素和链霉亲和素的比较 相同点 1、生物素结合能力：AV：13~15U，SA：14~18U 2、活性中心依赖于色氨酸-懒氨酸：亲和素在氨基酸序列的70-70和110-111 两个位点有色氨酸-懒氨酸，链霉亲和素在氨基酸序列的79-80和120-121两个位点含有色氨酸-懒氨酸。
不同点： 1、分子量：AV=66KD, SA=54KD 2、等电点：AV=10.5, SA=6.0, AV带正电较多，非特异性结合较强。 3、位阻效应：SA的生物素结合位点较AV深，位阻效应较强，长臂生物素更适 合。 4、生物素的结合：AV随机结合，SA协同结合。 5、氨基酸序列：AV含二硫键和10%糖，SA含甘氨酸丙氨酸较多，无糖和二 硫键。 三、链霉亲和素在ELISA中的应用 酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。 生物素－链霉亲和素系统在ELISA中的应用有多种形式， 1、用于间接包被：可以在固相上先预包被链霉亲和素，原用吸附法包被固 相的抗体或抗原与生物素结合，通过链霉亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗原间接包被。这种包被法主要有以下优点： ① 增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。 ② 阴性对照、空白对照本底低，检测敏感性高。 ③ 用链霉亲和素替代抗体包被微孔，避免了抗体包被微孔时容易发生失活
过氧化物酶标记链霉亲和素使用说明
过氧化物酶标记链霉亲和素使用说明 HRP-Streptavidin 货号：SE068 规格：0.1ml/1ml 保存：-20℃保存至少一年，避免反复冻融。2-8℃可保存1个月。 产品说明： 链霉亲和素(streptavidin)是与亲和素(avidin)有相似生物学特性的一种蛋白质，是streptomycesavidinii菌的分泌物，其分子量及结合生物素的能力与鸡蛋清中的亲和素相似，等电点 6.0，非特异性结合远比亲和素低。链霉亲和素是四聚体蛋白，大小为66KDa。一分子链霉亲和素可以高度特异性地与四分子生物素结合，两者之间的亲和力极为强烈，链霉亲和素-生物素复合物的解离常数处于10mol/L数量级，这一性质常用于分子生物学用途。其中一条完整的SA肽链中有159个氨基酸残基，分子量为16450。 HRP标记链霉亲和素是采用进口链霉亲和素和高活性过氧化物酶HRP制成复合物，可以用于生物素(Biotin)标记的抗体、蛋白或其它生物素标记分子的检测。具体用途包括Western、ELISA、免疫组化或免疫细胞化学等。 保存体系：0.01M PBS(pH7.4)﹑1%BSA﹑0.03%Proclin300﹑50%甘油。 浓度：链霉亲和素浓度为1mg/ml。 工作效价： ELISA法：1：500～5000 组织化学：1：50～500 免疫印迹：1：500～5000。 具体效价以产品标签为准，最佳使用条件需根据实际情况而定。
相关试剂： SP034兔IgG免疫球蛋白抗原SPA131羊抗小鼠IgG(纯化) SA134羊抗兔IgG(免疫血清) SF134羊抗兔IgG-FITC SE237兔抗猪IgG-HRP A1800抗体稀释液
亲和素与生物素系统的基本原理
亲和素与生物素系统的基本原理 1979年，Guesdon及其同事首先将生物素—亲和素应用于免疫组化技术中，并成功地建立了标记亲和素—生物素技术(LAB)和桥亲和素—生物素技术(BAB)。1981年，Hsu在LAB法和BAB法的基础上，先后建立了生物素—亲和素间接法及ABC法。近年来，由于双重免疫组化标记技术的发展，除ABC-HRP试剂外，还制成了ABC-AKP和ABC-GOD试剂，进而发展了ABC-AKP等技术。同时人们又对ABC法进行改进，相继出现了快速ABC法、二步ABC法、PAP和ABC连用等技术。随着链霉亲和素(streptavidin)的应用又出现了LSAB、S-P、SABC等方法。 1．标记亲和素—生物素法(1abeledavidinbiotin，LAB) 将亲和素与标记酶(HRP)结合，一个亲和素可结合多个HRP；将生物素与抗体(一抗或二抗)结合，一个抗体分子可连接多个生物素分子，抗体的活性不受影响。细胞的抗原(或通过一抗)先与生物素化的抗体结合，继而将酶标记亲和素结合在抗体的生物素上，如此多层放大提高了检测抗原的敏感性。 2．桥接亲和素—生物素法(bridgedavidinbiotin，BAB) 先使抗原与生物素化的抗体结合，再以游离亲和素为“桥”物素连接，也可达到多层放大效果。将生物素化抗体与酶标记生 3．亲和素—生物素—过氧化物酶复合物法(avidin-biotin-peroxidasecomplex，ABC) 此方法为前两种方法的改进，即先按一定比例将亲和素与酶标生物素(或称生物素化酶)结合，形成亲和素—生物素—过氧化物酶复合物(ABC复合物)。抗原先后与特异性一抗、生物素化二抗、ABC复合物(此ABC复合物不能饱和，即亲和素上的4个结合位点最多允许3个位点与生物素化酶结合，留1～2个位点与生物素化二抗结合)结合，最终形成巨大复合体。因该复合体网络了大量酶分子，从而提高了检测的灵敏度。
亲和素和生物素的ELISA试剂盒的应用
亲和素和生物素的ELISA试剂盒的应用 亲和素-生物素系统在ELISA试剂盒中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素-生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA试剂盒中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素-酶结合物，以放大反应信号。 应用亲和素和生物素的ELISA试剂盒,亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉亲和素。生物素又称维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素-羟基琥珀亚胺酯(BNHS)可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素医学教育网整理化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELISA试剂盒偶联起来，就可大大提高ELISA试剂盒的敏感度。 Elisa试验是一种敏感性高，特异性强，重复性好的实验诊断方法。由于其试剂稳定、易保存，操作简便，结果判断较客观等因素，已广泛应用在免疫学检验的各领域中。ELISA检测试剂盒是用于体外定性检测人血清或血浆中的抗人类戊型肝炎（HEV）病毒IgM 抗体ELISA检测。【试剂盒规格】：48T/96T 【试剂盒方法】：酶联免疫法/酶免法(ELISA) 【性状】：液态 【试剂盒种属】马铃薯、鹿、羊、鸡、鸭、鱼、人、大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、裸鼠、兔子、猪、犬、猴、马、牛等动植物。 【试剂盒标本】血清、血浆、细胞上清液、尿液、体液、灌洗液、脑脊髓、心房水、胸房水、组织等 【用途】：科研实验 【贮存】：贮存于2℃-8℃. ELISA试剂盒操作注意事项 1．试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。2．实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。 3．不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。4．使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。5．使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。 6．洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。 7．底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。 8．加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。 9．按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。 本公司长期供应进口ELISA试剂盒，种属齐全,有专门检测人、小鼠、大鼠、豚鼠、猪、狗、猴、羊、牛、鸡、兔等各种样本科研试剂盒。试剂盒提供免费代测、技术指导、全方位售后服务，欢迎来电咨询。
链霉亲和素磁珠使用说明
链霉亲和素磁珠使用说明 货号：S7210 规格：1mL（10mg/mL） 保存：2-8℃ 产品内容： Beads Mag SA磁珠是采用定向固定技术将重组中性链霉亲和素共价偶联到形态规整、粒径均一的磁性微球上，形成单分子固定层，可用于生物素化核酸、抗体或其他生物素化配体和靶分子的分离和检测。由于具有单层的链霉亲和素，绝大多数生物素结合位点在空间上不仅可以结合游离生物素，而且还可以结合生物素化的配体/靶标，具有快速液相反应动力学特性。形状确定的特异性表面便于进行高效捕获、分离和下游操作，链霉亲和素单层可确保没有明显泄漏，而通过避免吸附过量的链霉亲和素，批次一致性和结果的可重复性得到了保证。Beads Mag SA以聚合物为基材的实心微球，主要用于免疫检测、免疫沉淀、细胞分选等。产品特性： 产品名称Beads Mag SA 基质Polymer 粒径2μm 浓度10mg/ml 保存条件PBST(pH7.4,0.01%Tween-20)，2-8℃
结合量1000pmol free biotin/mg of beads 20μg biotinylated antibody/mg of beads 400pmol biotinylated oligonucleotides/mg of beads 注意事项： 1. 请勿离心、干燥或者冷冻磁珠，这些操作可能导致磁珠的聚集从而降低结合活性；2. 从磁珠保存管中移取磁珠前应充分震荡重悬均匀，操作过程中应避免产生气泡；3. 生物素标记好蛋白或核酸后，用脱盐柱去掉多余的游离生物素；4. 尽量减少蛋白降解，包括制备细胞裂解液中包含的蛋白酶抑制剂；5.生物素化分子的大小会影响磁珠的载量，用户需要根据实验确定磁珠对特定生物素化分子的载量。 手动操作步骤： 以下操作过程需要准备的试剂： 注：用户可根据需要调整缓冲液的盐浓度及pH 1.固定化核酸 1.1将磁珠瓶置于漩涡振荡器上20s，振荡重悬磁珠，取100μl 磁珠到新的离心管中，置于 缓冲液名称 成分Buffer I （适用于结合生物素化核酸） 10mM Tris-HCl（pH7.5），1mM EDTA，1M NaCl ，0.01%~0.1%Tween-20Buffer II （适用于结合生物素化抗体/蛋白）PBS，pH7.4，含0.05%Tween-20，可根据需要添加0.01%~0.1%BSA
生物素的生理功能及其分子作用机制
生物素的生理功能及其分子作用机制 摘要：生物素是动物机体内维持正常生理机能所必需的一种维生素,它作为4种羧化酶辅酶成分在哺乳动物体内的葡萄糖氨基酸和脂肪酸代谢中起着重要作用,越来越多的研究表明生物素对基因表达的调控起着重要的作用.本文综述了生物素的营养生理作用及其对基因表达调控的影响. 关键词: 生物素营养基因表达 [Abstract]：Biotin is an essential vitamin for animal to maintain normal metabolism. It plays essential roles in theme metabolism of glucose,amino acids and fatty acids serving as coenzyme for four carboxylases in mammals.More and more researches showed that biotin played an important role in regulating gene expression The nutritional and physiological function of biotin and its effects on gene expression were reviewed in this paper [Key words] biotin;nutrition;gene expression 生物素(biotin),是动物机体内维持正常生理机能所必需的维生素之一。由于生物素在饲料中广泛分布,而且动物肠道能够合成生物素,过去人们曾认为猪和家禽饲料中可以不添加生物素。但是,在生产实践中,经常出现生物素缺乏症,尤其在集约化生产条件下,更容易出现生物素缺乏症状。于是,人们开始重新重视和研究生物素的营养作用(MeDowell,一959)。近年来,生物素已成为最受关注的水溶性维生素之一。 1生物素理化特性 生物素广泛分布于动植物中,天然存在的生物素主要以与其它分子结合的形式存在。生物素的化学结构中包括一个含五个碳原子的梭基侧链和两个五元杂环,在体内由侧链上的梭基与酶蛋白的赖氨酸s残基结合,发挥辅酶作用。生物素可能有8种不同的异构体,其中只有D一生物素具有生物活性。在一般情况下,生物素是相当稳定的,只有在强酸、强碱、甲醛及紫外线处理时才会被破坏。生物素是许多需ATP的羧化反应中羧基的载体，羧基暂时与生物素双环系统上的一个氮原子结合，如在丙酮酸羧化酶催化丙酮酸羧化成草酰乙酸的反应中。动物缺乏生物素引起皮肤疾患和脱毛。卵蛋白质含有能与生物素紧密结合的抗生物素蛋白。如大量食用生鸡蛋，因妨碍生物素的吸收，可导致人类生物素缺乏症。在正常情况下，人类肠细菌合成的生物素足敷需要，不会发生生物素缺乏症。在生物体内，它几乎都是作为生物素酶的辅基与蛋白质的赖氨酸的ε-氨基形成共价键。其生理作用主要是由生物素酶引起的固碳作用及羧基转移反应。通过丙酰辅酶A羧化酶，乙酰辅酶A羧化酶，甲基丙二酸单酰CoA 羧基转移酶等反应参与糖和脂肪的代谢。在这些酶促反应中形成的N-羧基生物素作为中间产物。通常条件下生物素相当稳定，亚硝酸、其它强酸、强碱和甲醛可破坏生物素,酸败脂肪及胆碱可使其失活[1]紫外线照射也可逐渐破坏生物素。 2生物素的营养机制 生物素有结合和游离两种存在形式,结合的生物素不能被动物直接利用,必须在肠道经生物素降解酶分解,释放出游离生物素,方能被动物利用。生物素在小肠可较好地吸收在小肠上 1/3~1/2段以完整分子形式被吸收。生物素在小肠可较好的被吸收，生物素在小肠上1/3~1/2段,以完整分子形式被吸收[2] 3生物素与营养素质的代谢 生物素是水溶性的B 族维生素,是动物的必需营养物质,它对生产、食物的利用、上皮组织的健康、骨骼的发育和繁殖均有重要的作用。生物素是羧化和羧基转移酶系的辅酶,是羧基转用的载体,这些酶系在组织中有转移羧基和固定二氧化碳的作用。具体表现在: ①葡萄糖合
生物素-亲合素系统
生物素-亲合素系统 生物素－亲合素系统（Biotin-Avidin—System，BAS）是70年代末发展起来的一种新型生物反应放大系统。随着各种生物素衍生物的问世，BAS很快被广泛应用于医学各领域。 生物素亲合素系统 1979年Guesdon利用生物素和亲合素间具有高度亲合力的特点，建立了标记亲合素和生物素法（LAB／BA）与桥联亲合素—生物素技术（BRAB）。1981年Hsu首次报告了改进的亲合素—生物素—过氧化酶复合物法（ABC法）。近年大量研究证实，生物素—亲合素系统几乎可与目前研究成功的各种标记物结合，如酶、荧光素、同位素、凝集素、铁蛋白、S PA等。生物素—亲合素与标记试剂高亲合力的牢固结合及多级放大效应，使BAS免疫标记和有关示踪分析更加灵敏。BAS已成为目前广泛用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究的新技术。 BAS用于检测的基本方法可分为三大类。第一类是标记亲和素连接生物化大分子反应体系，称BA法，或标记亲和素生物素法(LAB)。第二类以亲和素两端分别连接生物素化大分 子反应体系和标记生物素，称为BAB法，或桥联亲和素-生物素法(BRAB)。第三类是将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，再与生物素化的抗抗体接触时，将抗原-抗体反应体系与ABC标记体系连成一体，称为ABC法。尽管方法很多，但在目前国内主要还是BAS-ELISA法。特别是其中的BA法和ABC法用得较多。至于其它标记材料(如荧光素、铁蛋白和血蓝蛋白等) 的BAS检测系统，只要制备或得到了相应标记物，再根据B AS的基本原理及基本方法即可自行探索建立实验程序。 BAELISA原理 BA-ELISA是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素(B)与亲和素(A)间的高度放大作用，而建立的一种检测系统。亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，分子量为68kD a，由4个亚单位组成，对生物素有非常高的亲和力(结合常数高达1015M-1)。生物素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合。这样，结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。 链霉亲和素及其活性 链霉亲和素（streptavidin，SA）是由链霉菌streptomyces avidinii分泌的一种蛋白质，分子量为65kD。链霉亲和素分子由4条相同的肽链组成，其氨基酸组成中，甘氨酸和丙氨酸的含量较大，而且结合生物素的活性基团也是肽链中的色氨酸残基；链霉亲和素是一种稍偏酸性（pH6.0）的蛋白质，并且不带任何糖基。 1 t. \3 I* d, V4 B5 F: s 链霉亲和素分子中每条肽链都能结合一个生物素，因此与亲和素一样，一个链霉亲和素分子也能结合4个生物素分子，二者亲和常数（K）亦为1015L ／mol。在蛋白水解酶作用下，链霉亲和素可在N端10～12和Ｃ端19-21间断裂，形成的
初级检验技师临床免疫学和免疫检验(2017年讲义)第十一章生物素-亲和素放大技术
第十一章生物素-亲和素放大技术 生物素、亲和素是一对具有高度亲和力的物质，它们的结合迅速、专一、稳定并具有多级放大效应。生物素-亲和素系统（BAS）是一种以生物素和亲和素具有的多级放大结合特性为基础的实验技术，它既能偶联抗原抗体等大分子生物活性物质，又可被荧光素、酶、放射性核素等材料标记。 第一节生物素的理化性质与标记 生物素（biotin，B）广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取，分子量244.31kD。 一、活化生物素 利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，称为活化生物素。 （一）标记蛋白质氨基的活化生物素 （二）标记蛋白质醛基的活化生物素有两种：生物素酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BGHZ）。 （三）标记蛋白质巯基的活化生物素：3-（N-马来酰亚胺-丙酰）-生物胞素（MPB）。 （四）标记核酸的活化生物素：生物素戊酸侧链通过酰胺键与核酸分子相连，构成生物素标记的核酸探针。 1.光敏生物素：用于DNA或RNA的标记。 2.生物素脱氧核苷三磷酸：将生物素与某种脱氧核苷酸连接成活化生物素。用缺口移位法掺入到双链DNA中。 3.BNHS和BHZ：与核酸胞嘧啶分子中的N-4氨基交联，使核酸分子生物素化。 二、生物素标记蛋白质 （一）生物素化蛋白质衍生物的特性 生物素化蛋白质衍生物有两类，一种是生物素化的大分子活性物质（如抗原、抗体），另一种是标记材料（如酶）结合生物素后制成的标记物。 （二）标记方法 1.标记抗体、抗原：由于一个抗体分子可连接多个生物素分子，因此一个生物素化的抗体分子在反应时可与多个亲和素分子结合。通常选用第二抗体进行生物素标记，制备的标记物具有通用性。 2.标记酶：如生物素标记辣根过氧化物酶（HRP）。 （三）标记注意事项 1.应根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的理化性质（酸性、中性或碱性），选择相应的活化生物素和反应条件。 2.标记反应时，活化生物素与待标记抗原或抗体应有适当的比例，使每个蛋白质分子上标记的生物素分子数量控制在一定范围，以免影响标记物的活性。 3.为减少生物素标记蛋白质后，大分子物质造成的空间位阻影响，有利于生物素与亲和素的结合，可在生物素与被标记物间加入交联臂样结构。 4.生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后，不影响后者的免疫活性；标记酶时则结果有不同。 第二节亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记 亲和素和链霉亲和素是大分子蛋白，几乎可以和任何用于标记的物质结合。 一、亲和素及其活性
生物素-亲和素放大技术题库1-1-8
生物素-亲和素放大技术题库1-1-8
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]标记蛋白质巯基的活化生物素是（） A.N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS） B.生物素酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BGHZ） C.光生物素 D.3-（N-马来酰亚胺-丙酰）-生物胞素（MPB. E.生物素脱氧核苷三磷酸 3-N-马来酰亚胺-丙酰-生物胞素MPB是能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素试剂。
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]能使核酸分子生物素化的是（） A.BNHS和BHZ B.生物素酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BGHZ） C.光生物素 D.3-（N-马来酰亚胺-丙酰）-生物胞素（MPB. E.生物素脱氧核苷三磷酸 BNHS和BHZ均可在一定条件下与核酸胞嘧啶分子中的N-4氨基交联，使核酸分子生物素化。
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]BAS与ELISA耦联起来，可大大提高ELISA测定的灵敏度。对此以下说法错误的是（） A.每个亲和素可结合4个生物素，可使反应明显放大 B.亲和素与生物素间具有极高的亲和力 C.反应结合牢固稳定 D.特异性高 E.生物素与亲和素的结合可减少反应中的空间位阻 把BAS与ELISA耦联起来，可大大提高ELISA测定的灵敏度：每个亲和素可结合4个生物素，可使反应明显放大；亲和素与生物素间具有极高的亲和力，使反应结合更牢固稳定，而且特异性高；用小分子生物素代替酶标记抗体，可减少反应中的空间位阻。 (金沙葡京威尼斯人 https://www.360docs.net/doc/3d16335664.html,)
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]生物素-亲和素系统不可应用于哪项技术（） A.酶免疫测定 B.荧光免疫技术 C.放射免疫测定 D.生物素标记核酸探针进行核酸含量检测 E.检测抗原的免疫-PCR 把BAS与ELISA耦联起来，可大大提高FLISA测定的灵敏度；BAS用于荧光抗体技术，通常采用BA 法、BAB法或荧光标记的抗亲和素或链霉亲和素抗体的夹心法；BAS主要与免疫放射分析检测体系耦联，用于对终反应的放大BA法；BAS在分子生物学领域中的应用日渐增多，目前主要集中在以生物素标记核酸探针进行的定位检测，用BAS制备的亲和吸附剂进行基因分离纯化以及将免疫测定技术与PCR结合建立免疫-PCR用于抗原的检测等三方面。
基于生物素亲和素系统引入的蛋白质芯片的研究
华中科技大学 硕士学位论文 基于生物素-亲和素系统引入的蛋白质芯片研究 姓名：崔浩巍 申请学位级别：硕士 专业：软件工程 指导教师：于军 2010-05-26
华中科技大学硕士学位论文 摘要 生物芯片是上世纪90年代发展起来的一项具有划时代意义的微量分析检测技术，它综合了分子生物学、免疫学、半导体微电子、激光科学等学科。作为生物芯片的一种，蛋白质芯片是随着DNA芯片不断成熟而发展起来的一种新的检测技术，它是按预先设计的方式将抗原或抗体固定在基片上，形成蛋白质的微阵列，然后带有特殊标记对应的抗体或抗原与之特异性结合，通过对标记物的检测来实现抗原抗体的检测。但是到目前为止蛋白质芯片的检测灵敏度不是很高，导致结果假阴性率升高，本文正是针对这一问题展开研究，通过较好的载体表面修饰及生物素-亲和素系统的引入，使得所研制的芯片的检测灵敏度得到了很大的提高。 鉴于光盘的表面性质很好，本文用镀Au膜的光盘片这种有机塑料作为蛋白质芯片的基片。为了后续实验的顺利进行，还需要对基片进行表面修饰，首先在Au表面自组装一层单分子膜，本文选用的自组装试剂是11-巯基十一烷酸(MUA)，分子式为HS-(CH2)10-COOH，其一端的巯基(-SH)可以和Au发生化学吸附，形成的S-Au键键能约177kJ/mol，这种强的键合作用使得巯基化合物在金表面吸附有明显的优越性，另一端的羧基(-COOH)则暴露在基片的表面。另外从分子式还可以看出它是一个具有11个碳原子的长链有机分子，它一端的巯基与Au结合，另一端则可以与待测蛋白质分子共价结合，这样一来待测蛋白质分子与基体表面就有11个碳原子的距离，很好的保持了待测蛋白质分子原来的空间构象，从而也就降低了检测的假阴性率，提高了检测的准确性。自组装之后，由于基片表面的羧基不能直接与人IgG上的氨基(-NH2)反应，需首先将羧基活化，使它变为活泼酯，进而才可以与氨基反应。 为了提高检测的灵敏度，本文尝试了在蛋白质芯片上引入生物素-亲和素系统，它是以生物素-亲和素之间具有很高的结合能力为基础，二者还可以偶联抗原、抗体、酶、荧光素等大分子生物活性物质，它们的结合迅速、专一、稳定。其中亲合素是由4个相同的亚单位构成的四聚体，每个亲合素亚单位通过其结构中的色氨酸残基与生物素中的咪唑酮环结合。这样1个亲合素分子具有4个与生物素分子结合的位点，使其具有放大效应。亲合素与生物素之间的亲和力极强，二者的亲和系数(Ka)为