双分子荧光互补技术(BiFC)

分子荧光光谱法实验报告

分子荧光光谱法实验报告 一、实验目的 1.掌握荧光光度计的基本原理及使用。 2.了解荧光分光光度计的构造和各组成部分的作用。 3.掌握分子荧光光度计分析物质的特征荧光光谱：激发光谱、发射光谱的测定方法。 4.了解影响荧光产生的几个主要因素。 5.学会运用分子荧光光谱法对物质进行定性和定量分析。 二、实验原理 原子外层电子吸收光子后，由基态跃迁到激发态，再回到较低能级或者基态时，发射出一定波长的辐射，称为原子荧光。对于分子的能级激发态称为分子荧光，平时所说的荧光指分子荧光。 具有不饱和基团的基态分子经光照射后，价电子跃迁产生荧光，是当电子从第一激发单重态S1的最低振动能级回到基态S0各振动能级所产生的光辐射。 (1)激发光谱 是指发光的某一谱线或谱带的强度随激发光波长(或频率)变化的曲线。横坐标为激发光波长，纵坐标为发光相对强度。 激发光谱反映不同波长的光激发材料产生发光的效果。即表示发光的某一谱线或谱带可以被什么波长的光激发、激发的本领是高还是低；也表示用不同波长的光激发材料时，使材料发出某一波长光的效

率。荧光为光致发光，合适的激发光波长需根据激发光谱确定——激发光谱是在固定荧光波长下，测量荧光体的荧光强度随激发波长变化的光谱。获得方法：先把第二单色器的波长固定，使测定的λem不变，改变第一单色器波长，让不同波长的光照在荧光物质上，测定它的荧光强度，以I为纵坐标，λex为横坐标所得图谱即荧光物质的激发光谱，从曲线上找出λex，，实际上选波长较长的高波长峰。 (2)发射光谱 是指发光的能量按波长或频率的分布。通常实验测量的是发光的相对能量。发射光谱中，横坐标为波长，纵坐标为发光相对强度。 发射光谱常分为带谱和线谱，有时也会出现既有带谱、又有线谱的情况。发射光谱的获得方法：先把第一单色器的波长固定，使激发的λex不变，改变第二单色器波长，让不同波长的光扫描，测定它的发光强度，以I为纵坐标，λem为横坐标得图谱即荧光物质的发射光谱;从曲线上找出最大的λem。 (3)荧光强度与荧光物质浓度的关系 用强度为I0的入射光，照射到液池内的荧光物质时，产生荧光，荧光强度If用仪器测得，在荧光浓度很稀(A 三、实验试剂和仪器试剂：罗丹明B乙醇溶液；1-萘酚乙醇溶液；3,3’-Diethyloxadicarbocyanine iodide：标准溶液，10μg/ml, 20μg/ml,30μg/ml,40μg/ml和未知浓度；蒸馏水；乙 醇。 仪器：Fluoromax-4荧光分光光度计；1cm比色皿；

荧光分析法检测原理及应用举例

1 荧光定义 某些化学物质从外界吸收并储存能量而进入激发态，当其从激发态回到基态时，过剩的能量以电磁辐射的形式放射出去即发光，称之为荧光。可产生荧光的分子或原子在接受能量后引起发光，供能一旦停止，荧光现象随之消失。 2 荧光分类 由化学反应引起的荧光称为化学荧光，由光激发引起的荧光称为光致荧光，课题主要研究光致荧光。按产生荧光的基本微粒不同，荧光可分为原子荧光、X 射线荧光和分子荧光，课题主要研究分子荧光。 3 光致荧光机理 某一波长的光照射在分子上，分子对此光有吸收作用，光能量被分子所吸收，分子具有的能量使分子的能级由最低的基态能级上升至较高的各个激发态的不同振动能级，称为跃迁。分子在各个激发态处于不稳定的状态，并随时在激发态的不同振动能级下降至基态，在下降过程中，分子产生发光现象，此过程为释放能量的过程，即为光致荧光的机理。光致荧光的过程按照时间顺序可分为以下几部分。 分子受激发过程 在波长为10~400nm的紫外区或390~780nm的可见光区，光具有较高的能量，当某一特征波长的光照射分子时，是的分子会吸收此特征波长的光能量，能量由光传递到分子上，此过程为分子受激发过程。分子中的电子会出现跃迁过程，在稳定的基态向不稳定的激发态跃迁。跃迁所需要的能量为跃迁前后两个能级的能量差，即为吸收光的能量。分子跃迁至不稳定的激发态中即为电子激发态分子。 在电子激发态中，存在多重态。多重态表示为2S+1。S为0或1，它表示电子在自转过程中，具有的角动量的代数和。S=0表示所有电子自旋的角动量代数和为0，即所有电子都是自旋配对的，那么2S+1=1，电子所处的激发态为单重态， 用S i 表示，由此可推出，S 即为基态的单重态，S 1 为第一跃迁能级激发态的单重 态，S 2 为第二跃迁能级激发态的单重态。S=1表示电子的自旋方向不能配对，说明电子在跃迁过程中自旋方向有变化，存在不配对的电子为2个，2S+1=3，电子 在激发态中位于第三振动能级，称为三重态，用T i 来表示，T 1 即为第一激发态中 的三重态，T 2 即为第二激发态中的三重态，以此类推。

2019西城高三一模生物(3)

2019北京西城高三一模 生物 第一部分(选择题共120分) 本部分共20小题，每小题6分，共120分。在每小题列出的四个选项中，选出最符合题目要求的一项。 1、细胞膜的功能与膜蛋白密切相关，下列不属于膜蛋白功能的是 A.细胞识别 B.组成染色体 C.催化化学反应 D.控制物质进出细胞 2、科学家将编辑基因的分子工具构建到靶向侵染心肌细胞的病毒中，通过尾部静脉注射到成年小鼠体内，成功编辑线粒体DNA。该研究让耳聋、癫痫、肌无力等线粒体遗传病迎来治治愈的希望。下列说法错误的是。 A.线粒体基因的遗传遵循分离定律和自由组合定律 B.线粒体DNA的突变可能会导致能量代谢障碍 C.侵染心肌细胞的病毒在该研究中作为载体起作用 D.该项研究中雌性小鼠后代心脏功能仍然未能改善 3、科学家设想，如果能在糖尿病患者体内植入正常分泌胰岛素的细胞，患者可以免去每天注射胰岛素的麻烦。科学家将细胞封闭在藻酸盐凝胶(褐藻细胞壁提取物)保护膜中，制成“胶囊”植入患者体内，患者血糖浓度恢复正常。下列说法错误的是 A.直接移植外源细胞会引起免疫排斥 B.包在保护膜中的应为胰岛B(β)细胞 C.内环境的营养物质应能透过保护膜 D.该保护膜的结构应为磷脂双分子层 4、下列关于生物实验材料的叙述错误的是 A.大蒜根尖可用于观察细胞有丝分裂 B.鸡血细胞可用于DNA粗提取 C.醋酸杆菌可用于泡菜的制作 D.酵母菌可用于研究细胞呼吸方式 5、稻飞虱以刺吸水稻的汁液为生，成虫有短翅型和长翅型两种，长翅利于稻飞虱在水稻发育晚期迁移到适宜生存的环境。研究人员在含糖量不同的封闭环境中饲养稻飞虱若虫(幼虫)，探究种群密度对成虫翅形比例的影响，结果如下图。下列说法错误的是 A.水稻和稻飞虱共同组成生物群落 B.稻飞虱属于生态系统中的消费者 C.稻飞虱种群在高糖、高密度情况下迁移能力提高 D.水稻与稻飞虱在相互选择中共同(协同)进化

生化考试复习题汇总及答案整理

核酸化学及研究方法 一、名词解释 1.正向遗传学：通过研究突变表型确定突变基因的经典遗传学方法。 2.核小体组蛋白修饰：组成核小体组蛋白，其多肽链的N末端游离于核小体之外，常被化学基团修饰，修饰类型包括：乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化，修饰之后会改变染色质的结构和活性。 3.位点特异性重组：位点特异性重组是遗传重组的一类。这类重组依赖于小范围同源序列的联会，重组只发生在同源短序列的范围之内，需要位点特异性的蛋白质分子参与催化。 4.转座机制：转座酶上两个不同亚基结合在转座子的特定序列上，两个亚基靠在一起形成有活性的二聚体，切下转座子，转座酶-转座子复合物结合到靶DNA上，通过转座酶的催化将转座子整合到新位点上。 5.基因敲除：利用DNA同源重组原理，用设计的外源同源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的靶基因发生重组，从而将外源DNA整合到受体细胞的基因组中，产生精确的基因突变，完成基因敲除。 6.Sanger双脱氧终止法：核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在的条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，若双脱氧碱基掺入链端，该链便停止延长，若单脱氧碱基掺入链端，该链便可继续延伸。如此每管反应体系中便合成了以共同引物为5’端，以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分四个泳道进行电泳，以分离长短不一的核酸片段（长度相邻者仅差一个碱基），根据片段3’的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。 7.荧光实时PCR技术原理 探针法：TaqMan探针是一小段可以与靶DNA序列中间部位结合的单链DNA，它的5’和3’端分别带有一个荧光基团，这两个荧光基团由于距离过近，相互发生淬灭，不产生绿色荧光。PCR反应开始后，靶DNA变性，产生单链DNA，TaqMan探针结合到与之配对的靶DNA序列上，之后被Taq DNA聚合酶切除降解，从而解除荧光淬灭，荧光基团在激发光下发出荧光，最后可根据荧光强度计算靶DNA的数量。染料法：荧光染料（如SYBR GreenⅠ）能与双链DNA发生非序列特异性结合，并激发出绿色荧光。PCR反应开始后，随着DNA的不断延伸，结合到DNA上的荧光染料也相应增加，被激发产生的荧光也相应增加，可根据荧光强度计算初始模板的数量。 8.双分子荧光互补(BiFC)技术原理 将荧光蛋白在某些特定的位点切开，形成不发荧光的N片段和C片段。这2个片段在细胞内共表达或体外混合时，不能自发地组装成完整的荧光蛋白，不能产生荧光。但是，当这2个荧光蛋白的片段分别连接到一组有相互作用的目标蛋白上，在细胞内共表达或体外混合这两个目标蛋白时，由于目标蛋白质的相互作用，荧光蛋白的2个片段在空间上互相靠近互补，重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子，并在该荧光蛋白的激发光激发下，发射荧光。 简言之，如果目标蛋白质之间有相互作用，则在激发光的激发下，产生该荧光蛋白的荧光。反之，若目标蛋白质之间没有相互作用，则不能被激发产生荧光。 二.问答题： 1.怎样将一个基因克隆到pET32a载体上；原核表达后，怎样纯化该蛋白？ 2.通过哪几种方法可以获得cDNA的全长？简述其原理。 （一）已知序列信息 1.同源序列法：根据基因家族各成员间保守氨基酸序列设计简并引物，利用简并引物进行RT-PCR扩增，得到该基因的部分cDNA序列，然后再利用RACE（cDNA末端快速扩增技术）获得cDNA全长。 2.功能克隆法：cDNA文库；基因组文库 （二）未知序列信息： 1.基于基因组DNA的克隆：是在鉴定已知基因的功能后，进而分离目标基因的一种方法。

双分子荧光互补技术及其在蛋白质相互作用研究中的应用进展.doc

双分子荧光互补技术及其在蛋白质相互作 用研究中的应用进展 双分子荧光互补技术及其在蛋白质相互作用研究中的应用进展【摘要】双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）是指两个不发光的荧光蛋白互补片段在与其融合的蛋白质的相互作用驱动下重新组装形成荧光复合物，恢复荧光特性。 基于双分子荧光互补原理的相关技术在多种不同类型的蛋白质相互作用研究中得到越来越广泛的应用。 我们对双分子荧光互补技术的原理、特性、应用现状、面临的问题及应用前景进行了概述。 【关键词】双分子荧光互补（BiFC）；互补片段；荧光复合物；蛋白质相互作用AbstractBimolecular fluorescence complementation BiFC means two non-fluorescent complementary fragments of fluorescent protein can reassemble to form fluorescent complex and restore fluorescence when they are fused to two proteins that interact with each other. BiFC analysis has been used to study interactions among a wide range of proteins in many cell types. In this paper, the principle and characteristics of BiFC，the application advances, the limitation and future prospects of BiFC assays are described. Key wordsBimolecular fluorescence complementationBiFC；

Natural Variation in the Promoter of GSE5 Contributes to Grain Size Diversity in Rice译文及感悟

GSE5启动子的自然变异有利于水稻粒宽多样性的增加 摘要 自然遗传变异的利用极大地促进了农作物重要农艺性状的改良。了解籽粒大小自然变异的遗传基础可以帮助育种者开发高产水稻品种。在这项研究中，我们通过将全基因组关联研究与功能分析相结合，在GSW5 / GW5基因座控制水稻粒径中鉴定出一种以前未被识别的基因，命名为GSE5。 GSE5编码与IQ结构域的质膜相关蛋白，其与水稻钙调蛋白OsCaM1-1相互作用。我们发现GSE5功能的丧失导致了宽粒和较重的谷物，而GSE5的过表达导致狭窄的谷物。我们证明，GSE5主要通过影响小穗壳中的细胞增殖来调节籽粒大小。根据其启动子区的缺失/插入类型，鉴定了栽培稻中GSE5（GSE5，GSE5DEL1 + IN1和GSE5DEL2）的三种主要单倍型。我们证明携带GSE5DEL1 + IN1单倍型的籼稻品种中的950bp缺失（DEL1）和携带GSE5（DEL2）单倍型的粳稻品种中的1212bp缺失（DEL2）与GSE5的表达降低相关，导致宽的谷粒。进一步的分析表明，野生稻种质中含有GSE5的全部三种单倍型，这表明栽培稻中存在的GSE5单倍型可能来源于水稻驯化过程中不同的野生稻种质。综上所述，我们的研究结果表明，在水稻育种者广泛使用的GSW5 / GW5基因座中，以前未被识别的GSE5基因控制着谷粒大小，并揭示了GSE5启动子区域的自然变异有助于水稻的粒径多样性。 介绍 现代农业必须迎接人口增长和耕地面积减少的挑战。稻米是一种非常重要的作物，为全球一半以上的人口提供食物。不同品种的遗传变异为水稻重要农艺性状的改良提供了有价值的资源。水稻育种家已经探索了涉及产量相关性状调控的基因的自然变异，以开发优良水稻品种。水稻产量由粒重，每穗粒数和单株穗数决定。谷粒大小与谷物重量，谷物产量和外观品质有关。已经在水稻中鉴定了几个数量性状基因（QTL），但是只有少数有益的等位基因被水稻育种者广泛使用。 亚洲栽培稻包括籼稻和粳稻亚种，它们在粒度和形状上表现出很大的变化。典型的籼稻品种产生长粒，而粳稻品种形成圆粒和短粒。据报道，部分稻米基因的自然变异是由水稻种植者选择的。例如，主要的粒长QTL（GS3）的自然变异有助于籼稻品种和粳稻品种之间的粒长差异。长粒籼稻品种通常含有功能缺失型等位基因，矮粳稻品种常具有野生型等位基因。相比之下，主要QTL（GSW5 / GW5）的自然变异决定了籼稻和粳稻品种的粒宽差异。先前的研究报道，GSW5 / GW5基因编码与泛素相互作用的未知蛋白。大多数粳稻品种的1212bp缺失破坏了qSW5基因，导致了谷粒的变宽。相比之下，籼稻品种在GSW5基因中不包含这种1212bp的缺失，从而产生狭窄的谷粒。此外，全基因组关联研究（GWAS）已经确定了多个关于栽培稻粒度的关联信号。最近使用GWAS方法鉴定了QTL基因GLW7 / OsSPL13。热带粳稻GLW7的高表达与大粒有关。然而，稻米自然变异的粒度基因尚未得到充分的探索。

2019高三生物30题汇总

一、丰台一模 30．（18分） 杂种优势是指杂交后代在生活力、抗逆性、适应性和产量等方面优于双亲的现象。但是由于杂种的后代会发生性状分离，无法保持杂种优势，农民必须每年购买新的种子。 袁隆平团队通过研究实现了水稻的无融合生殖（孤雌生殖），使杂种优势的性状得以保持。 （1 ）减数分裂过程中，同源染色体须先经过再分离，才能实现染色体的平均分配。 （2）科学家发现在植物中有三个基因osd1、spo11-1、rec8参与了减数分裂，诱导其突变后，突变体的减数分裂结果如图所示： 与野生型相比，osd1、spo11-1、rec8三个基因同时突变的纯合子进行减数分裂，形成的子细胞中染色体组成与（填“生殖细胞”或“体细胞”）相同。请据图说明原因。 （3）种子中的胚由受精卵发育而来，胚乳由受精极核发育而来。科学家在水稻中发现Baby boom(简称Ｂ)基因在胚的发育启动过程中有重要作用。 ①野生型和bb突变体种子在外观上没有差别，但是显微观察发现，bb突变体的胚 发育早期停滞或者只分裂不分化。用Bb和BB进行正反交，将产生的F1代种子 进行萌发实验，结果如下表所示： 子代亲本组合萌发种子 （BB） 萌发种子 （Bb） 未萌发种子 （Bb） 1 ♀BB ×♂Bb 59 6 2 28 2 ♀Bb ×♂BB 35 32 0

推测杂交组合1子代中部分种子不萌发的原因：。 ②为了进一步验证上述推测，选取B基因存在个别碱基差异的J品系和I品系进 行杂交，在授粉2.5小时后提取受精卵RNA，进行逆转录PCR扩增B基因，部分 测序结果如下图所示，结果说明：受精卵中B基因的mRNA是由 （填“父本”或“母本”）的B基因转录而来。 ③b突变基因中发生了1个碱基对的缺失，导致不能被限制酶SphI切开。Bb自交 所得种子中有部分不萌发，将野生型和未萌发种子的B/b基因用SphI进行酶切 鉴定，结果如下图所示。据图分析，未萌发种子的基因型为：。 （4）B基因在卵细胞中表达可使其直接发育为单倍体。水稻中另一基因MTL突变后可使受精卵中来自于精子的染色体消失，从而发育成单倍体。结合（2）（3）资料， 请写出使杂种优势性状得以保持的两种方法：。 30.(18分) (1)联会 (2)体细胞 因为spoll-1突变导致减数第一次分裂时同源染色体无法联会，rec8突变导致减数第一次分裂时着丝点分裂，osd1突变导致减数第二次分裂时细胞质无法分裂。 (3)①部分含b的精子受精后没有启动胚胎发育，导致种子不萌发(答“不能受精”不给分， 因为能形成种子)。

分子荧光分析法基本原理

分子荧光分析法基本原理 一. 分子荧光的发生过程 （一）分子的激发态——单线激发态和三线激发态 大多数分子含有偶数电子，在基态时，这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中，成对自旋，方向相反，电子净自旋等于零：S=?+(-?)=0，其多重性M=2S+1=1 (M 为磁量子数)，因此，分子是抗（反）磁性的，其能级不受外界磁场影响而分裂，称“单线态”； 图1 单线基态（A）、单线激发态（B）和三线激发态（C） 当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被激发跃迁到能量较高的轨道上，通常它的自旋方向不改变，即 ?S=0，则激发态仍是单线态，即“单线(重)激发态”； 如果电子在跃迁过程中，还伴随着自旋方向的改变，这时便具有两个自旋不配对的电子，电子净自旋不等于零，而等于1： S=1/2+1/2=1 其多重性： M=2S+1=3 即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂，这种受激态称为“三线(重)激发态”； “三线激发态” 比“单线激发态” 能量稍低。但由于电子自旋方向的改变在光谱学上一般是禁阻的，即跃迁几率非常小，只相当于单线态→单线态过程的 10-6~10-7。 （二）分子去活化过程及荧光的发生： （一个分子的外层电子能级包括S0（基态）和各激发态S1，S2，…..，T1…..，每个电子能级又包括一系列能量非常接近的振动能级） 处于激发态的分子不稳定，在较短的时间内可通过不同途径释放多余的能量（辐射或非辐射跃迁）回到激态，这个过程称为“去活化过程”，这些途径为： 1. 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞，把一部分能量以热的形式迅速传递给溶剂分子（环境），在10-11~10-13 秒时间回到同一电子激发态的最低振动能级，这一过程称为振动弛豫。

浙大考博细胞生物学历年考题

浙江大学2001年博士细胞生物学 一、名词解释（每题4分） 1.放射自显影(autoradiography) 2.血型糖蛋白(glycophorin) 3.流动镶嵌模型(fluid mosaic model) 4.微粒体(microsome) 5.膜骨架(membrane associated cytoskeleton) 6.促成熟因子(maturation promoting factor,MPF) 7.核定位信号(nuclearlocalization signal,NLS) 8.锌指模型(zinc finger motif) 9.联会复合体(synaptonemal complex,SC) 10.干细胞(stem cell) 二、简述核孔复合体的结构和功能。（10分） 三、什么是基因调控的顺式作用元件和反式作用元件，它们各有何特点？（10分） 四、试述癌变与分化在遗传上的联系。（10分） 五、什么叫细胞的程序死亡？有哪些调控因素？（10分） 六、根据生物膜结构模型的演变谈谈人们对生物膜结构的认识过程。（20分） 浙江大学2007年细胞生物学（甲） 一名解 1、RNA干扰 2、端粒酶 3、前胶原 4、泛素化途径 5、核小体 6、核定位信号 7、细胞周期同步化 8、细胞表面粘着因子 二问答题 1、何谓中等纤维？简述中等纤维在细胞内如何装配？ 2、简述受体酪氨酸蛋白激酶介导的RTKs-Ras信号通路组成及其功能。 3、简述分泌蛋白的合成加工与运输。 4、简述核糖体的活性部位及它们在多肽合成中的作用。 5、简述溶酶体基本类型、功能及与溶酶体有关的疾病。 浙江大学2008年博士细胞生物学（甲）考题 名词解释（每个5分） 1.分子伴侣；一组从细菌到人广泛存在的蛋白质，非共价地与新生肽链和解折叠的蛋白质肽链结合，并帮助它们折叠和转运，通常不参与靶蛋白的生理功能。主要有三大类：伴侣蛋白、热激蛋白70家族和热激蛋白90家族。 2.泛素化途径；是指泛肽激活酶、泛肽载体蛋白、泛肽-蛋白连接酶共同作用下，将泛肽C 端的羧基与底物蛋白的赖氨酸残基的ε氨基形成异肽键，后续泛肽以类似的方式连接成串，

分子荧光光谱法实验报告范文

分子荧光光谱法实验报告范文 一、实验目的 1.掌握荧光光度计的基本原理及使用。 2.了解荧光分光光度计的构造和各组成部分的作用。 3.掌握分子荧光光度计分析物质的特征荧光光谱：激发光谱、发射光谱的测定方法。 4.了解影响荧光产生的几个主要因素。 5.学会运用分子荧光光谱法对物质进行定性和定量分析。 二、实验原理 原子外层电子吸收光子后，由基态跃迁到激发态，再回到较低能级或者基态时，发射出一定波长的辐射，称为原子荧光。对于分子的能级激发态称为分子荧光，平时所说的荧光指分子荧光。 具有不饱和基团的基态分子经光照射后，价电子跃迁产生荧光，是当电子从第一激发单重态S1的最低振动能级回到基态S0各振动能级所产生的光辐射。 (1)激发光谱 是指发光的某一谱线或谱带的强度随激发光波长(或频率)变化的曲线。横坐标为激发光波长，纵坐标为发光相对强度。 激发光谱反映不同波长的光激发材料产生发光的效果。即表示发光的某一谱线或谱带可以被什么波长的光激发、激发的本领是高还是低；也表示用不同波长的光激发材料时，

使材料发出某一波长光的效率。荧光为光致发光，合适的激发光波长需根据激发光谱确定——激发光谱是在固定荧光波长下，测量荧光体的荧光强度随激发波长变化的光谱。获得方法：先把第二单色器的波长固定，使测定的λem不变，改变第一单色器波长，让不同波长的光照在荧光物质上，测定它的荧光强度，以I为纵坐标，λex为横坐标所得图谱即荧光物质的激发光谱，从曲线上找出λex，，实际上选波长较长的高波长峰。 (2)发射光谱 是指发光的能量按波长或频率的分布。通常实验测量的是发光的相对能量。发射光谱中，横坐标为波长（或频率），纵坐标为发光相对强度。 发射光谱常分为带谱和线谱，有时也会出现既有带谱、又有线谱的情况。发射光谱的获得方法：先把第一单色器的波长固定，使激发的λex不变，改变第二单色器波长，让不同波长的光扫描，测定它的发光强度，以I为纵坐标，λem为横坐标得图谱即荧光物质的发射光谱;从曲线上找出最大的λem。 (3)荧光强度与荧光物质浓度的关系 用强度为I0的入射光，照射到液池内的荧光物质时，产生荧光，荧光强度If用仪器测得，在荧光浓度很稀(A0.05)时，荧光物质发射的荧光强度If与浓度有下面的关系：If=KC。 三、实验试剂和仪器

蛋白相互作用研究法

细胞水平的蛋白质相互作用研究方法 【摘要】本文介绍了蛋白质研究中常用的在细胞水平研究蛋白质相互作用的方法，即酵母双杂交系统、荧光共振能量转移技术、蛋白质片段互补技术、双分子荧光互补技术、绿色荧光蛋白临近成像法等等。并比较了各自的优缺点以及应用范围。 【关键词】蛋白质相互作用酵母双杂交荧光共振能量转移片段互补双分子荧光互补绿色荧光蛋白临近成像 蛋白质是生物体中绝大多数生命活动的基本执行单位，参与细胞中几乎所有的生化过程；而细胞内复杂的生化反应网络的运行离不开不同蛋白质之间的相互作用。蛋白质相互作用在蛋白质功能复合体的构建、细胞信号转导、物质跨膜运输、酶促修饰等过程中是必不可少的，因而研究细胞生命活动的完成离不开对相关蛋白质间相互作用的研究。相关研究方法很多，但能在细胞水平上展示蛋白质相互作用的存在是最为直接而有说服力的方法。目前，细胞水平的研究方法主要有以下几种： 1酵母双杂交系统(Yeast two-hybrid system, Y2H) 酵母中的Gal4转录调控因子由N端DNA结合域(binding domain, BD)和C端转录激活域(activating domain, AD)构成，完整的Gal4因子能有效激活下游基因的表达。将诱饵蛋白(bait)和靶蛋白(target/prey)基因分别与BD、AD基因融合，并在酵母中表达，如果表达的诱饵蛋白与靶蛋白之间相互作用使得BD、AD结构与空间上相互靠近，就会激发完整的Gal4活性引发报告基因的表达，检测报告基因产物即可知被研究蛋白间是否有相互作用。 酵母双杂交系统的限制在于只能研究核蛋白的相互作用，并且融合蛋白在酵母细胞中并不一定具有天然活性，易产生假阳性和假阴性，但是作为一种能够进行大规模筛选的方法仍有优势。由此衍生的方法有细菌双杂交系统和哺乳动物双杂交系统等。 2荧光共振能量转移技术(fluorescence resonance energy transfer, FRET) 当两个荧光基团在空间上充分靠近(1–10nm)时，适当波长的光波会引发供体基团与受体基团产生共振，供体基团所吸收的能量通过共振向受体基团转移，受体基团受激发产生荧光。应用基因操作手段可以将蓝色荧光蛋白(CFP, 供体)和黄色荧光蛋白(YFP, 受体)分别与待研究的蛋白融合并在细胞中原位表达，通过检测光激发下细胞发出的光波波长即可判断是否发生了共振能量转移，即两蛋白是否有相互作用。 FRET的效果易受外源荧光导致的光漂白和背景噪音影响，在此基础上发展了化学发光共振能量转移技术，该技术用荧光酶的自发荧光代替FRET中的外源荧光，当蛋白质相互作用导致空间上的靠近时，由供体荧光酶向受体荧光蛋白进行能量转移，通过测量供体自身发光强度与受体发光强度之比得出相互作用强弱，避免了以上影响。共振能量转移技术具有高灵敏度和实时监测、对相互作用进行定位等优点。缺点是成本较高。 3蛋白质片段互补技术(protein complementation assay, PCA) 蛋白质功能的实现依赖于结构的完整性，完整蛋白的两个互补片段不能单独发挥作用，但若在空间上距离足够近就可以恢复原有功能。PCA技术将功能蛋白分割为适当的两部分分别与目标蛋白融合，当目标蛋白在细胞中靠近相互作用时，被分割的蛋白片段互补恢复活性，通过检测活性即可判断目标蛋白是否发生相互作用。

分子荧光光谱实验报告

分子荧光光谱实验报告 篇一：分子荧光光谱实验报告 分子荧光光谱实验报告 一、实验目的： 1.掌握荧光光度法的基本原理及激发光谱、发射光谱的测定方法；学会运用分子荧光光谱法对物质进行定性分析。 2.了解荧光分光光度计的构造和各组成部分的作用。 3.了解影响荧光产生的几个主要因素。二、实验内容：测定荧光黄/水体系的激发光谱和发射光谱； 首先根据已知的激发波长（如果未知，则用紫外分光光度计进行测量，以最大吸收波长为激发波长）测定发射光谱，得到最大发射波长；然后根据最大发射波长测定激发光谱，得到最大激发波长；然后在根据最大激发波长测定测定发射光谱； 根据所得数据，用origin软件做出光谱图。三、实验原理： 某些物质吸收光子后，外层电子从基态跃迁至激发态，然后经辐射跃迁的方式返回基态，发射出一定波长的光辐射，此即光致发光。光致发光现象分荧光、磷光两种，分别对应单重激发态、三重激发态的辐射跃迁过程。本实验为荧光光谱的测定。 激发光谱：在发射波长一定的条件下，被测物吸收的荧

光强度随激发波长的变化图。 发射光谱：在激发波长一定的条件下，被测物发射的荧光强度随发射波长的变化图。 各种物质均有其特征的最大激发波长和最大发射波长，因此，根据最大激发波长和最大发射波长，可以对某种物质进行定性的测定。 四、荧光光谱仪的基本机构 五、实验结果与讨论： XX00 S1 / R1 (CPS / MicroAmps) 150000 100000 50000 0Wavelength (nm) 400000 S1 / R1 (CPS / MicroAmps) 300000 XX00 100000 Wavelength (nm) 400000 荧光黄/水体系第二次发射光谱S1 / R1 (CPS /

浅谈荧光分析法的特点及在环境分析中的应用

荧光分析法的特点及在环境分析中的应用 摘要：论文综述了荧光分析法的特点及在环境分析中的应用。重点分析了荧光分析法的原理、特点，以及常用的荧光分析法的讨论。分析了荧光分析法在环境监测中的应用，测定范围和发展情况。 关键词：荧光分析；环境分析；应用 1.引言 环境中分析、监测的对象往往是微量、超微量的物质，有很多还具有时间性和空间性，因此对分析技术要求越来越高。荧光分析法和分光光度法以其灵敏度高、检测限低、准确性好等优点在近年来得到了迅速发展。荧光分子探针的设计合成以及荧光分析法在环境分析化学中的应用是方兴未艾的研究方向[1]。 分子荧光分析具有检测限低，灵敏度高，选择性好，取样量少，方法简捷快速等特点，是一种重要的光谱化学分析手段，其中荧光分子探针检测技术在环境分析化学中占有重要的地位[2]。因此，在对环境的分析中，荧光分析法应用非常广泛，从天然水、饮用水到废水、污水；从土壤、大气到动植物；从人的头发、骨骼、血液到内脏等各个器官，涉及到的样品和应用范围几乎无所不有[3]。 2.荧光分析法的原理和特点 2.1.荧光分析法 2.1.1荧光及荧光分析 荧光是荧光化合物在受到紫外光、电和化学等能量激发后，电子从基态跃迁到激发态，然后通过辐射衰变释放出光子而回复到基态，即产生荧光。这些物质会在极短的时间内(8-10秒)发射出各种颜色和不同强度的可见光，而当紫外光停止照射时，所发射的光线也随之很快地消失。 荧光分析是指利用某些物质在紫外光照射下产生荧光的特性及其强度进行物质的定性和定量的分析的方法。1852年G.G.斯托克斯(G.G.Strokes)发现荧光，真正的荧光光谱测量则始于本世纪60年代。 2.1.2荧光激发光谱和发射光谱 荧光是一种光致发光现象，由于分子对光的选择性吸收，不同波长的入射光便具有不同的激发效率。如果固定荧光的发射波长不断改变激发光的波长，并记

双分子荧光互补技术(BiFC)(参考资料)

双分子荧光互补技术（BiFC） 一、技术简介 BiFC是由Hu 等在2002 年最先报道的一种直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术[1]. 有报道在GFP 的两个β片层之间的环结构（loop）上有许多特异位点可以插入外源蛋白而不影响GFP的荧光活性，BiFC技术正是利用该荧光蛋白家族的这一特性，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白连接。如果两个目标蛋白因为有相互作用而接近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基因而发出荧光。在荧光显微镜下，就能直接观察到两目标蛋白是否具有相互作用，并且在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互作用发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白复合物的稳定性，以及细胞信号分子对其相互作用的影响等，这些信息对研究蛋白质相互作用有重要意义。 其后发展出的多色荧光互补技(multicolor BiFC)，不仅能同时检测到多种蛋白质复合体的形成，还能够对不同蛋白质间产生相互作用的强弱进行比较.这项技术不需要特殊的设备，相互作用的蛋白也不需要特别的理论配比。因此，BiFC 技术已被国际上众多实验室采用，在活细胞内证明蛋白质的相互作用。本实验室成功应用该技术研究转录因子c-Jun、ATF2和c-Fos在原代神经元中的竞争性相互作用[2]。 BiFC技术以下几个特点使其对于研究蛋白质相互作用具有独特的优势：1、能在显微镜下直接观察到蛋白相互作用而且不依赖于其它次级效应；2、该相互作用可以在活细胞中进行观察，排除了由于细胞裂解或固定可能带来的假阳性结果；3、蛋白质在近似生理条件的环境下表达，表达水平及特性如翻译后修饰极大地接近于内源蛋白；4、不需要蛋白质有特别的理论配比，能检测到不同亚群蛋白质间的相互作用；5、多色BiFC技术不仅能同时检测到多种蛋白质复合体的形成，还能够对不同蛋白质间产生相互作用的强弱进行比较；6、BiFC技术除了荧光倒置显微镜外，不要求特殊的设备。 实验简单、快捷、直观，并适用于原核、真菌、植物、动物等多种组织、细胞. 该技术的完善与发展必然会为蛋白质组学、蛋白质相互作用连锁图的建立带来福音.

荧光分析法检测原理及应用举例

1荧光定义 某些化学物质从外界吸收并储存能量而进入激发态，当其从激发态回到基态时，过剩的能量以电磁辐射的形式放射出去即发光，称之为荧光。可产生荧光的分子或原子在接受能量后引起发光，供能一旦停止，荧光现象随之消失。 2荧光分类 由化学反应引起的荧光称为化学荧光，由光激发引起的荧光称为光致荧光，课题主要研究光致荧光。按产生荧光的基本微粒不同，荧光可分为原子荧光、X 射线荧光和分子荧光，课题主要研究分子荧光。 3光致荧光机理 某一波长的光照射在分子上，分子对此光有吸收作用，光能量被分子所吸收，分子具有的能量使分子的能级由最低的基态能级上升至较高的各个激发态的不同振动能级，称为跃迁。分子在各个激发态处于不稳定的状态，并随时在激发态的不同振动能级下降至基态，在下降过程中，分子产生发光现象，此过程为释放能量的过程，即为光致荧光的机理。光致荧光的过程按照时间顺序可分为以下几部分。 3.1 分子受激发过程 在波长为10~400nm的紫外区或390~780nm的可见光区，光具有较高的能量，当某一特征波长的光照射分子时，是的分子会吸收此特征波长的光能量，能量由光传递到分子上，此过程为分子受激发过程。分子中的电子会出现跃迁过程，在稳定的基态向不稳定的激发态跃迁。跃迁所需要的能量为跃迁前后两个能级的能量差，即为吸收光的能量。分子跃迁至不稳定的激发态中即为电子激发态分子。 在电子激发态中，存在多重态。多重态表示为2S+1 o S为0或1,它表示电子在自转过程中，具有的角动量的代数和。S=0 表示所有电子自旋的角动量代数和为0,即所有电子都是自旋配对的，那么2S+仁1,电子所处的激发态为单重态，用S i 表示，由此可推出，S0 即为基态的单重态，S1 为第一跃迁能级激发态的单重态，S2为第二跃迁能级激发态的单重态。S=1表示电子的自旋方向不能配对，说明电子在跃迁过程中自旋方向有变化，存在不配对的电子为2个，2S+仁3,电子在激发态中位于第三振动能级，称为三重态，用T i 来表示，T1 即为第一激发 态中的三重态，T2即为第二激发态中的三重态，以此类推。 分子跃迁至各个激发态中，状态不稳定，随时会释放出能量，释放能量的类型有两种：一种是辐射跃迁，另一种是非辐射跃迁，释放能量会回到稳定的基态。

时间分辨荧光分析技术

1.1 时间分辨荧光分析技术 时间分辨荧光生化分析技术是基于稀土荧光配合物特殊的荧光性质而建立起来的，自1978年提出以来[1]，已广泛的应用于免疫分析、核酸测定、荧光显微镜成像、细胞识别、单细胞原位测定、生物芯片等生化领域，并发展出了相应的时间分辨荧光免疫测定法、时间分辨荧光DNA 杂交测定法、时间分辨荧光显微镜成像测定法、时间分辨荧光细胞活性测定法及时间分辨荧光生物芯片测定法等分支。 本节主要对稀土荧光配合物的发光机理、荧光性质，时间分辨荧光测定的原理，时间分辨荧光免疫分析技术，时间分辨荧光显微镜成像技术的研究进展等加以介绍。 1.1.1 稀土荧光配合物的发光机理及荧光性质 稀土元素指的是元素周期表中IIIB 族的镧系元素以及钪和钇，共17种元素。其中镧系元素的外层电子结构为4f 0-145d 0-106s 1-2，由于5s 和5p 电子对4f 电子的屏蔽作用，导致这些金属及其离子的性质十分相似。图1.1给出了四种三价稀土离子的基态及激发态电子能级图[2]。 1020 152530355 E N E R G Y ,103c m -1 6 H 5/2 G 5/2 6 H 15/2 7 F 0 F 2D 0 5D 1 7F 6 F 5 4 5D 3 13/2 4 9/2 Sm 3+ Eu 3+ Tb 3+ Dy 3+ H 9/2 图1.1 部分三价稀土离子的电子能级图 Fig. 1.1 Electronic energy levels of certain lanthanide(III) ions 大部分稀土离子本身是不具有荧光性质的，只有Sm 3+、Eu 3+、Tb 3+和Dy 3+的水溶液在紫外光或可见光的激发下能够发出微弱的荧光。当Sm 3+、Eu 3+、Tb 3+和Dy 3+与某些有机配位体形成配合物时其荧光强度会显著增强，这种发光是基于配合物由配位体到中心稀土离子的能量转移所产生的[3-8]。以铕(III)配合物为例，其荧

双分子荧光互补技术及其在蛋白质相互作用研究中的应用

双分子荧光互补技术及其在蛋白质相互作用研究中的 应用 摘要 双分子荧光互补技术是近年发展起来的用于体或体外检测蛋白质相互作用的一项新技术。该技术是将荧光蛋白在合适的位点切开形成不发荧光的2个片段，这2个片段借助融合于其上的目标蛋白的相互作用，彼此靠近，重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子，从而产生荧光。BiFC方法简单直观，具有可视性的特点，对温度敏感，荧光片段种类较多，被广泛地应用到不同的细胞中，既可以检测蛋白之间的相互作用，也可以定位蛋白质相互作用的位点。此外，BiFC还能在蛋白构型的确定以及RNA的检测方面发挥作用。经过若干年的发展，双色荧光互补技术已经发展成包括多色荧光互补技术，BiFC和FRET 联用技术以及BiFC和YTH联用技术在的多种技术，拓宽了BiFC的应用。 关键词：双分子荧光互补技术；蛋白质片段互补；荧光蛋白；蛋白质相互作用 蛋白质之间的相互作用(Protein-protein interactions，PPIs)形成了细胞中的调节网络，用来调控细胞的许多功能。因此，研究蛋白之间的相互作用对于深入了解许多生命过程具有非常重要的意义。迄今为止，已经建立了多种技术和方法用于研究蛋白与蛋白之间的相互作用，如酵母双杂交技术(Yeast two-hybrid, YTH)，荧光共振能量迁移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET)和蛋白片段互补技术(Protein fragment complementations, PFCs)等方法(表1)。在蛋白片段互补技术中，双分子荧光互补技术(Bimolecular fluorescence complementation, BiFC)由于观察直观，检测方便以及能实现在活细胞中对相互作用蛋白可视化等诸多优点，自从其被开发出来后，便得到了广泛地应用。 1 双分子荧光互补技术的提出及理论依据 BiFC技术本质上是一种蛋白质片段互补技术，是指将荧光蛋白多肽链在某些不保守的氨基酸处切开，形成不发荧光的N-和C-末端2个多肽片段。将这2个荧光蛋白片段分别连接到1对能发生相互作用的目标蛋白上，在细胞共表达或体外混合这2个融合蛋白时，由于目标蛋白质的相互作用，荧光蛋白的2个片段在空间上互相靠近互补，重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子，从而产生荧光[1](图1)。目前用于BiFC技术的荧光蛋白包

双分子荧光互补BiFC对照设置详细(revised)

内部对照也是必要的，可以标准化转染效率和蛋白在不同细胞中表达的差异。这个对照的完成是由，编码含目的蛋白的融合蛋白和完整的非片段蛋白（这个完整的蛋白里的荧光报告蛋白在不同的波长下发荧光）的质粒共转染细胞。在可视化过程中，one（其中一个蛋白，融合或完整）来确定BiFC复合体的荧光强度，和在消除背景信号后内部对照变成一个比值。这个比值代表了，BiFC效率，并可以与其他比值对比以确定其他形式的不同复合物的相对效率。 注意：细胞和质粒都是复数形式，意思是用多个相同质粒转染多个相同细胞，这样可以标准化转染效率！ 在其他文献上看到一个图，就不翻译了这个可能好懂很多。见下页：

Figure 4. Two key elements of a BiFC experiment: fusionorientation(融合方向) and controls. (A) Each of the two YFP halves (YFP N and YFP C) can be fused at either its N- or C-terminus, with the protein of interest. Likewise, the protein of interest can also be fused to the YFP half via its N- or C-terminus. This creates four possible YFP-protein combinations for each protein of interest and eight combinations that should be tested for each interaction pair; (B) In addition to the protein-protein interaction to be tested, (i) appropriate negative controls should be incorporated in a BiFC experiment; These negative controls include substitution for one of the protein of interest by (ii) a mutated protein (mP1); (iii) a related protein (PX) that does not interact; and (iv) an unrelated protein (PY) with the same subcellular localization. The stars indicate YFP fluorescence due to self-assembly (one star) and expression due to a bona fide（一概而论）interaction between the test proteins (three stars). 上述Cited from A Cautionary Note on the Use of Split-YFP/BiFC in Plant Protein-Protein Interaction Studies