转基因基本步骤

第一步：目的基因的获取

1.目的基因是指：编码蛋白质的结构基因。

2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。

3.PCR技术扩增目的基因

（1）原理：DNA双链复制

（2）过程：

第一步：加热至90～95℃DNA解链；

第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；

第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。

第二步：基因表达载体的构建

1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。

2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因

（1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。

（2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。

（3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。

第三步：将目的基因导入受体细胞_

1. 转化的概念：

是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

2.常用的转化方法：

将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。

将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术。此方法的受体细胞多是受精卵。

将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，最常用的原核细胞是大肠杆菌，其转化方法是：先用Ca2+ 处理细胞，使其成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。

3.重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。

第四步：目的基因的检测和表达

1.首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA

分子杂交技术。

2.其次还要检测目的基因是否转录出了mRNA，方法是采用用标记的目的基因作探针与 mRNA杂交。

3.最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原－抗体杂交。

4.有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。

烟草遗传转化实验

烟草遗传转化实验文件管理序列号：[K8UY-K9IO69-O6M243-OL889-F88688]

实验八植物细胞悬浮培养实验目的：学习和掌握植物细胞悬浮培养的操作技术与方法。实验器材：超净工作台、恒温培养室、高压灭菌器、冰箱、恒温培养箱、培养瓶、250 mL 、500 mL三角瓶、镊子、酒精灯等。配置MS液体培养基（2，4-D 2 mg/L+1%甘露醇 +3% 蔗糖，pH 5.8）分装于250ml的三角瓶中，每瓶50ml。实验材料：烟草叶片愈伤组织。实验方法： 1.70%乙醇净化工作台并擦洗干净，将所用的材料、工具、培养基等放入工作台。打开紫外灯和风机，15分钟后关闭紫外灯开始方可操作。 2. 在超净台上用无菌镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织，放入150ml 三角瓶中并轻轻夹碎,每个三角瓶加入培养基20-30ml，每瓶接种1-2g愈伤组织，按愈伤组织与液体培养基1∶10的比例，以保证最初培养物中有足够量的细胞。 3.接种后的三角瓶用天平称取重量并记载，然后置于摇床上，在转速 100-120rpm，25℃下培养以及散射光条件下，进行振荡悬浮培养。4.每周更换新鲜液体培养基两次，每次更换1/3。每次更换新鲜培养基时称取重量。 5. 每个人接种悬浮培养细胞1瓶，观察并记录细胞生长情况。 6. 培养7天后，制作细胞生长曲线：为了解县浮培养细胞的生长动态，可用以下方法绘制生长曲线图：鲜重法：在转代培养的不同时间，取一定体积的悬浮培养物，离心收集后，称量细胞的鲜重，以鲜重为纵座标，培养时间为横座标，绘制鲜重增长曲线。烟草遗传转化实验实验目的

转基因烟草方法

2．材料与方法 2.1实验材料植物材料：K326烟草种子药品：MS大量元素，MS微量元素，MS铁盐,吲哚乙酸（IAA），6-苄氨基腺嘌呤（6-BA），烟肌醇(B1B6),蔗糖，琼脂，头孢霉素（Cef），羧苄青霉素（Carb），卡那霉素（Kn）、庆大霉素、利福平等； MS培养基(1L):大量元素(20x)50ml、微量元素(100x)10ml、Fe2+(100x)10ml、蔗糖30g、琼脂8g，PH值约为6.0 预培养基(1L)：大量元素(20x)50ml、微量元素(100x)10ml、Fe2+(100x)10ml、6-BA(1000x)2ml、B1B6(200x)5ml、甘氨酸(1000x)1ml、琼脂8g，PH值约为6.0。高温灭菌后加IAA(0.2mg/L)1ml 分化培养基(1L)：预培养基的基础上加入头孢霉素2ml，羧苄青霉素1ml，卡那霉素1ml. 生根培养基(1L)：1/2MS、IAA 2mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5.8g/L，pH=5.8 LB液体培养基(1L)：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCI 10g MS0培养基：为不加琼脂的只含大量元素MS培养基 2.3实验方法 2.3.1浸染菌液制备将含有目的基因的农杆菌在固体LB培养基上划板，28℃下暗培养两天。挑取单菌落，接种于5ml含50mg.L-1卡那霉素、50mg.L-1链霉素及50mg.L-1利福平的液体LB培养基中，28℃下振荡培养过夜。活化过夜的农杆菌，按1:50的比例，稀释到含50mg.L-1卡那霉素的新鲜液体LB培养基中，继续培养至OD600值约为0.5。取培养物1ml，置于无菌离心管中，12000rpm离心1分钟，弃上清。加入100ml的MS0培养基，混匀。 2.3.2烟草转化按叶圆盘法转化烟草。将剪切好的烟草叶盘放置在预培养基上培养1-2天后，置于悬菌液中（MSO悬浮，可以稀释50—100倍）浸泡3-5分钟。然后取出，用无菌滤纸吸去其表面的液体。将浸染过的叶盘分接种在覆有两层滤纸的预培养

植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定

植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定〖实验目的〗 1．了解创建烟草突变体库的方法； 2．理解每种方法的基本原理； 3．掌握农杆菌介导的转基因方法以及转基因产物筛选和鉴定的基本过程。〖实验原理〗随着越来越多植物的全基因组测序工作的完成，在此基础上开展功能基因组的研究是目前的核心研究内容之一。植物插入突变体库的建立是功能基因组研究的一个重要内容，在此基础上也能进行正向遗传学及反向遗传学的研究。在创制突变体的策略上，传统方法是使用物理或化学诱变方法获得，其优点是可在尽可能短的时间内获得饱和突变体。与传统的物理和化学诱变方法相比，生物诱变(T-DNA和转座子插人诱变)通常可标记突变基因，从而较为容易地分离鉴定靶基因。最近数年，通过农杆菌介导的T-DNA插入突变已成为国际公认的植物功能基因组学的主要研究方法之一。烟草是植物基因组研究的一种模式植物，其突变体库的创建是烟草功能基因组学研究中的重要内容，其目的是通过大规模的突变体库平台快速全方位的了解基因组中各个基因的功能。突变体的创制是遗传学研究的基础，也是分离基因和基因功能鉴定的最要途径。通过诱导培养，使烟草产生愈伤组织，利用土壤农杆菌感染愈伤组织，实现T-DNA标签在烟草愈伤组织基因组中大量随机插人，利用植物细胞的全能性，经过抗性筛选，诱导分化，从抗性愈伤组织获得烟草突变体再生植株，获得各突变体的纯合材料，从而建立烟草突变体的数据库，然后分析突变性状与T-DNA的共分离关系，存在共分离的材料用适当的Tail-PCR克隆技术获得T-DNA的侧翼基因组序列，用其作探针筛选基因文库，获取目标基因或克隆，再进行下一步的分析（图实验4-1）。 T-DNA 载体构建转化植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子

植物基因工程的新进展自1983年首次获得转基因烟草

植物基因工程的新进展自1983年首次获得转基因烟草、马铃薯以来，短短十余年间，植物基因工程的研究和开发进展十分迅速。国际上获得转基因植株的植物已达100种以上，包括水稻、玉米、马铃薯等作物；棉花、大豆、油菜、亚麻、向日葵等经济作物；番茄、黄瓜、芥菜、甘蓝、花椰菜、胡萝卜、茄子、生菜、芹菜等蔬菜作物；苜蓿、白三叶草等牧草；苹果、核桃、李、木瓜、甜瓜、草莓等瓜果；矮牵牛、菊花、香石竹、伽蓝菜等花卉；以霸占杨树等造林树种。应该说转基因植物研究取得了令人鼓舞的突破性进展。但是，以往的工作重点多在容易做的模式植物上，从而使烟草、马铃薯、番茄、矮牵牛、拟南芥菜等植物的分子生物学和转基因技术发展很快。近年内以实用为目标的研究数目大大增加，在国外，主要的种子公司和一些小公司竞相开发重组 D NA技术，用于重要作物的商业应用，将研究机构和大学首创的原理和科技用于开发，导致植物基因工程向重要粮食和豆科作物遗传改良的实用化目标迈进。在1988年以前，重要谷类作物和豆科作物的转化十分困难，只是在一种生物技术的新工具——“基因枪”研制成功以后，才使得这些作物的转基因不但成为可能，而且常常可以做到不依赖于品种或基因型。基因枪是用火药爆炸、电容放电或高压气体作为加速的动力，发射直径仅1微米左右的金属颗粒。微粒表面用优选的基因包覆，高速射入植物细胞，并在细胞内表达产生有活性的基因产物，从而达到改良品种的目的。最初大豆基因工程的重点放在原生质体和胚性悬浮细胞的再生上，但进展很慢，获得转基因大豆是一个很大的难题。基因枪的出现，使大豆转基因成为现实，实际上目前大豆已成为许多难转化作物的模式作物。在1988至1990年仅两年时，建立了可实用的大豆转化体系，这是目前唯一的不依赖于基因型的大豆转化方法。抗除草剂 B astar和Roundup的基因也已转入大豆，并在过去三年中连续进行了田间试验，预期不久将可商业化，这将是豆科作物基因工程商业化应用的一个里程碑。大豆基因工程今后的目标可包括蛋白质和油脂成分的修饰、抗虫、抗病毒及其他病害抗性等。水稻为世界第二大谷类作物，但在我国则为最大的粮食作物，年产18992万吨（中国农业年鉴1993）。我国和印度的水稻产量占世界总产量的60％，全球几乎一半人口以稻米为主要热量的来源。水稻和爪洼稻、籼稻占栽培水稻的80％，供世界20多亿人食用。水稻得到转基因植始于1988年，最初均以原生质体为受体，采用 D NA直接转移法，再生出了可育的转基因植株。但是，原生质体再生体系的限制很大，粳稻上只有少数品种如台北309等，可由原生质体再生植株，大多数优良的粳稻品种和绝大多数籼稻品种都难以由原生质体再生。可由原生质体再生植株的籼稻品种迄今尚未获得转基因植株。由于水稻未成熟胚的盾片再生植株的能力很强，几乎所有水稻栽培品种均能由未成熟幼胚再生。因此，一些科学家认为，原生质体转化在水稻上应用前景有限，最好是用基因枪转化水稻幼胚。最近

实验部2020等级考模拟考试生物试题

实验部2020等级考模拟考试生物试题 2020.05 一．选择题：本题 14 小题，每个小题 2 分，共 28 分。每小题给出的四个选项中，只有一个选项是符合题目要求的。 D.某片土壤缺乏 Mg 元素，但该土壤种植的植物仍能合成与光合作用有关的色素 4.下列有关元素和化合物的叙述，错误的是（） A.人体补充 Na＋、Cl－主要用于维持细胞内液渗透压的稳定与平衡； B.SARS 病毒含有 P 元素，可用同位素标记法使其带有32P 放射性 C.糖类既可以存在于细胞膜上，也可存在于细胞壁和细胞核中 D.脂质主要含有 C、H、O，是存在于所有细胞的重要有机化合物 5.某实验小组对某地处于不同放牧强度下伊犁绢蒿种群特征及其群落多样性进行了研究，结果如下图所示，下列叙述错误的是（）注：LG：轻度放牧，MG：中度放牧，HG：重度放牧，CK：对照区 A.各年份伊犁绢蒿种群密度均在轻度放牧情况下达到最大，重度放牧下达到最小 1

B.各年份随放牧强度增加，丰富度指数都呈现增加趋势，且重度放牧高于对照 C.调查表明适度放牧利于增加该地群落的丰富度，以此维持草地群落的稳定性 D.2013 年物种丰富度高但种群密度却低可能是气候条件适宜、草食压力大导致 7.新“肥胖因子”——GPNMB 蛋白是一种由肝细胞产生的蛋白,能被 Adam 蛋白酶剪切后以出芽的形式释放到细胞外。肝脏分泌的 GPNMB 蛋白能促进小鼠脂肪组织的脂质合成基因的表达,抑制机体产热,最终引起肥胖及胰岛素抵抗。下列叙述错误的是() A.GPNMB 蛋白是由内质网和高尔基体参与加工和运输形成的,并以胞吐的方式分泌 B.运用抗体中和 GPNMB 蛋白会抑制脂肪细胞中特有的脂质合成基因的表达C.用技术手段减少肝脏 GPNMB 蛋白基因的表达,可能会减轻肥胖并改善胰岛素抵抗的状况D.推测 GPNMB 蛋白大量表达会诱导肥胖,增加脂肪组织重量

烟草农杆菌转化实验步骤1

烟草农杆菌转化实验实验配方：1L RMOP: 20×大量元素50ml 200×微量元素5ml 200×有机5ml 200×铁盐5ml 3%蔗糖30g 0.8%琼脂（国产）4g/500ml 灭菌后，每500ml培养基加入: 0.1mg/L NAA 1mg/ml NAA 50μL 1mg/L 6-BA 1mg/ml6-BA 500μL YEB: 液体培养基：1L 酵母提取物1g 牛肉膏5g 蛋白胨5g 蔗糖5g MgSO4?7H2O 0.5g pH7.0 高压灭菌。固体培养基：每升YEB 液体培养基加15g 琼脂粉，高压灭菌。卡那霉素（Kan）储液：100mg/ml 利福平（Rif）储液：50mg/ml YEB 固体培养基平板: 灭菌后的YEB 固体培养基待其温度降至50℃时加入卡那霉素（Kan）和利福平（Rif），至终浓度为50mg/l，混匀后立即倒入培养皿，凝固后4℃倒置保存。一．农杆菌感受态细胞的制备（1）划线活化农杆菌，挑取农杆菌单菌落于3ml的YEB液体培养基（含Rif 50mg/l）中，28℃振荡培养过夜；（2）取过夜培养菌液1ml接种于50ml YEB（Rif 50mg/l）液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.5；（3）取2ml菌液，13000rpm，离心30sec, 弃上清；（4）加入10ml 0.1M CaCl2，使农杆菌细胞充分悬浮，冰浴30min；

（5）13000rpm，离心30sec，弃上清，置于冰上，加入2.5ml预冷的0.1M CaCl2，充分悬浮细胞，分装在1.5ml EP管中，液氮中速冻1min，置-80℃冰箱保存备用。二．质粒DNA导入农杆菌 ①电转法： 1.取农杆菌感受态在冰上冻融； 2.加2μL质粒DNA于100μL感受态细胞中，用枪头轻轻搅拌混匀； 3.然后再将其转入电转杯中（不要产生气泡），在2500V高压下电击； 4.取出电转杯，加入500μL预冷的YEB培养基（不含抗生素），轻轻吹打混匀，吸出菌液转入1.5ml离心管中，28℃，200rpm振荡培养5h； 5.取30-40μL菌液涂在含相应抗生素（50mg/l Kan和50mg/l Rif）的YEB平板上，28℃倒置培养1.5-2天； 6.挑选单菌落PCR检测，将阳性菌落保存。 ②冻融法： 1、在200μl感受态细胞中加入2－6μl质粒DNA，冰浴5min，液氮中速冻5min； 2、迅速转入37℃水浴中，热激5min； 3、加入1ml YEB（不含抗生素）液体培养基，28℃慢速振荡培养2－4小时； 4、3000rpm离心4min，去一部分上清，留取200μl菌液涂布于含有50mg/l Kan 和50mg/l Rif的YEB平板； 5、放置约0.5h，待水份干后，28℃培养约24小时至长出菌落。 6、挑选单菌落PCR检测，将阳性菌落保存。三．烟草遗传转化实验 ①准备农杆菌（1）将农杆菌在平板上划线，从平板上挑取单菌落，接种到20mL附加相应抗生素（kan 50mg/L, Rif 50mg/L）的YEB液体培养基中，在恒温摇床上，于28℃下以180r/min培养至OD600为0.6~0.8（约需17h）。（2）将OD600为0.6~0.8的菌液，按1%~2%的比例，转入新配制的无抗生素（含Rif）的YEB液体培养基中，可同时加入100~500μmol/L的乙酰丁香酮。在上述相同的条件下再培养6h左右，待OD600为0.2~0.5时即可用于转化。

烟草转基因操作细则

烟草转基因操作细则烟草无菌苗准备: 将烟草种子灭菌放入1/2 MS培养瓶中发芽；然后按2-3株每瓶移植到新的1/2MS培养瓶中一般组培光温条件下生长。转基因步骤： 1 10 mL YEB (YEP) 摇菌过夜（农杆菌菌株GV3101; EHA105 ）； 2 离心收集菌液； 3 用25 mL激活培养基(液)悬浮； 4 在28o C摇3- 5 h； 5 转入到培养皿； 6烟草叶片放到上面培养皿（含菌液的激活培养基）； 7 用解剖刀将烟草无菌苗叶片切至0.2-0.5 cm见方； 8 在激活培养基中浸泡10 min 左右； 9 将叶片取出，置于灭菌纸上吸干菌液； 10 将叶片放入共培养基上暗培养3天；然后将叶片用50 mL灭菌水（含一滴吐温和40 μL 头孢）洗4-6次，最后一次用纯灭菌水（不加吐温和头孢）； 11 将叶片转到筛选培养基（平板/或培养瓶）上，常规光温条件培养； 12 一般2周后有芽（小植株）出现；当小植株长出后，切下小植株转移到生根培养基（培养瓶）上培养。培养基配方激活培养基：MS (Suc 3%) + 200 μM As，pH5.2 (pH5.8)；共培养基：MS (Suc 3%) + 2 (1)* mg/L 6-BA + 0.05 (0.1) mg/L NAA，pH5.5 (5.8); 筛选培养基: MS (Suc 3%)+ 2 (1) mg/L 6-BA + 0.05 (0.1) mg/L NAA，pH5.8，头孢0.5g/L；潮霉素25 μg/mL（卡那霉素100 μg/mL）**；生根培养基：1/2 MS (Suc 3%) [（+ 2 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA，可以不加），pH5.8，头孢0.5 g/L；潮霉素25 μg/mL（卡那霉素100 μg/mL）。注：* [2 (1) mg/L 6-BA] 按(1)这些后面数据激素比例出愈（苗）率高，但是假阳性比例可能也较高。**一般来看潮霉素假阳性少，卡那霉素假阳性较多。

2019 2020人教版生物选修3课后习题13 基因工程的应用 Word版含答案

1.3 基因工程的应用基础巩固 1转基因动物是指( ) A.提供基因的动物 B.基因组成中转入了外源基因的动物 C.能产生白蛋白的动物 D.能表达基因遗传信息的动物解析转基因动物是指基因组中增加了外源基因的动物。答案B 2若利用基因工程技术培育能固氮的水稻新品种,其在环境保护上的重要意义是( ) A.减少氮肥使用量,降低生产成本 B.减少氮肥生产量,节约能源 C.避免因施用氮肥过多引起的环境污染 D.改良土壤的群落结构解析农业生产中大量使用氮肥容易造成水体富营养化,引起淡水“水华”、海洋“赤潮”现象,污染环境。利用基因工程技术培育能固氮的水稻新品种,可减少氮肥施用量,避免水体富营养化,保护环境。答案C 3下列哪项不是植物基因工程技术的主要应用?( ) A.提高农作物的抗逆性 B.生产某些天然药物 C.改良农作物的品质作器官移植的供体D.项为动物基因工程技术的重要应用。D解析 D

答案) ( 基因治疗是指4． A.把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中,达到治疗疾病的目的 B.对有基因缺陷的细胞进行修复,从而使其恢复正常,达到治疗疾病的目的 C.运用人工诱变的方法,使有基因缺陷的细胞发生基因突变后恢复正常 D.运用基因工程技术,把有缺陷的基因切除,达到治疗疾病的目的解析目前实施的基因治疗措施有体外基因治疗和体内基因治疗,其基本方法都是把相应的正常基因导入有基因缺陷的相关细胞中,从而使病人恢复正常。答案A 5科学家运用转基因技术,将苏云金芽孢杆菌的抗虫基因转到大白菜细胞中,培育出抗虫效果很好的优质大白菜,减少了农药的使用量,保护了环境。下列说法正确的是( ) A.抗虫基因中含有终止密码子 B.抗虫基因能在大白菜细胞中正常表达 C.转基因技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和载体 D.限制酶识别的序列一定是GAATTC 解析基因中不含有终止密码子,终止密码子存在于mRNA上。载体不是酶。限制酶有多种,不同的限制酶识别的序列大都不相同。答案B 6以下关于抗病转基因植物成功表达抗病毒基因后的说法,正确的是( ) A.可以抵抗所有病毒 B.对病毒的抗性具有局限性或特异性 C.可以抵抗害虫 D.可以稳定遗传,不会变异解析抗病毒转基因植物只可以抵抗某些病毒,并不是所有病毒,也不可以抗虫。抗病毒基因也会发生变异。答案B 7下列不属于利用基因工程技术制取药物的是( )

烟草遗传转化实验

实验八植物细胞悬浮培养实验目的：学习和掌握植物细胞悬浮培养的操作技术与方法。实验器材：超净工作台、恒温培养室、高压灭菌器、冰箱、恒温培养箱、培养瓶、250 mL 、500 mL三角瓶、镊子、酒精灯等。配置MS液体培养基（2，4-D 2 mg/L+1%甘露醇 +3% 蔗糖，pH 5.8）分装于250ml的三角瓶中，每瓶50ml。实验材料：烟草叶片愈伤组织。实验方法： 1.70%乙醇净化工作台并擦洗干净，将所用的材料、工具、培养基等放入工作台。打开紫外灯和风机，15分钟后关闭紫外灯开始方可操作。 2. 在超净台上用无菌镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织，放入 150ml三角瓶中并轻轻夹碎,每个三角瓶加入培养基20-30ml，每瓶接种1-2g愈伤组织，按愈伤组织与液体培养基1∶10的比例，以保证最初培养物中有足够量的细胞。 3.接种后的三角瓶用天平称取重量并记载，然后置于摇床上，在转速 100-120rpm，25℃下培养以及散射光条件下，进行振荡悬浮培养。 4.每周更换新鲜液体培养基两次，每次更换1/3。每次更换新鲜培养基时称取重量。 5. 每个人接种悬浮培养细胞1瓶，观察并记录细胞生长情况。 6. 培养7天后，制作细胞生长曲线：为了解县浮培养细胞的生长动态，可用以下方法绘制生长曲线图：鲜重法：在转代培养的不同时间，取一定体积的悬浮培养物，离心收集后，称量细胞的鲜重，以鲜重为纵座标，培养时间为横座标，绘制鲜重增长曲线。

烟草遗传转化实验实验目的烟草是遗传转化的模式植物，已经建立了一套完善的转化再生体系。本实验以烟草为实验材料，了解根癌农杆菌介导法的基本原理和一般步骤，掌握遗传转化的基本操作技术。实验要求：掌握根癌农杆菌侵染植物获取转基因材料的方法；理解农杆菌介导途径进行基因转化的机理；了解转基因植物筛选的方法。实验原理根癌农杆菌是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农杆菌中诱导植物产生肿瘤的质粒，简称为Ti质粒。野生型农杆菌的Ti质粒，含有两个与致瘤有关的区域：一个是T－DNA 区，含致瘤基因；另一个是毒性区，在T－DNA的切割、转移与整合过程中起作用。用于植物基因转化的农杆菌Ti质粒载体系统的构建，是将野生Ti质粒中的致瘤基因删除，并在T－DNA区域内插入适当的选择标记和多克隆位点。 p BI121载体是常用的植物表达载体，载体的骨架是pUC18，以CaMV35S启动子驱动的新霉素磷酸转移酶基因NPTII为卡那霉素（kan）抗性选择标记基因，含有卡那霉素抗性基因作为筛选基因。β－葡萄糖苷酶gus基因作为报告基因，转化的获得的转基因细胞、组织或植株，具有抗卡那霉素的特性，经组织化学染色呈蓝色。实验器材摇床、超净工作台、小型离心机、冰箱、移液抢、镊子、手术刀、酒精灯、棉球、培养皿、三角瓶、滤纸、牛皮纸、牙签。实验材料植物材料：烟草无菌苗农杆菌与载体：农杆菌LBA4404 p BI121 YEB培养基：牛肉膏(5 g/L)、蛋白胨(5 g/L)、酵母提取物(1 g/L)、蔗糖(5 g/L)、MgSO4 (0.5 g/L)、pH 7.0 烟草分化培养基：MS + 2mg/L 6-BA + 0.5mg/L IAA 烟草生根培养基：MS + 0.5mg/L IAA 卡那霉素（Kan）母液：50mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。头孢霉素（cef）母液：300mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。利福平(rif): 50mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。

烟草转化及CoIP方法

CoIP protocol From Guo Siyi 烟草转化体系将含有正确构建质粒的阳性农杆菌克隆在YEB 液体培养基中培养过夜，到OD600 约 1.5 左右（大约20h），同时摇菌P19，它能有效抑制植物对外源导入载体表达的沉默效应，提高表达量。然后收集菌体，5000 rpm 5min 常温离心，将菌体用侵染缓冲液（10 mM MES，100 μM AS-乙酰丁香酮，50 mM MgCl2）重悬，用紫外分光光度仪测定OD600 值；根据实验要求将含有不同载体组合的菌液混合，同时在每一个组合中也加入P19，最终使得每种菌液成分的OD600 在0.8 左右；然后将混合的菌液在28 ℃下以200 rpm 的转速再培养至少3 h，然后注射合适大小的烟草叶片。尽可能多的注射烟草叶片，并标记下注射的叶片及对应区域；之后用保鲜膜封闭，在暗中培养2 d，然后再转入光下培养2-3 d，并取材在荧光显微镜下观察GFP 的荧光已确定烟草叶片中外源载体的表达情况，视情况取材做后续的实验。免疫共沉淀（CoIP）将VER2，TaGRP2 与不同的标签蛋白融合如FLAG-VER2，TaGRP2-GFP，将该载体转化农杆菌获得阳性克隆，然后共同用农杆菌侵染的方法转化烟草。至少设定两组样品：即FLAG-VER2/TaGRP2-GFP 以及FLAG-VER2/GFP。检测目的蛋白是否表达：用Bradford 法测定提取蛋白的浓度，然后用SDS-PAGE 分离蛋白（15-30 μg protein/lane）做Western Blot 用（WB）标签抗体FLAG，GFP 检测融合蛋白是否在烟草中表达。并根据WB 的结果估算实验组（FLAG-VER2/TaGRP2-GFP）与对照组（FLAG-VER2/GFP）的蛋白相对表达量。 Pre-clear：（所有步骤尽量在冰上进行）取两份30 μL protein A/G beads 到EP 管中放于冰上，用600 μL 的蛋白提取buffer 重悬beads，4 ℃离心1000 g 1 min。冰上静止1 min，弃上清。（重复此操作3 次）将适量蛋白溶液（根据WB 结果，调整实验组和对照组蛋白样品，使得目的蛋白的表达基本相当，总蛋白在400-600 μg，溶液总体积在1 mL 左右，可用蛋白提取buffer 补齐）加入beads 中，4 ℃颠倒混匀1-2 h；然后4 ℃离心2000g 1 min，将上清转移至新EP 管中，取20 μL 样品待用，即Input。免疫沉淀：将上清中加入适量的GFP 抗体，根据WB 结果来加，10-20 倍于WB 的抗体用量。4 ℃颠倒混匀1-2 h，快到时间时，重新准备两份30 μL protein A/G beads 在新EP 管中放于冰上待用（用蛋白提取buffer 重悬3 次）。将混匀的蛋白+抗体溶液加入含有beads 的EP 管中，4 ℃颠倒混匀1-2 h。清洗杂蛋白： 4 ℃离心1000 g 1 min，将上清转移到新EP，此为UBP（unbinding protein），存于冰上待用。将beads 用wash buffer 清洗4- 5 次，600 μL/次，每次重悬后4 ℃离心1000 g 1 min。留40 μL 最后一次的wash buffer（即W5）于冰上待用。洗脱结合蛋白：将beads 用50 μL elution buffer 洗脱后加10 μL 6×SDS loading buffer，或者用60 μL 1×SDS loading buffer 煮沸5 min。WB 检测FLAG-VER2 蛋白是否与TaGRP2-GFP 蛋白共沉

烟草培养方法以及转基因方法

烟草转基因准备工具：EP管灭菌无菌水 Ms培养基 75%的酒精（蓝口小瓶）升汞(要回收) 1ml枪枪头 EP管架计时器一、转基因 (1) 无菌条件下，将烟草种子放入EP管中用无菌水冲洗2-3次； (2) 于75%的酒精中浸泡30-60sec； (3) 再用0.1%的升汞处理5min，最后用无菌水冲洗5次； (4) 播种于MS培养基上，培养在杭州师范大学生命与环境科学院植物学重点实验室组织培养室中，暗培养4天。25℃光照培养20-30天。 MS培养基pH5.8 (5) 待烟草苗长至3-5cm时（20-30天），取顶芽放于MS+BA0.2mg/L（壮芽，使其快速成长）培养基上，继代培养。 (6) 继代培养14天后（有小叶片即可），取叶片，大小1cmX1cm，切去叶柄，叶片表面及叶边缘划伤，放入MS+ BA1.0mg/L pH6.0-6.5的预培养培养基上，正面朝下紧贴培养基放置，于黑暗条件下预培养2-3天。 (7) 然后取出预培养的叶片或茎段，放入侵染液中进行侵染。侵染前一天晚上，摇菌农杆菌2瓶。将2ml离心管装满菌液，4000rpm离心5min，用悬菌液清洗两次。以1:10比例（10ml悬菌液放1管1.5ml菌体）放入悬菌液，加入As25mg/L（40ml 中加40ulAs）不断摇晃侵染液，使其与叶片及茎段切口处充分接触，10min后，取出，放于灭过菌的干燥滤纸上吸干菌液；

(8) 将叶片及茎段放回到预培养基上，28℃黑暗条件下共培养2-3天，至叶片切口周围有微菌斑形成； (9) 洗菌，取出共培养的烟草叶片及茎段，用添加500mg/LCef的无菌水冲洗5 次，第一次放置于摇床摇30min，后面每次5min，以洗去外植体表面的农杆菌； (10) 取出后，用滤纸吸干，转移到烟草诱芽培养基上，诱芽培养基为MS+ BA 1.0mg/L + Hyg25mg/L + Cef 500mg/L pH5.8；过2周观察，如果发现不长菌，则降低Cef浓度。如果长菌，则继续保持Cef浓度。 (11) 每两周更换一次培养基，直至长出不定芽（一般情况为2周）。切下再生的小苗（1cm 左右），转入继代培养基MS+ BA0.2-0.1mg/L+ Hyg25mg/L + Cef500mg/L pH5.8； (12) 至小苗长至2cm长时（有小芽即可），转接入生根培养基MS+ NAA0.2-0.1mg/L上，24 士1℃、12h 光照、1500lx 培养三周左右即可长出粗壮根系。 (13) 对生根的植株进行PCR初步检测，将结果呈阳性的植株经过炼苗后移到泥炭：蛭石=7:1的基质中，放入人工气候室进行培养，并对其生长情况进行观察、记录。农杆菌侵染液的制备 (1) 取-80℃冰箱保存的含有表达载体的农杆菌，划平板培养，LB固体平板中加入50mg/L Kan和50mg/L Rif； (2) 挑取单菌斑到含50mg/L Kan和50mg/L Rif的5mL LB液体培养基中，放入摇床中28℃、200rpm培养过夜（12h-16h）； (3) 保存菌种，750ul菌液加入灭过菌的甘油250ul，-80℃冰箱保存备用。 (4) 摇菌，LB液体培养基10ml加Kan（所需浓度50mg/L）10ul、Rif（所需浓度50mg/L）10ul及菌液10ul，28℃、200rpm过夜培养（12h-16h）。 (5) 当菌液浓度达到OD600=1.5左右时，取2mL菌液加入到离心管中，4000rpm

TaNAC提高转基因烟草的抗旱功能

生物技术 TaNAC提高转基因烟草的抗旱功能刘美英1,2,冶晓芳2,唐益苗2,高世庆2,张朝1,2,赵昌平2,陈学平1 1中国科学技术大学研究生院,化学系,合肥市金寨路96号230026; 2北京市农林科学院,杂交小麦工程技术研究中心,北京市海淀区西郊板井曙光花园中路9号100097 摘要:NAC(NAM ATAF CUC)转录因子在植物逆境胁迫应答反应中发挥重要作用。通过同源克隆的方法从小麦中分离得到一个编码NAC转录因子的基因 T a NAC,该基因编码的蛋白序列结构特殊,N端为保守性差的NAC保守域,只包含A,B,D3个亚结构域,进化关系上与DREB家族更近,其C端共同享有多个基序。实时荧光定量PCR实验证实TaNAC基因受干旱诱导24h后强烈表达。将该基因构建到PBI121双元植物表达载体的35S启动子下游,通过农杆菌介导的叶盘转化法转入烟草,获得T1代转基因苗。模拟干旱胁迫处理实验表明,过量表达Ta NAC的转基因烟草表现出明显优于野生型对照的抗旱功能,说明Ta NAC基因的过量表达能够提高烟草抗旱能力,T a NAC可以作为烟草抗旱育种的优良候选基因资源。关键词:NAC;转录因子;系统进化树;干旱胁迫;转基因烟草 doi:10 3969/j.issn.1004 5708 2010 06 016 中图分类号:S572 032 文献标识码:A 文章编号:1004 5708(2010)06 0082 07 Effects of Ta NAC on drought resistance in transgenic tobaccos LIU Mei ying1,2,YE Xiao fang2,TANG Yi miao2,GAO Shi qing2,Z HANG Zhao1,2, Z HAO Chang ping2,C HEN Xue ping1 1Department of Chemistry,Graduate School of University of Science and Technology of China,Hefei230026,China; 2Beijing Engineering and Technique Research Center of Hybrid Wheat,Beijing Acade my of Agricultural and Forestry Science,Beijing100097,C hina Abstract:NAC(NAM ATAF C UC)transcription factors play important roles in various stress response.In this study,one NAC gene named TaNAC encoding a NAC protein in wheat(Triticum aestivum L.)was identified.The putative TaNAC pro tein structure was special.The N terminal DNA binding domain consisted of only three subdomains(A,B,D),while the C terminal was similar to the DREB protein,sharing several motifs.Real time PCR confirmed that TaNAC was strongly induced after24h under drought treatment.Ta NAC was constructed into PBI121by c onnection with35S promoter;transgenic seedlings were obtained by Agrobacterium mediated genetic transformation https://www.360docs.net/doc/432866292.html,paring to wild types,overexpression of TaNAC gene showed significant drought resistance in transgenic tobaccos.It also indicated that TaNAC was excellent candi date for plant drought breeding. Key words:NAC;transcription factor;phylogenetic tree;drought;transgenic tobacco 作者简介:刘美英,女,硕士,主要研究方向:作物遗传育种,E mail: liumy@mai https://www.360docs.net/doc/432866292.html, 陈学平(通讯作者),男,博士,副教授,主要研究方向为作物遗传育种,E mail:chenxp08@us https://www.360docs.net/doc/432866292.html, 基金项目:国家转基因生物新品种培育重大专项(2008ZX08002 002, 2008ZX08002 003,2008ZX08002 004) 收稿日期:2010 06 02 NAC(NAM ATAF C UC)转录因子是近十几年来新发现的具有多种生物功能的植物特异转录调控因子。Aida等首先报道了NAC结构域,发现矮牵牛NAM 基因和拟南芥ATAF1/2和C UC2基因编码蛋白的N端均包含一段保守的氨基酸序列,取其首字母命名为NAC[1]。第1个NAC转录因子由Souer等从矮牵牛中克隆得到[2],随后在拟南芥、水稻、小麦、大豆等物种中

转基因方法

转基因方法一、基因枪法： 1、综述：基因枪法又称为高速微弹法、微粒抢法、微粒轰击法，是由康奈尔大学的Sanford等于1987年首次研制出的火药引爆基因枪，并与该校工程技术专家Wolf及Kallen合作研究出的一种基因转移的新方法。1990年美国杜邦公司推出商品基因枪PDS-1000系统。在此期间，高压放电、压缩气体驱动等各种基因枪相继出现，并都在重复的实践中得到改进和发展。其改进的核心是粒子加速系统，以提高射弹的可控度，即粒子速度和射入的浓度等。 2、基本原理：其基本原理是将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下微粒被高速射入受体细胞或组织。微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到植物染色体上，得到表达，从而实现基因的转化。根据基因枪的动力系统，可将它们分为三种类型：一类是以火药爆炸力为加速动力，其显著特征是塑料子弹和阻挡板。塑料子弹前端载放已沉淀有DNA的钨金粉。当火药爆炸时，塑料子弹带着钨金粉向下高速运动，至阻挡板时，塑料子弹被阻遏，而其前端的钨金粉粒子继续以高速向下运动，击中样品室的靶细胞。其粒子的速度主要是通过火药的数量及速度调节器控制，不能做到无级调整，可控度较低。第二类是以高压气体作为动力，如以氦气、氢气、氮气等。其工作原理是把载有DNA 的钨金粉喷洒在一张微粒载片上，电极间悬滴众着微水滴。在压缩空气的冲击下，微水滴雾状喷射，驱动载片。当载片受阻于金属筛网时，载有DNA的钨金粒继续向下冲击射入细胞。第三类是以高压放电为驱动力。其最大优点是可以无级调速，通过变化工作电压，粒子速度及射入浓度可准确控制，使载有DNA的钨金粉粒子能到达具有再生能力的细胞层。 3、步骤：（1）微粒体的洗涤。取60-100mg钨或金粉，溶于1ml无水乙醇中，用超声波振荡洗涤。微粒体处理后可在密闭条件下室温贮存一周。离心除去乙醇，密闭贮存于室温中，备用，保存时间不要超过一周。（2）DNA微粒载体的制备。（3）靶外植体材料准备。在无菌条件下截取靶外植体，放于样品皿中，外植体大小按基因枪要求选择；在无菌条件下把靶外植体放入基因枪的样品室，并对准子弹发射中心。（4）DNA微弹轰击，按照不同的基因枪说明书操作。（5）轰击后外植体的培养。DNA微弹轰击后立刻转入相应的培养基中培养，以免材料脱水加重细胞受伤害的程度，获得再生植株。 4、影响因素：（1）基因枪轰击参数，如基因枪类型、氦气压力、基因枪真空度、包裹金属粒子类型、金属粒子大小、载体膜位置、靶材料位置轰击次数、微粒加速装置参数等都会影响转化效率的高低。其中金属粒子以金粒效果最好、94.92kPa左右的氦气真空度为佳。（2）转化质粒的参数，如转化质粒的纯度要高、且浓度不宜过大。加入一定量的氯

2019-2020年高三二模生物试卷解析版

2019-2020年高三二模生物试卷解析版本试卷共14页，共300分。考试时长150分钟。考生务必将答案答在答题卡上，在试卷上作答无效。考试结束后，将答题卡交回。以下数据可供解题时参考：可能用到的相对原子质量：第一部分（选择题共120分）本部分共20小题，每小题6分，共120分。在每小题列出的四个选项中，选出最符合题目要求的一项。 1. 下列有关生物体内物质的叙述正确的是 A．植物细胞特有的糖类是葡萄糖 B．细胞内主要的能源物质是脂肪 C. 细胞内携带遗传信息的物质是核酸 D. 生物体内调节生命活动的信息分子是蛋白质答案：C 解析过程：葡萄糖是植物细胞和动物细胞共有的糖；细胞内主要的能源物质是糖；激素是生物体内产生的一类可以调节生命活动的信息分子，这种物质量少，发挥作用后立刻灭活，不参与代谢过程，不提供能量，不起催化作用，但是它们可以改变特定细胞的代谢过程，从而影响生命活动。 2. 若连续分裂的细胞处于一个细胞周期中，则细胞内 A．处于分裂期时会大量利用T与U B．DNA复制和转录过程的每个起点都多次起始 C．染色体的数目与DNA分子的数目始终保持相同 D．严格的调控机制保证了细胞周期的有序运行答案：D 解析过程：连续分裂的细胞分裂方式为有丝分裂，在一个细胞周期中，在分裂期时染色体高度螺旋化，无法进行DNA的复制和蛋白质的合成，故不会大量利用T与U；在一个细胞周期中，DNA只复制一次，DNA复制过程的每个起点只有一次起始，蛋白质可多次合成，转录过程的每个起点可多次起始；当出现染色单体时，DNA分子的数目是染色体的数目的2倍。3．Fabry病是一种遗传性代谢缺陷病，由编码α-半乳糖苷酶A的基因突变所致。下图是该病的某个家系遗传系谱，通过基因测序已知该家系中表现正常的男性不携带致病基因。下列分析不正确．．．的是 A．该病属于伴X隐性遗传病 B．Ⅲ2一定不携带该病的致病基因 C．该病可通过测定α-半乳糖苷酶A的活性进行初步诊断 D．可利用基因测序技术进行产前诊断来确定胎儿是否患有此病

转基因烟草材料

转基因烟草环境1102 程蕾 41113064 要点简介背景历史研究具体应用评价简介转基因烟草就是利用转基因技术应用到烟草植物的种植中。是把吞噬毒素的生物基因嫁接到了烟草植物身上。这些转基因植物，也称为基因改良植物，因为它们含有两种不同的组织，在实验室炸药的溶液中，这种植物增长很快。这些植物分解毒素比普通的植物要快。转基因烟草在吸收TNT污染的功能方面与清除RDX（旋风炸药）方面略有不同。烟草植物清除TNT基本上是把TNT的分子结构转换成无毒形式，而对于RDX，植物主要是把RDX 逐渐分解，分离出其中的氮元素，然后又把氮当作成长的肥料。简介转基因烟草，商业上有三种主要的转基因烟草种植：一是中国式的农艺：防病毒和抗虫性。其次是，维克托烟草在美国和其他国家生产的转基因烟草，具有低尼古丁的特点，再次就是用于提炼药物和烟草的替代产品。转基因烟草的种植和使用类型决定了所面临的风险因素是不同的。在许多国家里，如保加利亚、加拿大、法国和印度，烟草仍是用做转基因研究的背景在烟草中使用转基因技术仅是20年前的事情，当时一小部分的细菌基因被融合到烟草中，随后下一代的烟草都继承了这些属性，并在某种类型的烟草中进行了许多小规模的尝试。全球的转基因作物的面积从1995年开始逐渐增长，到2002年，大约有550到600万烟农种植转基因烟草。种植商业转基因作物的国家有美国、阿根廷、加拿大、中国、印度、德国等国家，其中美国的转基因烟草份额达到了全球的67%，阿根廷为23%，加拿大为6%，中国为4%。其中转基因比例最高的是大豆。种植生物技术的优势有环境优势、农业潜在作物生产、消费者的益处、加工者的利润和第三大世界农业。在美国40个州种植的转基因作物的产量、净利润和降低害虫方面都取得了显著的成效。研究作为基因工程研究的模式植物，烟草是进行转基因研究最早，也是转基因种类较多的经济作物。自1986 年以来，已经将烟草花叶病毒(TMV)，马铃薯Y 病毒(PVY)，马铃薯X 病毒(PVX)，黄瓜花叶病毒(CMV)，苜蓿花叶病毒(AMV)，烟草脆裂病毒(TRV)的外壳蛋白基因，PVY 复制酶基因、CMV 的微卫星RNA，几丁质酶基因、抗菌肽基因、葡萄糖氧化酶、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因(Bt)和蛋白酶抑制剂基因[2]等上百种外源基因转入烟草获得表达，使转基因烟草目的基因种类较为复杂。研究

烟草瞬时转化实验步骤

烟草叶片瞬时转化实验试验方法一、实验材料及药品 pCAMBIA 1381Z-Luc载体、Gv3101农杆菌菌株及其感受态、MES、MgCl2、乙酰丁香通、5-6周本氏烟草等二、载体构建及农杆菌转化烟草瞬时转化实验选用融合Luc信号的pCAMBIA 1381Z-Luc载体，载体构建过程是将拟南芥及菊花的FT启动子分别采用双切双连的常规载体构建方式将启动子构建到pCAMBIA 1381Z-Luc载体上，同时将目的基因构建到pMDC43或pMDC32或pORE载体上作为超表达载体进行后续的瞬时转化实验。通过农杆菌转化的方式，将上述构建好的质粒转化到农杆菌菌株GV3101的感受态细胞中。三、材料的准备 1、烟草植株5-6周幼嫩未开花植株 2、携带质粒的农杆菌（GV3101或An105均可） 3、YEB培养液（一瓶+K+R、一瓶只+R——pCAMBIA 1381Z-Luc载体为卡纳氯霉素抗性、Gv3101只有r抗性） 4、处理液：10mL配方如下母液配方（10ml配方）： 0.5M MES 200ul 0.976g 1M MgCl2100ul 2.03g 100mM乙酰丁香酮10ul 0.196g（使用DMSO溶解）灭菌水加至10ml （若长时间保存，需避光！）四、操作步骤 1、农杆菌转化 2、转化正确的农杆菌进行过夜培养，同时培养P19菌株（最好先进行划线） 3、确定不同农杆菌所加菌液的量：计算公式：V=n×Vfinal×0.5/OD600 VP19= n×Vfinal×0.3/OD600 OD600最好在1以上n=注射叶片数Vfinal=悬浮后的终体积多为2ml或3ml 注：在进行转录激活或抑制实验时，一般加入四种农杆菌（包括P19）而对照组往往只加入两种或三种菌液，此时，应使用Gv3101对体系进行补充，计算方法为公式一，具体加入量视对照组缺失的量确定，分别加入一倍或两倍Gv3101进行补充。 4、将计算出的各菌液体积进行混匀（此时各菌液实际浓度比例为1:1:1），5000rpm，5min 5、弃上清，用Vfinal（2ml或3ml）悬浮液进行悬浮，随后室温避光放置3h 6、利用无针头注射器注射叶片（先用针头在叶片上扎一个小孔）（注射烟草顶端以下第3-5片叶片） 7、暗培养1d，转入光照培养1-2d 8、利用稀释好的荧光素酶底物喷施到叶片上，黑暗下放置1-2min，随后利用CCD 冷冻相机进行观察。