菠萝蛋白酶提取方法的研究

本文主要研究了以菠萝废弃物为原料,采用硫酸铵盐析法结合超滤浓缩法的技术从菠萝皮中提取菠萝蛋白酶。首先,在硫酸铵盐析分离提取菠萝皮浸提液中菠萝蛋白酶的过程中,实验研究结果表明,硫酸铵液体加入法要优于固体加入法；随着菠萝皮浸提液的pH值的增大,菠萝蛋白酶的酶活回收率先增大后减小,pH值为7时,得到的菠萝蛋白酶酶活回收率最大,为83.6%；随着硫酸铵浓度的增大,菠萝蛋白酶的酶活回收率先增大后减小,当硫酸铵的饱和度达到40%的时侯,菠

萝蛋白酶的酶活回收率最大,为83.6%；在选定的实验温度范围内,随着温度的升高,菠萝蛋白酶的酶活回收率先增大后减小,20℃时菠萝蛋白酶的酶活回收率最大,为86.9%；随着盐析时间的增加,菠萝蛋白酶的酶活回收率先增大后减小,当盐析时间为60min时菠萝蛋白酶的酶活回收率最大,为89.2%。

其次,在超滤法浓缩提取菠萝皮浸提液中的菠萝蛋白酶的过程中,实验研究结果表明,选择截留分子量为20KD的超滤膜对菠萝皮浸提液进行超滤,收集其截留液,酶活截留率可达94%,或者选择截留分子量为100KD的超滤膜,酶活截留率为10.3%,可收集透过液；随着离心分离转速的增加,菠萝蛋白酶的酶活回收率逐渐增大,当离心分离转速当达到8000rpm转速时,菠萝蛋白酶的酶活截留率不再发生变化,为89.3%；使用20KD的超滤膜时,随着操作压力的增大,超滤膜的渗透通量先增大后减小,当操作压力为0.35MPa时,渗透通量达到最大值为

5.57L·m-2·h-1；使用100KD的超滤膜时,随着操作压力的增大,超滤膜的渗透通量先增大后减小,当操作压力为0.25MPa左右时,渗透通量达到最大值为

7.69L·m-2·h-1；无论是未经过处理,还是经过处理的超滤膜,随着使用次数的增加,其本身的渗透通量都逐渐减小,同时,经超滤菠萝皮浸提液得到的蛋白酶活

截留率也逐渐减小,但是,经过纯水低压湍流清洗和酸碱溶液浸泡处理过的超滤膜,其渗透通量和得到的菠萝蛋白酶活截留率都明显大于未经处理过的超滤膜。第三,在盐析-超滤菠萝皮浸提液的过程中,实验研究结果表明,L-半胱氨酸、苯甲酸钠、EDTA和维生素C等对菠萝蛋白酶活性的影响,它们都能提高菠萝蛋白酶的活性,其中, L-半胱氨酸对菠萝蛋白酶活性提高最大其浓度达到0.6mg/mL时,酶活回收率最大,为112.5%；EDTA和苯甲的浓度达到0.5mg/mL时,菠萝蛋白酶的酶活回收率就趋于稳定状态；维生素C虽然对菠萝蛋白酶酶活的提高不是很大,但从经济角度来讲,维生素C较其他三种便宜得多；将盐析得到的湿菠萝蛋白酶沉淀溶解后,先选用100KD的超滤膜在0.25MPa的压力下进行超滤,收集透过液,然后再选用20KD的超滤膜在0.35MPa的压力下进行超滤浓缩,收集截留液,进行冷冻干燥得到精酶,其酶活力为3944.0U·g-1,总酶活回收率为88.6%,总提取率为0.228%。

植物蛋白质提取方法总汇

植物蛋白质提取方法总汇一、植物组织蛋白质提取方法 1、根据样品重量(1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入)，准备提取液放在冰上。 2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置(3-4小时)。 3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃ 4、提取上清液，样品制备完成。蛋白质提取液：300ml 1、1Mtris-HCl(PH8) 45ml 2、甘油(Glycerol)75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！二、植物组织蛋白质提取方法氯醋酸—丙酮沉淀法 1、在液氮中研磨叶片 2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心(4℃8000rpm以上1小时)弃上清。 3、加入等体积的冰浴丙酮(含0.07%的β-巯基乙醇)，摇匀后离心(4℃8000rpm以上1小时)，然后真空干燥沉淀，备用。 4、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心(15℃8000rpm 以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准)，可临时保存在4℃待用。 5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。药品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮。裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS 溶于3ml灭菌的去离子水中(终体积为5ml)，使用前再加入1M的DTT65ul/ml。这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！三、组织：肠黏膜目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达应用TRIPURE提取蛋白质步骤：含蛋白质上清液中加入异丙醇：(1.5ml每1mlTRIPURE用量) 倒转混匀，置室温10min

木瓜蛋白酶的提取

木瓜蛋白酶的提取、分离纯化及其生物学研究综述及实验方法 13生物技术第二大组第二小组组员：王玓玥（组长）、王子贺、王思瑶、王宇涛、王守鑫、谭国栋一、研究背景：在经济飞速发展的今天，人们的生活水平已远远不只在于吃饱穿暖，食品的安全和营养问题受到人们越来越多的关注，绿色健康的生活也成为大家共同的追求，木瓜蛋白酶以它自身耐热及特殊结构等特点被广泛的用于食品行业，如何分离纯化得到高纯度低成本的木瓜蛋白酶则是人们现在研究的重点，本小组便也以此为研究主题展开实验。二、木瓜蛋白酶基本介绍：木瓜蛋白酶，又称木瓜酶，是一种蛋白水解酶。木瓜蛋白酶是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，属于巯基蛋白酶，它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，这种蛋白水解酶，分子量为23406，由一种单肽链组成，含有212个氨基酸残基。至少有三个氨基酸残基存在于酶的活性中心部位，他们分别是Cys25、His159和Asp158，当Cys25被氧化剂氧化或与金属离子结合时，酶的活力被抑制，而还原剂半胱氨酸（或亚硫酸盐）或EDTA能恢复酶的活力木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观

为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性；木瓜蛋白酶溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。木瓜蛋白酶是一种含巯基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，但几乎不能分解蛋白胨。木瓜蛋白酶的最适合PH值6～7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点（pI）为8.75；木瓜蛋白酶的最适合温度55～65℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。。另外六个半胱氨酸残基形成了三对二硫键,且都不在活性部位。纯木瓜蛋白酶制品可含有：（1）木瓜蛋白酶，分子量21000，约占可溶性蛋白质的10%；（2）木瓜凝乳蛋白酶，分子量26000，约占可溶性蛋白质的45%；（3）

蛋白酶的种类

蛋白酶的论述摘要：蛋白酶（英语：Protease）是生物体内的一类酵素（酶），它们能够分解蛋白质。分解方法是打断那些将氨基酸连结成多肽链的肽键。抑制蛋白酶活性的小分子化合物被称蛋白酶抑制剂。许多病毒蛋白酶的抑制剂是很有效的抗病毒药。 1．木瓜蛋白酶 1.1木瓜蛋白酶简介木瓜蛋白酶，是一种蛋白水解酶，可将抗体分子水解为3个片段。是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，活性中心含半胱氨酸，属巯基蛋白酶，应用于啤酒及食品工业。 1.2木瓜蛋白酶的特点木瓜蛋白酶（Papain）简称木瓜酶，又称为木瓜酵素。是利用未成熟的番木瓜（Carica papaya）果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品。它是一种含巯基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。最适合PH值6～7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点（pI)为8.75；最适合温度55～65℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。木瓜蛋白酶由212个氨基酸残基组成，当用氨基肽酶从N末端水解掉分子中的2/3肽链后，剩下的1/3肽链仍保持99%的活性，说明木瓜蛋白酶的生物活性集中表现在C末端的少数氨基酸残基及其所构成的空间结构区域。木瓜蛋白酶papain属巯基蛋白酶，具有较宽的底物特异性，作用于蛋白质中L-精氨酸、L-赖氨酸、甘氨酸和L-瓜氨酸残基羧基参与形成的肽键。此酶属内肽酶，能切开全蛋蛋白质分子内部肽链—CO—NH—生成分子量较小的多肽类。存在于木瓜胚乳中的蛋白酶。EC3．4．22．2。作为植物来源的蛋白酶来说，此酶研究进展的最快。此酶主要是以内肽酶的形态起作用。活性的产生，而半胱氨酸残基是不可缺少的，所以是硫基蛋白酶的一种，底物的特异性不太严格，分子量为23400，氨基酸残基数212。木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性。酪蛋白被木瓜蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光区 275nm 处有吸收峰。1.3木瓜蛋白酶物理化学性质本品为乳白色至微黄色粉末，具有木瓜特有的气味,稍具有吸湿性。水解蛋白质能力强,但几乎不能分解蛋白胨，易溶于水,甘油,不溶于一般的有机溶剂,耐热性强。由木瓜制得的商品酶制剂中，含有如下三种酶：(1)木瓜蛋白酶，分

胃蛋白酶提取的分离纯化

胃蛋白酶提取法中分离纯化技术的研究进展摘要：本文就胃蛋白酶的生物提取法，对其在生产过程中的分离、纯化技术展开综述。其中，分离技术主要介绍了：盐析法、有机溶剂沉淀法、底物亲和法、透析法。纯化技术主要介绍了：凝胶过滤法、透析离子交换法。综合比较各分离纯化方法的特点，得到最优的分离纯化方法有机溶剂与盐析共沉淀法、膜分离技术、等电点沉淀法与底物亲和法。关键词：胃蛋白酶分离纯化应用．生物提取法生产胃蛋白酶 1．1 工艺路线（自溶、过滤）（脱脂、去杂质）猪胃黏膜→自溶液→上清液（浓缩、干燥） →胃蛋白酶成品工艺过程（1）原材料的选择和预处理：胃蛋白酶原主要存在于胃粘膜基底部，采集原料时剥取的粘膜直径大小与收率有关。一般取直径10cm、深2-3mm的胃基底部粘膜最适宜，每头猪胃平均剥取粘膜100g左右。（2）自溶、过滤：在夹套锅内预先加水100升及盐酸升，加热至50度时，在搅拌下加入200千克猪胃黏膜，快速搅拌使酸度均匀，保持45—48度，消化3-4小时，得自溶液。用纱布过滤除去未消化的组织尿蛋白，收集滤液。（3）脱脂、去杂质：将滤液降温至30℃以下，加入15-20％氯仿或乙醚，搅匀后转入沉淀脱脂器内，静置24-48小时，使杂质沉淀，分出弃去，得脱脂酶液。（4）浓缩、干燥：取清酶液，在40℃以下减压浓缩至原体积的1／4左右，再将浓缩液真空干燥。球磨过80-100目筛，即得胃蛋白酶粉。 2胃蛋白酶的分离技术有机溶剂法

可用于胃蛋白酶的初步提取浓缩。通常使用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、异丙酮，其沉淀蛋白质的能力为：丙酮＞异丙酮＞乙醇＞甲醇。当然此顺序也不是一成不变的，因为还要受温度、pH、离子强度等因素的影响。丙酮沉淀能力最好，但挥发损失多，价格较昂贵，所以工业上常采用乙醇作为沉淀剂。 2．2盐析法盐析法是酶制剂工业中常用方法之一，硫酸镁、硫酸铵、硫酸钠是常用的盐析剂，其中用的最多的是硫酸铵。美国专利（2，701,228）改进后，用锌盐沉淀胃酶。当母液含醇（或酮）在50%--55%、pH在—时几乎全部胃酶可以用醋酸锌沉淀，沉淀物为胃酶的锌盐，然后用金属螯合剂除去锌盐，得15000—16000倍活力的酶，收集率为%%。此法较上述有机溶剂沉淀所得的胃酶活力和得率都高。底物亲和法底物亲和法是利用酶（胃蛋白酶）与其底物（酪蛋白）的亲和性，从胃粘膜中提取得到胃蛋白酶。使底物和酶在的乳酸缓冲液中充分结合，然后调pH至4（底物的等电点）沉淀底物和酶的结合物，随后让沉淀物再溶解于乳酸缓冲液中，添加低浓度的SDS将底物和酶分离，得到酶—SDS复合物，再进一步分离纯化。陈躬瑞（2001）成功的应用此法对蛇胃蛋白酶进行了实验室分离，得率大约为30%。与传统的分离方法比较，此法具有简单高效的优点，为后续的纯化工艺避免了昂贵的活化试剂和配基的使用，同时具有较高的特异性。【2】透析法胃蛋白酶的分离过程中还经常用到透析法。该法是利用蛋白质大分子对半透膜的不可透过性而与小分子物质及盐分开的。由于透析主要是扩散过程，如果袋内外的盐浓度相等，扩散就会停止，因此要经常换溶剂，一般一天换2—3次。如在冷处透析，则溶剂也要预先冷却，避免样品变性。透析时的盐是否除净，可用化学试剂或电导仪来检测。【1】 3胃蛋白酶的纯化技术凝胶过滤法

菠萝蛋白酶的提取实验报告

菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定 12食安2班陈志廉摘要本文阐述了通过运用高速离心法提取粗酶，盐析分离提纯，透析除杂等方法提取出了菠萝蛋白酶并将其初步分离纯化且测定了各个步骤的酶活性的过程。关键词菠萝蛋白酶纯化酶活性前言菠萝蛋白酶（Bromelain，EC3.4.22.3）简称菠萝酶，是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶，1891年Mercaro于菠萝的汁中首先发现。在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等，可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。菠萝蛋白酶来可以用来增加豆饼和豆粉的PDI值和NSI值，从而生产出可溶性蛋白制品及含豆粉的早餐、谷类食物和饮料。其它还有生产脱水豆类、婴儿食品和人造黄油；澄清苹果汁；制造软糖；为病人提供可消化的食品；给日常食品添味等。在医药上它可以治疗水肿及多种炎症，并有助消化，健胃消食等功能。菠萝蛋白酶属于糖蛋白，是由巯基蛋白酶和非蛋白酶组分构成的复杂复合物，因含有一个不稳定的游离巯基，所以菠萝蛋白酶极易被氧化而使其酶活下降。本文主要验证了从新鲜菠萝皮中提取菠萝蛋白酶并将之纯化的方法，以求改进工艺等。 1实验材料与仪器 1.1实验材料与试剂新鲜菠萝、0.1mo1/L pH7.8磷酸缓冲液（PBS）、0.01mo1/L pH7.8磷酸缓冲液（PBS）、1％酪蛋白、激活剂、10％三氯乙酸(TCA)、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G250

1.2实验仪器 722型可见光分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司； 752型光栅分光光度计：北京光学仪器厂； TDL-60B台式离心机：上海安宁科学仪器厂； D5M离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司； DK-8D电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；可控硅恒温水浴锅：上海锦屏仪器仪表有限公司； AMPUT电子天平：深圳安普特科技有限公司； BS110S分析天平北京赛多利斯天平有限公司； DS-1型高速组织捣碎机：上海标本模型厂； HZS-H型水浴振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 2实验方法 2．1菠萝蛋白酶的粗酶提取称取菠萝皮材料30g，将菠萝皮在清水中洗净，沥干，切成小段后置于超高速搅拌机中，加入约60mL预冷的0.1mo1/L pH7.8PBS，持续搅拌10~15min至粉碎，搅拌完成后用4层纱布过滤，得到滤液后，用冷冻离心机于4°C3000rpm 离心6min，弃沉淀，即得到菠萝蛋白酶粗提液，测定粗提液的体积、蛋白质含量和酶活性。 2．2盐析根据附录的“硫酸铵饱和度计算表”，按30%硫酸铵饱和度计算在上述酶提取液中需添加的固体硫酸铵量，称取固体硫酸铵于研钵中，研磨呈粉末，慢慢小量分次向酶提取液中添加固体硫酸铵，边加边搅拌，使溶液最终硫酸铵饱和度为30%，放置于冰水混合物（4℃）30min后，酶蛋白沉淀析出，4°C3000rpm离心6min，收集沉淀，加入0.1mo1/L pH7.8PBS约15mL至完全溶解，测定其体积、蛋白质含量和酶活性。 2．3透析将溶解液装入2.5cm×8cm透析袋（预先将透析袋在蒸馏水中煮沸30min）中，于500mL烧杯中，在磁力搅拌器搅拌下用蒸馏水透析，15min换水一次，换水3～4次后，检查SO42-是否已被除净（检查的方法是：取2mLBaCl2溶液

植物蛋白酶提取纯化工艺

植物蛋白酶提取纯化工艺生物工程09-2班陈福泉学号：3090343214 一、实验目的 1、了解植物蛋白酶常用的提取纯化方法的基本原理和基本操作； 2、掌握双水相和反胶束萃取的原理和操作步骤； 3、掌握蛋白质含量和蛋白酶酶活的检测方法二、实验原理植物蛋白酶常用的提取纯化方法有缓冲盐溶液提取、初步纯化的方法有有机溶剂法、乙醇粉法、丙酮粉法、盐析法、双水相法、反胶束萃取法等以pH6.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液为提取溶剂所得酶活力较高，最佳工艺为：以pH6.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液25℃提取2次，料液比1∶1；应用硫酸铵盐析及透析袋透析对粗酶液进行纯化，粗酶液再以60%硫酸铵盐析24h，透析袋（14000）低温透析12h，冻干；酶学性质研究表明：生姜蛋白酶以酪蛋白为底物其最适pH值为 6.0，30℃保温30min，酶活稳定。三、实验材料材料与试剂新鲜生姜、酪蛋白（化学纯）、考马斯亮蓝G-250、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、无水碳酸钠、碳酸氢钠、柠檬酸、硫酸铵、丙酮等试剂均为分析纯。 0.01%（w/v）考马斯亮蓝G-250溶液：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL 90%vol乙醇中，加入85%正磷酸100mL，蒸馏水定容至1000mL。 0.5%酪蛋白溶液：称取0.5g酪蛋白，先用少量0.55mol/L碳酸钠溶液润湿，再加少量 0.02 mol/L pH7.5的磷酸缓冲液稀释，水浴中煮沸溶解，定容至100mL。四、实验步骤方法一：生姜蛋白酶提取液制备: 取定量新鲜生姜,切成小块后加入10 倍体积的pH 6. 0, 0. 2 mol/ L 磷酸缓冲液( 4 e ) , 于粉碎机中匀桨, 8 层纱布过滤后于4000 rpm 离心10 min, 吸取上清液, 加入高饱和度的( NH4) 2SO4 液使盐析体系中( NH4) 2SO4 终饱和度为60% , 4000 rpm 离心15 min。收集上层不溶物, 用少量pH 7. 50 的柠檬酸缓冲液溶解, 在4 e 下对同种缓冲液透析8 h。透析液定容, 即为生姜蛋白酶提取液。方法二：生姜蛋白酶的提取取外形完好、无机械损伤和腐烂、富含纤维的生姜，切成小块，与磷酸缓冲液（0.03mol/L，pH7.5，内含1 mmol/L EDTA和5mmol/L L-半胱氨酸）按料液比1：2打浆，所得浆液低速搅拌20m i n，搅拌过程中缓慢加入20％（m/v）固体硫酸铵，四层纱布过滤后，将姜汁4℃下静置2h，离心（4 800rpm，5min）去除沉

菠萝蛋白酶提取方法的研究

菠萝蛋白酶提取方法的研究本文主要研究了以菠萝废弃物为原料,采用硫酸铵盐析法结合超滤浓缩法的技术从菠萝皮中提取菠萝蛋白酶。首先,在硫酸铵盐析分离提取菠萝皮浸提液中菠萝蛋白酶的过程中,实验研究结果表明,硫酸铵液体加入法要优于固体加入法；随着菠萝皮浸提液的pH值的增大,菠萝蛋白酶的酶活回收率先增大后减小,pH值为7时,得到的菠萝蛋白酶酶活回收率最大,为83.6%；随着硫酸铵浓度的增大,菠萝蛋白酶的酶活回收率先增大后减小,当硫酸铵的饱和度达到40%的时侯,菠萝蛋白酶的酶活回收率最大,为83.6%；在选定的实验温度范围内,随着温度的升高,菠萝蛋白酶的酶活回收率先增大后减小,20℃时菠萝蛋白酶的酶活回收率最大,为86.9%；随着盐析时间的增加,菠萝蛋白酶的酶活回收率先增大后减小,当盐析时间为60min时菠萝蛋白酶的酶活回收率最大,为89.2%。其次,在超滤法浓缩提取菠萝皮浸提液中的菠萝蛋白酶的过程中,实验研究结果表明,选择截留分子量为20KD的超滤膜对菠萝皮浸提液进行超滤,收集其截留液,酶活截留率可达94%,或者选择截留分子量为100KD的超滤膜,酶活截留率为10.3%,可收集透过液；随着离心分离转速的增加,菠萝蛋白酶的酶活回收率逐渐增大,当离心分离转速当达到8000rpm转速时,菠萝蛋白酶的酶活截留率不再发生变化,为89.3%；使用20KD的超滤膜时,随着操作压力的增大,超滤膜的渗透通量先增大后减小,当操作压力为0.35MPa时,渗透通量达到最大值为 5.57L·m-2·h-1；使用100KD的超滤膜时,随着操作压力的增大,超滤膜的渗透通量先增大后减小,当操作压力为0.25MPa左右时,渗透通量达到最大值为 7.69L·m-2·h-1；无论是未经过处理,还是经过处理的超滤膜,随着使用次数的增加,其本身的渗透通量都逐渐减小,同时,经超滤菠萝皮浸提液得到的蛋白酶活

菠萝蛋白酶

菠萝蛋白酶的应用菠萝酶的最早研究菠萝酶(Bromelain，全称菠萝蛋白酶)的最早研究许多人认为医药企业的研究数据更可靠。美国、德国和瑞士的一些主要的医药公司研究发现菠萝蛋白脢能治疗多种疾病，而且非常有效和安全一一这些疾病与诺丽所帮助的疾病相同，但诺丽比它的作用更大。他们的发现表明，在一种植物中存在着一种非常重要的成份。也就是说，医药企业证实有一种食品补充物质能对许多疾病有帮助，尽管他们不知道这种特殊成份的化学特性和他是怎样在人体中起作用的。海尼克博士的报告中说，1957年美国一家重要的医药企业的总裁说，菠萝蛋白脢的发现是近50年来最重要的医学发现之一。海尼克博士的第一个重要的医药客户计划用菠萝蛋白脢溶液作为一种快速(特效) 成份，在30秒内缓解痛经。这个公司的总裁深被菠萝蛋白脢的效果所打动，决定对它作进一步的研究来解决医学上的其他问题(遗憾的是今天的商用菠萝蛋白脢只有3%的有效成份一一赛洛宁原，这是当时让菠萝蛋白脢在药理上有如此活性的物质) 在进一步的研究中，这个公司发现菠萝蛋白脢可以使大的癌肿块衰退。还有一个男孩得了严重的肺气肿，用菠萝蛋白脢治疗很快恢复了健康。科学家发现菠萝蛋白脢和抗菌素一起使用，能用小的剂量可以达到好的效果，这和使用诺丽的效果报告的一样。事实上，通过对一万名使用过诺丽的人的调查结果显示，对呼吸系统的有效率为78%。海尼克博士推测，医药公司没有坚持进一步的研究，是因为他们不知道要花费多长时间

和多少资金来确定到底是什么药理成份使菠萝蛋白脢起作用。下面这个有趣的例子，说明研究一种天然产品的复杂性和不可预测性。在申请FDA批准时要求做双盲试验。三个月以后，对双盲试验进行评估时，他们发现提纯后的菠萝蛋白脢几乎没有什么作用。显然提纯过程去掉了原有菠萝蛋白脢中的药理活性。我们现在知道这种去掉的物质就是塞洛宁原，与诺丽中富含的这种成份一样，这显然也是诺丽为什么那么有疗效的原因。尽管这个医药公司想与Dole公司合作来研究被净化掉的这种物质到底是什么，但Dole有自己的计划。在这个时候，另一家医药公司已经获得了FDA的批准，同意他销售一种肠衣的菠萝蛋白脢片剂来治疗炎症。海尼克博士说Dole公司更愿意延续现在的利润收益，而不愿冒险去进行这个研究。在以后的几年里，海尼克博士与马丁一一销售肠衣菠萝蛋白脢公司的科研主任一起合作来研究治疗炎症。尽管他关于菠萝蛋白脢的生理学作用与海尼克的理论不一样。马丁是一位极富热情和想象力的科研带头人，他所研究出的大量数据至今仍非常有意义。但他幷不是唯一的菠萝蛋白脢的研究者。养呈现良好白嫩状态。菠萝蛋白酶的基本信息菠萝酶(Bromelain，全称菠萝蛋白酶，亦称为凤梨酶或凤梨酵素)是从菠萝果茎、叶、皮提取出来，经精制、提纯、浓缩、酶固定化、冷冻干燥而得到的一种纯天然植物蛋白酶。其外观为浅灰色粉末状，分子量为33000 ，等电点为

粗粮含蛋白酶抑制剂

粗粮含蛋白酶抑制剂。荞麦、燕麦、莜麦、高粱面、红薯等粗粮中，含有抗营养素蛋白酶抑制剂。其中，荞麦、莜麦含量最高。粗粮发酵以后，酵母菌大大降低蛋白酶抑制剂的活性，所以粗粮发酵后蒸窝头、贴饼子等食用为好。各种粗粮甘蓝含有硫苷。卷心菜、紫甘蓝、荠菜、萝卜、洋葱、花菜等十字花科蔬菜中，含有抗营养素——硫苷。硫苷降解的某些产物能抑制甲状腺素的合成和对碘的吸收。硫苷具有两面性，虽然它有副作用，但对子宫癌、乳腺癌等多种癌有显著的抑制作用。硫苷对热敏感，将蔬菜炒熟后，可去除其中的大部分硫苷。理想的做法是，将其一半生吃一半熟吃，这样既可保留防癌成分，又有利于其他营养成分的吸收。黄瓜等含有抗坏血酸氧化酶。黄瓜、西葫芦、莴笋、水芹、花菜、南瓜等食物中，含有抗营养素——抗坏血酸氧化酶。抗坏血酸氧化酶会破坏蔬菜和水果中维生素C的含量。所以食用黄瓜时不必切开，生吃即可。西葫芦、莴笋、水芹、花菜等蔬菜宜大火快炒，最好不要加醋。蛋白质抑制剂:这是大豆和其它豆类中存在的一种特殊蛋白质，可以抑制体内胰蛋白酶等十几种消化酶的流活性，其代表为胰蛋白酶抑制剂，它能抑制蛋

白酶对蛋白质的消化吸收。它需经蒸发气加热30分钟或高压蒸气加热15~2 0分钟才能被破坏。皂角素：大豆中含有的皂角素，对消化道粘膜有强烈的刺激性，人吃了没有煮熟的大豆或豆浆，常会产生恶心、呕吐、腹痛、腹泻等症状，就是由于皂角素没有完全破坏所引起。皂角素需加热至100度才破坏，因此食用豆类或豆浆必须煮开10~20分钟后才能食用。凝血素：也是一种特殊蛋白质，称为植物血球凝集素，可使人体细胞凝集，但加热即可被破坏，或在体内经蛋白酶作用也可使其失去活性，不致被肠道吸收后引起凝血。棉子糖合成酶:众所周知，多吃大豆后肚子容易胀气。其原因是大豆中含有一种棉子糖合成酶，它进入人体后，可以合成大量低聚糖，如棉子糖、水苏糖等。这些糖不能被子人体吸收，大部分在肠中被细菌分解利用，同时产生大量二氧化碳、氢和甲烷。但大豆充分加熟后，此酶即被破坏，产气也随之减少；加工成豆制品或发酵制品也可去除这种酶，故吃豆腐、腐乳等豆制品就不会胀气。植酸:这是一种含磷化合物，一般植物性食品中都含有。但大豆中含量很高，大豆中占60%~80%的磷都是以植酸形式存在，植酸可与蛋白质、无机盐及矿物元素钙、磷、铁、锌等结合而影响其消化吸收。大豆中的锌很难吸收，就是受了植酸的影响，可利用发芽米分解植酸，提高大豆中铁、锌、钙、镁等矿物元素的生物利用率。

蛋白酶抑制剂的研究进展

蛋白酶抑制剂的研究进展郭川微生物专业，200326031 摘要：自然界共发现四大类蛋白酶抑制剂:丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂和酸性蛋白酶抑制剂，本文就各大类蛋白酶抑制剂的结构特点，活性部位的研究概况及其在各领域应用的原理及进展。关键词：蛋白酶抑制剂；结构；应用天然的蛋白酶抑制剂(ＰＩ)是对蛋白水解酶有抑制活性的一种小分子蛋白质,由于其分子量较小,所以在生物中普遍存在。它能与蛋白酶的活性部位和变构部位结合,抑制酶的催化活性或阻止酶原转化有活性的酶。在一系列重要的生理、病理过程中:如凝血、纤溶、补体活化、感染、细胞迁移等，PI发挥着关键性的调控作用,是生物体内免疫系统的重要组成部分。从Ｋｕｎｉｔｚ等最早分离纯化出一种ＰＩ至今,已有多种ＰＩ被发现,根据其作用的蛋白酶主要分以下几类:抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等的丝氨酸蛋白酶抑制剂,抑制木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等的巯基蛋白酶抑制剂,抑制胃蛋白酶、组织蛋白酶Ｄ等的羧基蛋白酶抑制剂、抑制胶原酶、氨肽酶等的金属蛋白酶抑制剂等。而根据作用于酶的活性基团不同及其氨基酸序列的同源性,可将自然界发现的PI分为四大类:丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂(半胱氨酸蛋白酶抑制剂)、金属蛋白酶抑制剂和酸性蛋白酶抑制剂[1]。 1 结构与功能 1.1丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serine Protease Inhibitor,Serpin）丝氨酸蛋白酶抑制剂是一族由古代抑制剂趋异进化5亿年演变而来的结构序列同源的蛋白酶抑制剂。Sepin为单一肽链蛋白质。各种serpin大约有30％的同源序列，疏水区同源性高达70％。血浆中的serpin多被糖基化，糖链经天东酰胺的酰胺基与主链相连。位于抑制性serpin表面、距C端30～40个氨基酸处的环状结构区RSL（reactive site loop）中，存在能被靶酶的底物识别位点识别的氨基酸P1[2]；近C端与P1相邻的氨基酸为P1’，依此类推，即肽链结构表示为N端-P15～P9～P1-P1’～P9’～P15’-C端。在对靶酶的抑制中。Serpin 以RSL中的类底物反应活性位点与靶酶形成紧密的不易解离的酶-抑制剂复合物，同时P1-P1’间的反应活性位点断裂。几种perpin氨基酸序列比较发现，serpins各成员的抑制专一性是由P1决定的，且被抑制的酶特异性切点一致。如抗凝血酶，抑制以Arg羧基端为敏感部位的丝氨酸蛋白酶，其中P1为Arg[2]。 1.2巯基蛋白酶抑制剂（Cytsteine Proteinase Inhiitor，CPI）对于丝氨酸蛋白酶抑制剂(SPI)已有大量研究,巯基蛋白酶抑制剂(CPI)的研究则相对要晚一些。而动物和微生物来源的CPI已有一些研究,发现它们在结构上具有同源性,Barrett等将CPI统称为胱蛋白超家族,并按分子内二硫键的有无与数量,分子量大小等将此家族分为3个成员(F1、F2、F3)。在3个家族中,大多数F1和F3的CPI中都有Glu53-Val54-Val55-Ala56-Gly57保守序列,其同源序列在其它CPI中也被发现,如Ｆ2中的Gln-Ｘ-Val-Ｙ-Gly和CHα-ras基因产物中的Gln-Val-Val肽段。人工合成的Glu-Val-Val-Ala-Gly 短肽也显示对木瓜蛋白酶有抑制活性,因此可以认为这一保守区段在抑制活性中起着全部或部分的关键作用[3]。对植物来源的ＣＰＩ研究的不多,已有报道的有水稻、鳄梨和大豆。水稻巯基蛋白酶抑制剂(Oryzacystatin,OC) 具有102个氨基酸残基,有典型的Glu-Val-Val-Ala-Gly保守序列,应与动物CPI同源进化而来。从OCI没有二硫键来看,它应归为F1成员,但从序列比较看,则更接近F3。对OCIGlu---Gly保守序列进行点突变试验表明,突变使其抑制活性大幅度下降,其中当Glu被Pro替代时则活性全无,由此说明,这一段保守序列在OCI的抑制活性中,同动物CPI一样必不可少。除Glu---Gly保守区域外,OCI序列中其

胃蛋白酶提取的分离纯化

胃蛋白酶提取的分离纯化 IMB standardization office【IMB 5AB- IMBK 08- IMB 2C】

干燥：取清酶液，在40℃以下减压浓缩至原体积的1／4左右，再将浓缩液真空干燥。球磨过80-100目筛，即得胃蛋白酶粉。 2胃蛋白酶的分离技术有机溶剂法可用于胃蛋白酶的初步提取浓缩。通常使用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、异丙酮，其沉淀蛋白质的能力为：丙酮＞异丙酮＞乙醇＞甲醇。当然此顺序也不是一成不变的，因为还要受温度、pH、离子强度等因素的影响。丙酮沉淀能力最好，但挥发损失多，价格较昂贵，所以工业上常采用乙醇作为沉淀剂。 2．2盐析法盐析法是酶制剂工业中常用方法之一，硫酸镁、硫酸铵、硫酸钠是常用的盐析剂，其中用的最多的是硫酸铵。美国专利（2，701,228）改进后，用锌盐沉淀胃酶。当母液含醇（或酮）在50%--55%、pH在—时几乎全部胃酶可以用醋酸锌沉淀，沉淀物为胃酶的锌盐，然后用金属螯合剂除去锌盐，得15000—16000倍活力的酶，收集率为%%。此法较上述有机溶剂沉淀所得的胃酶活力和得率都高。底物亲和法底物亲和法是利用酶（胃蛋白酶）与其底物（酪蛋白）的亲和性，从胃粘膜中提取得到胃蛋白酶。使底物和酶在的乳酸缓冲液中充分结合，然后调pH至4（底物的等电点）沉淀底物和酶的结合物，随后让沉淀物再溶解于乳酸缓冲液中，添加低浓度的SDS将底物和酶分离，得到酶—SDS复合物，再进一步分离纯化。陈躬瑞（2001）成功的应用此法对蛇胃蛋白酶进行了实验室分离，得率大约为30%。与传统的分离方法比较，此法具有简单高效的优点，为后续的纯化工艺避免了昂贵的活化试剂和配基的使用，同时具有较高的特异性。【2】

蛋白酶整理

一、蛋白酶的分类、主要用途及作用二、产蛋白酶菌株的筛选三、产酶发酵四、蛋白酶活性测定的方法

蛋白酶的分类、主要用途及作用酶：酶是具有生物催化功能的生物大分子。蛋白酶：水解蛋白质肽键的一类酶的总称蛋白酶分类： 1据水解多肽的方式分为内肽酶和外肽酶 2据反应的最适pH值分为酸性，碱性，中性蛋白酶蛋白酶简介：广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。微生物蛋白酶，主要由霉菌、细菌，其次由酵母、放线菌生产。催化蛋白质水解的酶种类很多，重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等。蛋白酶对所作用的底物有严格的选择性，一种蛋白酶只能作用于蛋白质分子中一定的肽键，如胰蛋白酶催化水解碱性氨基酸所形成的肽键。蛋白酶分布广泛，主要存在于人和动物消化道中，在植物和微生物中含量丰富，由于动植物资源有限，工业生产上生产蛋白酶制剂主要利用枯草杆菌等微生物发酵设备。

一、酸性蛋白酶定义：酸性蛋白酶是一种能在酸性环境下水解蛋白质的酶类注：酸性蛋白酶是指蛋白酶具有较低的最适pH,不是指酸性基团存在于酶的活性部位. 简介：主要来源于动物的脏器和微生物分泌物，包括胃蛋白酶、凝乳酶和一些微生物蛋白酶。根据其产菌的不同，微生物酸性蛋白酶可以分为霉菌酸性蛋白酶、酵母菌酸性蛋白酶和担子菌酸性蛋白酶，根据作用方式可以分为两类：一类是与胃蛋白酶相似，主要的产酶微生物是曲霉、青霉和根酶等；另一类是与凝乳酶相似，主要产酶微生物是毛酶和栗疫酶等，从酶的活力-PH曲线分析,在酶的活性部位中含有一个或更多的羧基，这一类蛋白酶中研究最彻底的是胃蛋白酶。酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，目前用于工业化生产的酸性蛋白酶大多为霉菌酸性蛋白酶，此类酶的最适作用pH值为3.0左右，当pH值升高时，酸性蛋白酶的酶活会明显降低，且此类酶不耐热，当温度达到50℃以上时很不稳定，从而限制了酸性蛋白酶的应用范围。基本性质酸性蛋白酶的最适PH从2左右(胃蛋白酶)到4左右应用 1酿酒：酸性蛋白酶在酿酒的过程中起协同作用，具有溶解发酵原料，促进微生物繁殖，降解酵母菌体蛋白等多种功能。 2毛用酸性蛋白酶最适ph3.5，最适温度40度，用该酶处理预处理后的羊毛，可以得到较大的减量率和较好的细度。面临的问题：酶对羊毛的作用活力不高。3食品工业：食品上用以淀粉改良，提高食品风味、改良品质，因能提高氨基酸含量 4啤酒生产：能有效阻断双乙酰生成，缩短啤酒成熟期。饲料添加剂：提高饲料利用率。二、碱性蛋白酶简介碱性蛋白酶是由造育的地衣芽孢杆菌发酵而得，主要成分为枯草杆菌蛋白酶，是一种内切酶，催化部位为丝氨酸，分子量约为27300。碱性蛋白酶是由造育的地衣芽孢杆菌发酵而得，主要成分为枯草杆菌蛋白酶，是一种内切酶，催化部位为丝氨酸，分子量约为27300。

蛋白酶抑制剂基因及转基因植物研究进展

蛋白酶抑制剂基因及转基因植物研究进展摘要：植物蛋白酶抑制剂是除Bt之外又一个愈来愈研究较多的抗虫基因资源，其分布广泛，在豆科、茄科、禾本科、葫芦科及十字花科等植物中存在较多。植物蛋白酶抑制剂抗虫基因主要通过2种途径获得并在多种植物中进行转化，获得抗虫转基因植株。植物蛋白酶抑制剂在基因工程中的应用已有很大的发现进展。关键字：蛋白酶抑制剂基因作用机理转基因正文：一蛋白酶抑制剂作用机理广泛存在于植物组织中的蛋白酶抑制剂是一种多肽物质, 对许多昆虫有防卫作用。该基因及其编码区域较小、没有内含子。研究表明, 这些蛋白酶抑制剂在植物对危害昆虫以及病原体侵染的夭然防御系统中担当着重要角色。昆虫饲喂实验发现, 某些纯化的蛋白酶抑制剂具有明显的抗虫作用。利用蛋白酶抑制剂基因来提高植物的抗虫能力, 已成为植物基因工程研究的一个热门领域。在植物中发现有三类蛋白酶抑制剂: 丝氨酸蛋白酶抑制剂, 琉基蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂。其中对丝氨酸类蛋白酶抑制剂的研究最为透彻, 目前在植物中至少已经发现有6 个家族, 其中的弧豆胰蛋白酶抑制剂, 马铃薯蛋白酶抑制剂兀的抗虫效果最为理想。蛋白酶抑制剂的杀虫机理蛋白酶抑制剂杀虫的机理在于: 它能与昆虫消化道内的蛋白消化酶相互作用形成酶抑制剂复合物( E l ) 阻断或减弱消化酶的蛋白水解作用。所以, 一旦昆虫摄食进蛋白酶抑制剂, 就会影响外来蛋白的正常消化, 同时, 蛋白酶抑制剂和消化酶形成E l 复合物, 能刺激消化酶的过量分泌, 通过神经系统的反馈, 使昆虫产生厌食反应。由于蛋白酶抑制剂抑制了昆虫的进食及消化过程, 不可避免地将导致昆虫缺乏代谢中必需的氨基酸, 最终造成昆虫的非正常发育或死亡。二植物蛋白酶抑制剂基因作用机理及获得的途径蛋白酶抑制剂基因的作用机理及其应用蛋白酶抑制剂( P l ) 是自然界含量最为丰富的蛋白种类之一, 存在于所有生命体中。国内外有关抗虫的植物蛋白酶抑制剂基因的获得大多通过2种途径。一种通过从植物不同部位的组织或细胞中提取抗虫活性蛋白，然后分析其起作用的活性核苷酸序列，继而克隆和转化到寄主细胞，进行筛选和选育抗虫树种。利用该方法获得抗虫树种的研究越来越多，该方法中最为关键的环节是蛋白酶抑制剂提取和活性测定方法的选择和建立。植物蛋白酶抑制剂分离和纯化的策略主要依据不同植物中的蛋白酶抑制剂生理生

蛋白酶抑制剂选择指南

蛋白酶抑制剂选择指南 1 蛋白酶抑制剂选择指南抑制剂工作浓度分子量抑制蛋白酶种类稳定性 AEBSF终浓度1mM MW:239.5不可逆的丝氨酸蛋白酶抑制剂,抑制胰蛋白酶,糜蛋白酶,纤溶酶,凝血酶及激肽释放酶. 可溶于水,其pH7的水溶液在4o C可保持稳定1-2个月,在pH>8的情况下会发生缓慢水解 Aprotinins 抑肽酶终浓度2ug/ ml MW:6512 可逆的丝氨酸蛋白酶抑制剂,可抑制纤溶酶,激肽释放酶,胰蛋白酶,糜蛋白酶,但不抑制凝血酶和 Factor Xa。非常稳定,当pH>12.8时失去活性,可溶于水(10mg/ml),-20o C下可长期保存 Bestatin终浓度10uM MW:308.4 可逆的丙氨酰-氨基肽酶抑制剂, 工作液可保存一天,1mM的甲醇贮存液在 -20o C可保存至少一个月 E-64 Protease Inhibitor终浓度10uM MW:357.4 不可逆的半胱氨酸酸蛋白酶抑制剂,抑制半胱氨酸酸蛋白酶而不会影响其他酶的半胱氨酸残基,与小分子量的巯基醇如beta-巯基乙醇不会产生反应, 具有高度特异性。工作液在正常pH值下可保持稳定数天,1mM的水溶液在-20o C可保存几个月 EDTA, 4Na终浓度10mM MW:380.2 金属蛋白酶的可逆性螯合物,可能同时影响其他金属依赖性生物过程。其水溶液很稳定,其贮存液(pH8.5的0.5M 水溶液)在4o C可保存数月 Leupeptin, 半硫酸盐亮抑酶肽（亮肽素）终浓度100uM MW:493.6 可逆的丝氨酸及半胱氨酸蛋白酶制剂,可抑制胰蛋白酶样蛋白酶及一些半胱氨酸蛋白酶如:Lys-C内切蛋白酶,激肽释放酶,木瓜蛋白酶,凝血酶,Cathepsin B及胰蛋白酶。工作液的稳定期为数小时,贮存液(10mM 水溶液)在4o C时稳定期为一周,-20o C时稳定期为一个月 Pepstatin A 终浓度1uM MW:685.9 可逆的天冬氨酸蛋白酶,可抑制胃蛋白酶,Cathepain B&L,血管紧张肽原酶(renin)及以1mg/ml溶于甲醇,搅拌过夜可以 1mg/ml溶于乙醇,333mg/ml溶于6N的

木瓜蛋白酶提取实验方案

实验设计题目：木瓜蛋白酶的提取,纯化分离及其生物学研究一、实验原理：木瓜蛋白酶（papain）又称木瓜酶，广泛存在于番木瓜的根、茎、叶和果实，未成熟果实的乳汁中含量最丰富。是一种含疏基（-SH）肽链的内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力；同时还具有合成的功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。工业用的木瓜蛋白酶一般都是未经纯化的多酶体系。现已知经木瓜乳汁干燥而得的木瓜蛋白酶至少含有四种主要酶类：木瓜蛋白酶（papain）、木瓜凝乳蛋白酶（chymopapain）、木瓜蛋白酶Ω（papaya proteinaseΩ）、木瓜凝乳蛋白酶M（chymopapain M），其中木瓜凝乳蛋白酶的含量最多，占可溶性蛋白的45%。木瓜蛋白酶易溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于有机溶剂。它的最适pH值为5.7（一般3～9.5皆可），在中性或偏酸性时亦有作用；最适温度为55～60℃（一般10～85℃皆可），耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。本实验主要采取有机溶剂沉淀法结合硫酸铵分级沉淀法来提取番木瓜中的木瓜蛋白酶。

有机溶剂沉淀法：有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导溶解度的降低，另外，有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法。有机溶剂分段沉淀法它常用于蛋白质或酶的提纯。使用的有机溶剂多为乙醇和丙酮。高浓度有机溶剂易引起蛋白质变性失活，操作必须在低温下进行，并在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以避免局部浓度过大。硫酸铵分级沉淀法：硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐析时溶液PH在木瓜蛋白酶等电点时（PI=8.75）则效果最好，盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。木瓜蛋白酶活力测定：蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯乙酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍

丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究进展

丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究进展梁化亮（生物与食品工程学院，常熟 215500） Progress on antimicrobial peptide [摘要]蛋白酶抑制剂（PIs）是一类能抑制蛋白酶水解酶的催化活性的蛋白或多肽，广泛存在于生物体，在许多生命活动过程中发挥必不可少的作用。根据活性位点氨基酸种类不同可将蛋白酶抑制剂分为四大类型:丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂。其中尤以丝氨酸蛋白酶及其抑制剂在体一些重要生理活动中起关键性的调控作用。其能对蛋白酶活性进行精确调控，包括分子间蛋白降解，转录，细胞周期，细胞侵入，血液凝固，细胞凋亡，纤维蛋白溶解作用，补体激活中所起的作用。 [关键词]丝氨酸蛋白酶抑制剂分类临床应用防御

1 丝氨酸蛋白酶抑制剂免疫系统是由组织，细胞，效应分子构成，并逐渐进化形成用于阻挠病原微生物的侵入攻击，限制它们扩散进入宿主环境。这其中起到主要作用的是宿主产生的蛋白酶抑制剂，广泛存在于生物体的蛋白酶抑制剂在机体与相应的蛋白酶形成一个动态的系统，在生物体系以及一系列的生理过程中起着调控作用[1]，是生物体免疫系统的重要组成部分。它不仅能使侵入体的蛋白酶失活并且能将其清除，使附着在宿主表面的病原细菌无法附着生存。其中丝氨酸蛋白酶及其抑制剂在体一些重要生理活动中起关键性的调控作用[2]。丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine protease inhibitor）泛指具有抑制丝氨酸蛋白酶水解活性的一类物质，广泛存在于动物、植物、微生物体中[3]。在动物体中，丝氨酸蛋白酶抑制剂是维持体环境稳定的重要因素，一旦平衡失调即导致多种疾病，任何影响其活性的因素也会造成严重的病理性疾病。它们最基本的功能是防止不必要的蛋白水解，调节丝氨酸蛋白酶的水解平衡。作为调控物，丝氨酸蛋白酶抑制剂参与机体免疫反应，对生物体的血液凝固、补体形成、纤溶、蛋白质折叠、细胞迁移、细胞分化、细胞基质重建、激素形成、激素转运、细胞蛋白水解、血压调节、肿瘤抑制以及病毒或寄生虫致病性的形成等许多重要的生化反应和生理功能有重要的影响[4]。鉴于其重要的生理功能，丝氨酸蛋白酶抑制剂一直倍受研究者的关注，目前已分离得到多种天然丝氨酸蛋白酶抑制剂，同时如何将其更好地应用于食品、医药领域也成为近来研究热点。 1.1 丝氨酸蛋白酶抑制剂分类目前，典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂基于其序列、拓扑结构及功能的相似性，至少可分为18个家族[5]，如表1－1所示。不同家族抑制剂的空间结构也不同。通常这类抑制剂是β片层或混合了α螺旋和β片层的蛋白质，也可能是α螺旋或富含二硫键的不规则蛋白质。但它们都拥有规的反应活性位点环的构象，从而使这些非相关的蛋白质具有相似的生物学功能[6]。因此典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂最明确最广泛地代表了蛋白质的趋同进化。 1.2 Serpins Serpins是一类分子量较大的丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族，氨基酸残基数为