多重耐药肺炎克雷伯菌可移动基因组的研究

摘要 ................................................................................................................................................... I ABSTRACT ..................................................................................................................................... I II 目录 ................................................................................................................................................. V I 第一章绪论 (1)

1.1多重耐药肺炎克雷伯菌 (1)

1.1.1条件致病菌概述 (1)

1.1.2肺炎克雷伯菌 (1)

1.1.3 耐药性和致病性 (2)

1.2 微生物比较基因组学的研究方法 (3)

1.2.1 微生物基因组学和比较基因组学 (3)

1.2.2 微生物信息学技术 (3)

1.3 细菌的可移动基因组 (4)

1.3.1 可移动基因组的种类与特征 (4)

1.3.2 可移动基因组的生物学意义 (7)

1.3.3 可移动遗传元件的识别与鉴定 (8)

1.4 本研究主要内容 (10)

第二章肺炎克雷伯菌HS11286可移动基因组的分析 (12)

2.1 前言 (12)

2.2 材料与方法 (13)

2.2.1 菌株和质粒 (13)

2.2.2 生物化学试剂 (15)

2.2.3 培养基 (17)

2.2.4 基本实验方法 (18)

2.2.5 插入缺失突变 (20)

2.2.6 抗菌药物敏感性试验 (22)

2.2.7 通过反选择筛选ICE自发缺失突变 (22)

2.2.8 生物信息学分析 (23)

2.3 结果与讨论 (24)

2.3.1 HS11286为ST11型 (24)

2.3.2 HS11286的可移动基因组 (25)

2.3.3 HS11286的可移动基因组与耐药性相关 (45)

2.3.4 HS11286中ICE介导周围染色体区域丢失 (56)

2.4 小结 (61)

第三章整合性接合元件的比较分析 (62)

3.1 前言 (62)

3.2 材料与方法 (63)

3.2.1 基本生物信息学方法 (63)

3.2.2 ICE数据收集 (64)

3.2.3 ICE分类 (65)

3.2.4 ICE分子生物学数据库开发 (65)

3.2.5 ICE的比较分析 (66)

3.3 结果与讨论 (67)

3.3.1 ICE数据收集结果 (67)

3.3.2 ICE家族定义 (69)

3.3.3 ICE数据库ICEberg (73)

3.3.4 ICE的组成特征和功能模块表征 (76)

3.4 小结 (83)

第四章整合性接合元件的生物信息学识别策略 (85)

4.1 前言 (85)

4.2 材料与方法 (86)

4.2.1 基本生物信息学方法 (86)

4.2.2 重组酶隐马尔科夫模型的收集 (86)

4.2.3 松弛酶隐马尔科夫模型的收集和构建 (86)

4.2.4 T4SS核心组份的识别 (86)

4.2.5 T4SS分子生物学数据库开发 (89)

4.2.6 革兰氏阳性菌中T4SS的识别 (90)

4.2.7 ICE的生物信息学识别 (91)

4.3 结果与讨论 (91)

4.3.1 重组模块的定量描述 (91)

4.3.2 接合转移模块的定量描述 (92)

4.3.3 基于功能模块特征的ICE模糊数学模型和预测识别 (103)

4.3.4 ICE识别方法的应用和评估 (105)

4.4 小结 (106)

第五章结论和展望 (108)

5.1 创新点 (108)

5.2 展望 (108)

参考文献 (109)

致谢 (125)

攻读博士学位期间发表的论文 (126)

VII

第一章绪论

1.1多重耐药肺炎克雷伯菌

1.1.1条件致病菌概述

条件致病菌（opportunistic pathogen）或称机会致病菌，是指在人体宿主受到扰动变为易感状态时致病的细菌。常见的扰动因素包括疾病、创伤、用药、感染（prior infection）、免疫缺陷、机体老化等。一些细菌如肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）、艰难梭菌（Clostridium difficile）、流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）等等都是常见的条件致病菌。条件致病菌一般是人体正常菌群的一部分，在宿主健康状态下基本不会致病。引发疾病的条件致病菌可能本身就是人体定植菌，例如S. pneumoniae，也可能是从环境中获得的，如P. aeruginosa；而其中一些菌可能也会对动物等其它类型宿主致病。与典型的毒力进化学说不同，条件致病菌的毒力进化被认为与所处机体环境有一定相关性[1]。不同条件致病菌的毒力因子、感染部位和涉及的致病机制存在差异。与致病菌相比，条件致病菌的致病能力相对较弱。但是，条件致病菌耐药问题日益严重，尤其是一些超级耐药菌的出现，如耐甲氧西林的S. aureus （methicillin-resistant S. aureus, MRSA）[2]和耐碳青霉烯肠杆菌科细菌（carbapenem-resistant Enterobacteriaceae, CRE）[3]等，已给人类健康带来极大威胁。条件致病菌通常引发感染性疾病，近期也发现一些肠道菌群中的条件致病菌可能会通过其它方式与宿主互作，在宿主非易感状态下参与或引起一些代谢相关疾病[4, 5]。

1.1.2肺炎克雷伯菌

K. pneumoniae作为一种重要的条件致病菌在近年来因其引发的严重耐药问题受到极大关注[3]。K. pneumoniae属于肠杆菌科，是革兰氏阴性、杆状、有荚膜的兼性厌氧型细菌，是一种常见的环境微生物。临床上K. pneumoniae能够引发医院内感染或社区获得性感染，导致肺炎、上呼吸道感染、尿路感染、血流感染、伤口或手术部位感染、脑膜炎或其他部位感染。K. pneumoniae已知的毒力因子包括荚膜、菌毛、脂多糖、铁载体、尿素酶和一些外排泵等，但深入的致病机制仍有待于阐述[6]。K. pneumoniae通常在免疫力低下的宿主中引发感染，通常不对免疫功能正常人致病。在人体内，K. pneumoniae通常寄居在体肠道中，也会在粪便中存在。寄居在肠道中的K. pneumoniae一般不引发感染，但是近期研究发现肠道中包括K. pneumoniae在内的Klebsiella属细菌可能与三聚氰胺导致的肾脏疾病相关，该属细菌能代谢三聚氰胺，产生的代谢物氰尿酸可引起肾脏损伤[5]。K. pneumoniae主要通过人与人之间直接接触传播，或在医院内通过接触被污染的医疗器械传播，极少情况下通过被污染的环境传播。β-内酰胺类抗生素和氨基糖苷类抗生素是常用的临床治疗K. pneumoniae感染药物。但是，近年来多重耐药K. pneumoniae的出现，尤其是耐碳青霉烯菌（carbapenem-resistant K. pneumoniae, CRKP），使K. pneumoniae感染的治疗面临严峻挑战。而且随着耐药性的日益