抗超氧阴离子自由基及生产超氧阴离子自由基测试盒
抗超氧阴离子自由基及生产超氧阴离子自由基测试盒
说明书修订日期：2015.07.13 Cat number：KGT012
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For Research Use Only（科研专用）
一、测定原理
模拟机体中黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应系统，产生超氧阴离子自由基O2—，加入电子传递物质及gress 氏显色剂，使反应体系呈现紫红色，可用分光光度计测其吸光度，当被测样本中含有O2。抑制剂时，则比色时测定管的吸光度低于对照管的吸光度，而如果被测样本中含有产生O2。物质时，则比色时测定管的吸光度高于对照管的吸光度，通过以维生素C做标准，可计算出被检物品对O2。的影响能力。
二、试剂盒组份
组份KGT012
50assays
Buffer A 5.0mL
Buffer B 5.0mL
Buffer C 5.0mL
Buffer D350μL
Buffer D稀释液 5.0mL
试剂E1支
试剂F1支
Vc标准品4支
注意事项
1．Buffer A室温较低时会有部分结晶析出，溶解后加蒸馏水稀释10倍至1×Buffer A50ml。
2．Buffer D用前用Buffer D稀释液按1︰14稀释至1×Buffer D（不可冷冻，4℃可保存2个月）。
3．试剂E配制：将试剂加入蒸馏水37.5mL中溶解后备用，4℃避光保存。
4．试剂F配制：将试剂加入蒸馏水37.5mL中溶解后备用，4℃避光保存。
5．显色剂配制：试剂E︰试剂F︰冰乙酸＝3︰3︰2的体积比配制，4℃避光保存（冰乙酸自备）。
6．Vc标准贮备液配制：将一支Vc标准品加蒸馏水定容至5ml（Vc标准配制后当天内使用）Vc标准品工作液（0.15mg/ml）配制：取1ml贮备液加4ml蒸馏水，5倍稀释现配现用。
Vc标准品配制后见光极易分解，配制的0.15mg/ml Vc标准品工作液需30分钟内检测。
三、操作步骤
试剂
测定管对照管标准管1×Buffer A （mL ） 1.0
1.0 1.0
蒸馏水（mL ）0.05
0.15mg/ml Vc 标准品（mL ）
0.05样品（ml ）0.05Buffer B （mL ）0.10.10.1Buffer C （mL ）0.10.10.11×Buffer D （mL ）0.10.10.1用涡旋混匀器充分混匀，置37水浴40分钟
显色剂（ml ）
2.0
2.0
2.0
10min 后倒入1cm 光径比色杯中，蒸馏水调零，波长550nm 处比色。
注：最佳取样量：因反应体系中在规定的底物浓度下，各种物质抗O 2。
能力不一样，根据朗伯—比尔
定律，取样量不可太大也不可太小，否则影响结果。因此在正式实验前必须做预试验以确定最佳取样量。
四、计算及举例（因各种物质不同，则定义及计算公式也不一样，具体如下）
（一）血清（浆）中抗超氧阴离子自由基活力单位的公式及计算：
1、血清（浆）中抗超氧阴离子自由基活力单位的定义：
在反应体系中，每升血清（浆）在37℃反应40分钟所抑制的超氧阴离子自由基相当于1mg 的维生素C 所抑制的超氧阴离子自由基的变化值为一个活力单位。2、公式：
样本测试前的稀释倍数
）标准浓度（标准管吸光度
对照管吸光度测定管吸光度
对照管吸光度离子活力单位血清（浆）中抗超氧阴???--=
ml 1000mg/ml 15.0)/U (L 3、举例：
取血清50μl 进行抗超氧化阴离子检测，测得对照管OD 值为0.570，测定管OD 值为0.230，标准管OD 值为0.256，标准管浓度为0.15mg/ml Vc 标准品。则计算结果为：
)
/(42.1621l 100015.0256
.0570.0230
.0570.0)/U (L U L =???--=
离子活力单位血清（浆）中抗超氧阴(二)组织中抗超氧阴离子自由基活力单位的公式及计算：1、组织中抗超氧阴离子自由基活力单位的定义：
在反应体系中，每克组织蛋白在37℃反应40分钟所抑制的超氧阴离子自由基相当于1mg 的维生素C 所抑制的超氧阴离子自由基的变化值为一个活力单位。2、公式：
）
蛋白含量（）标准浓度（标准管吸光度
对照管吸光度测定管吸光度
对照管吸光度）力单位（组织中抗超氧阴离子活gprot/L ml 1000mg/ml 15.0gprot /÷??--=
U 3、举例：
取1%大鼠胃粘膜匀浆50μl 进行抗超氧阴离子检测，测得对照管OD 值为0.506，测定管OD 值为0.267，标准管OD 值为0.265，蛋白含量0.657mgprot/ml ，标准管Vc 标准品的浓度为0.15mg/ml 。则计算结果为：
)
/(42.226657.0100015.0265
.0506.0267
.0506.0gprot /gprot U U =÷??--=
）力单位（组织中抗超氧阴离子活五、本法尚可检测产生超氧阴离子的改变，例如白细胞，某些中西药物等。其计算公式如下：
1、定义：在反应体系中，每升（克）物质在37℃反应40分钟所产生的超氧阴离子自由基相当于1mg
的维生素C 所抑制的超氧阴离子自由基的变化值为一个活力单位。
2、公式：公式①：
样本测试前的稀释倍数
）标准浓度（标准管吸光度
对照管吸光度测定管吸光度
对照管吸光度位产生超氧阴离子活力单???--=
ml 1000mg/ml 15.0)/U (L 公式②：
）
样本浓度（）标准浓度（标准管吸光度
对照管吸光度测定管吸光度
对照管吸光度）位（产生超氧阴离子活力单g/L ml 1000mg/ml 15.0g /÷??--=
U
超氧自由基清除能力测定法-操作图解
超氧自由基（·O2-）的清除能力测定法（连苯三酚自氧 化法） （适用于：SOD及各种抗氧化剂） 操作图解 具体方法 1 溶液配制 1.1 Tris溶液（0.1mol/L）：1.21 gTris（三羟甲基氨基甲烷，M.W. 121.1）+100 mL蒸馏水。 1.2 HCl溶液（0.1mol/L）：取0.1 mL浓盐酸，加蒸馏水稀释到6 mL。 1.3 Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4，含1mmol/L Na2EDTA） 40 mL0.1 mol/L Tris溶液+ x mL0.1 mol/L HCl溶液+15.2 mg Na2EDTA，混合，稀释到80 mL。用pH 计测量，pH应为7.4。用棕色瓶保存在冰箱内(最多保存三天) 。（以上为一个样品的用量）用前稍热至室温，再测pH值，符合要求即可。 1.4 60 mmol/L连苯三酚溶液（溶于1 mmol/L盐酸中） 取0.1mol/L HCl溶液（见1.2项）20μL，用蒸馏水稀释到2 mL，得1 mmol/L盐酸溶液（用pH计测量，pH＝2.5-3.0）。再往里加连苯三酚14.6 mg (M。W.126.1 )，即得。（当天有效,以上为1个样品的用量）。 2 测试液 2.1连苯三酚溶液：取2950μL Tris-HCl缓冲液加入到石英比色皿中，再加约50μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次A值（325nm），至300秒（5min）时为止。（空白参比：Tris-HCl 缓冲液） ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。由于ΔA值反映了生成·O2的初始浓度，所以，对于同一批实验而言，此时的ΔA值必须相等。此时的ΔA为ΔA0。 3.2 样品溶液：取xμL样品溶液加入到大石英比色皿中，再加（2950-x）μL Tris-HCl缓冲液，再加50μL 连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次（A值，325nm），至300秒时为止。（空白参比：Tris-HCl缓冲液） ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。此时的ΔA为ΔA样。 3 计算公式
超氧阴离子产生速率测定
超氧阴离子产生速率测定 羟氨氧化法 (王爱国，罗广华．植物的超氧物自由基与羟胺的反应[J]．植物生理学通讯，1990，(6)：55-57) 一、原理 植物组织器官的衰老总是伴着细胞内膜结构的破坏，表现为细胞内的电解质大量渗漏出来。很多研究结果表明，细胞衰老过程中膜的破坏是由细胞中(特别是线粒体和叶绿体)产生的自由基(如O2·ˉ、OH·、O2等)使膜脂中的不饱和脂肪酸发生过氧化作用而造成的。膜脂过氧化作用中产生的自由基，它不仅能连续诱发膜脂过氧化作用，而且还可以使蛋白质脱H+而产生蛋白质自由基，使蛋白质分子发生链式聚合，从而使细胞膜变性，最终导致细胞损伤、衰老和死亡。 二、材料、仪器设备与试剂 (一)材料 植物叶片、花瓣等器官 (二)仪器设备 低温高速离心机、微量加样器(1mL、20uL)、精密电子天平、分光光度计、试管、 研钵、剪刀、镊子、烧杯、试管架 (三)试剂 (1)0.05 mol·L-1磷酸缓冲液PH=7.8(0.66304g的NaH2PO4.2H2O和16.3849g的 Na2HPO4.12H2O定溶1000mL，校正PH) (2)10m mol·L-1盐酸羟胺(NH2OH·HCl，69.49，溶于水)0.3475g定溶到500mL，(冷) (3)17m mol·L-1对氨基苯磺酸(C6H7NO3S 173.19 1.4721g) 或者(C6H7NO3S·H2O 191.21 1.6253g)定溶到500mL，(冷，磁) (4)7m mol·L-1α-萘胺，0.5012g定溶到500mL，(乙醇溶解，定溶，溶解完全) 三、试验步骤 (1)制做亚硝酸根标准曲线 2mL系列浓度的NaNO2(5,4,3,2,1,0.5μg/L)加入4mL对氨基苯磺酸和4mLa－萘胺于25℃保温20min，然后测定OD530以［NO2－］和测得的OD530值互为函数作图，制的亚硝酸根标准曲线 (2)取0.2g植物材料，加入1.0mL 0.05 mol·L-1磷酸缓冲液(PH7.8)于冰浴研磨
超氧阴离子清除实验
·O2ˉ自由基清除实验 (1) 实验原理 黄嘌呤氧化酶 黄嘌呤＋H2O+O2尿酸＋H2O2+·O2ˉ 即黄嘌呤氧化酶在有氧条件下催化黄嘌呤转化为尿酸，同时产生超氧阴离子自由基(·O2ˉ)。·O2ˉ与NBT结合后呈蓝色，样品清除能力越大，与NBT结合的·O2ˉ越少，溶液的颜色越浅。 (2)试剂 Xanthine(黄嘌呤): (C5H4N4O2 ), MW=152.1, 6.084mg/100mL(0.4mmol/l) 实际配制：1.216mg/10mL，与NBT等体积混合使用 Xanthine oxidase(黄嘌呤氧化酶)贮液: 1 unit/mL , (溶解酶的溶液要高压灭菌！防止蛋白酶对酶的降解！) 0.05 unit/mL，每次取200uL稀释到4mL(PBS溶解) NBT: (Nitro blue tetrazolium chloride氯化硝基四氮唑蓝), MW=817.65, 黄色19.6236mg/100mL(0.24mmol/l) 实际配制3.925mg/10mL，与Xanthine等体积混合使用 PBS(0.01mol/L,pH=8.0): NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4(无水) 1.44g, KH2PO4 0.24g, 800mL水，用NaOH(1M)调pH到8.0，定容到1000mL。 实际配制500mL。高压灭菌，室温保存。 PBS(0.01mol/L,pH=7.4): 配制同上 Ascorbic acid: MW=176.12 母液为1mg/mL 先两倍逐级稀释5个浓度 实际配制见记录本！ HCl(1M): MW=36.5 310ul/10ml.(36% HCl密度1.18g/ml) 实际配制：800uL浓盐酸+9mL水，于塑料管中4℃保存。 NaOH(1M): MW=40 0.4g/10mL, 存于冰箱 (3) 测定方法 超氧阴离子自由基清除能力的测定参照Bae等人的方法略加改进。样品溶液1-5mg/ml 起始浓度，用于水或50%乙醇溶液。 Bae, S.W., Suh, H.J., 2007. Antioxidant activities of ve different mulberry cultivars in Korea.
超氧阴离子自由基检测试剂盒(磺胺比色法)
超氧阴离子自由基检测试剂盒(磺胺比色法) 简介： 超氧阴离子自由基作为生物体代谢过程中产生的一种自由基，可攻击生物大分子，如脂质、蛋白质、核酸和聚不饱和脂肪酸等，使其交链或者断裂，引起细胞结构和功能的破坏，与机体衰老和病变有很密切的关系，清除超氧阴离子自由基的研究已经得到了广泛的关注。 Leagene 超氧阴离子自由基检测试剂盒(磺胺比色法)又称超氧阴离子清除能力检测试剂盒，其检测原理是利用羟胺氧化的方法可以检测生物体系中超氧阴离子自由基(O 2-)，即超氧阴离子自由基(O 2-)与羟胺反应生成NO 2-，在一定范围内颜色深浅与超氧阴离子自由基(O 2-)成正比，根据NO 2-反应的标准曲线将A 530换算成NO 2-浓度，再依据上述关系式即可计算出O 2-浓度。该试剂盒主要用于测定植物组织中的超氧阴离子自由基含量或超氧阴离子清除能力。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、 蒸馏水 2、 实验材料：植物组织(大豆、绿豆、玉米等叶片)、血液、组织样本等 3、 研钵或匀浆器 4、 离心管或试管 5、 低温离心机 6、 恒温箱或水浴锅 7、 比色杯 8、 分光光度计 操作步骤(仅供参考)： 编号 名称 TO1123 50T Storage 试剂(A): NO 2-标准(1mM) 1ml RT 试剂(B): O 2- Lysis buffer 125ml RT 试剂(C): 羟胺溶液 30ml RT 试剂(D): 氨基苯磺酸显色液 30ml 4℃ 避光 试剂(E): 萘胺显色液 30ml 4℃ 避光 使用说明书 1份
1、准备样品： ①植物样品：取正常或逆境下的新鲜植物组织，清洗干净，擦干，切碎，迅速称取预冷的O2-Lysis buffer后冰浴条件下匀浆或研磨，4℃离心，上清液即为超氧阴离子自由基提取液，4℃保存备用。 ②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，4℃保存，用于超氧阴离子自由基的检测。 ③高活性样品：如果样品中含有较高浓度的超氧阴离子自由基，可以使用O2- Lysis buffer 进行恰当的稀释。 2、配制系列NO2-标准溶液：取出NO2-标准(1mM)恢复至室温后，以NO2-标准(1mM) 按下表继续稀释： 加入物(ml) 1 2 3 4 5 6 NO2-标准(1mM)0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 蒸馏水0.99 0.98 0.97 0.96 0.95 0.94 NO2-含量(μM) 10 20 30 40 50 60 3、O2-加样：按照下表设置空白管、标准管、测定管，溶液应按照顺序依次加入，并注意 避免产生气泡。如果样品中的超氧阴离子自由基浓度过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定，样品的检测最好能设置平行管。 加入物(ml) 空白管标准管测定管 蒸馏水1—— 系列NO2-标准(1-6号管) — 1 — 待测样品——0.25 O2- Lysis buffer ——0.25 羟胺溶液——0.5 混匀，25℃水浴孵育。 氨基苯磺酸显色液0.5 0.5 0.5 萘胺显色液0.5 0.5 0.5 混匀，30℃水浴孵育。 4、O2-测定：以空白调零，分光光度计(1cm光径比色杯)检测标准管、测定管530nm处吸光度(A标准、A测定)。 计算： 以系列NO2-标准(1-6号管)含量(μM)为横坐标，以对应的吸光度为纵坐标，制作标准曲线，根据测定管的吸光度进而计算NO2-含量。根据如下公式计算具体样品中超氧阴离子
对人体内超氧离子的除去方法的探究
对人体内超氧离子的除去方法的探究 超氧离子普遍存在于生物体内，氧化性强，具有一定的细胞毒性。根据研究，随着年龄增长，人体自身去除超氧离子的能力逐渐下降，因而造成人体的衰老。我对抑制人体衰老的方法产生了兴趣，因此选择了此题。本文将主要讨论人体内超氧离子的一些相关背景以及其去除的方法。 一、超氧离子在人体内的作用机理 自1900年，摩西?冈伯格在密歇根大学发现了历史上第一个被发现和证实的自由基——三苯甲基自由基以来，人类对自由基的理解与研究在一天天地发展着。接下来就浅谈一下超氧离子在人体内的作用机理及其危害。 需氧生物细胞中含有特异清除超氧阴离子自由基的酶——SOD。1968年，Mc Cord 和Fridovich发现SOD，在研究它的生物学作用的过程中，发现其对超氧阴离子自由基的清除作用，并由此提出了氧毒性的超氧化物自由基学说，一石激起千层浪。可以说，是SOD 的发现直接导致超氧阴离子自由基氧毒性理论的提出。根据此理论，超氧阴离子自由基本身、超氧阴离子自由基的衍生物等都具有细胞毒性。 就目前看来，超氧阴离子自由基能引起的疾病有：肺气肿、肺型氧中毒、自身免疫性疾病、老年白内障、辐射病等等。 二、去除人体内超氧离子的方法 通过对众多文献的查找，我找到了许多有去除超氧离子的作用的物质，它们大多是通过研究植物体和生物体去除超氧离子机理而发现和提取的，我将这些物质整理如下：（1）超氧化物歧化酶（SOD）去除超氧离子 诞生于1990年的明星产品大宝SOD蜜护肤品正是运用的这一原理，其广告语所称“经常使用大宝SOD蜜，能延缓皮肤衰老”，在理论上，也并不无道理。但是，SOD成分是否真的能被肌肤良好吸收，进而起到延缓衰老的作用，还需进一步的研究。 （2）黄酮类化合物去除超氧离子 人们观察到中草药的抗氧化作用，近年来相关研究逐渐引起重视。天然中草药中有效成分黄酮类化合物有芦丁、槲皮素、柚皮苷、桑色素、粗毛豚草素、橙皮苷等等，对它们清除O2-的研究相对较多，其中前三种清除O2-的能力较强。 （3）稀土元素去除超氧离子 随着稀土这一微量元素肥料在农业生产中的广泛应用，人们对稀土离子抑制超氧阴离子自由基的作用逐渐关注起来。研究发现稀土硝酸盐与超氧化物歧化酶（SOD）具有相似的性质，对肾上腺素自氧化生成的O2-有明显的抑制作用，其中体系中稀土硝酸盐的浓度与其对O2-的抑制率之间有明显的剂量效应关系。 据了解，目前市面上已经出现了以稀土元素为主要成分的面膜，但还未得到广泛的普及。 （4）人参皂苷去除超氧离子 近年来国内外学者纷纷对人参进行一系列研究。其中一项为人参皂苷，实验表明，人参皂苷确实在一定程度上起到清除自由基的作用；另外人参水提液也引起学者们的兴趣。 许多爱美人士都会经常性食用人参相关的产品，来延缓衰老，保持青春，市面上也出现
自由基清除剂
第五章自由基清除剂 本章要点 1.自由基理论的产生机理及来源 2.自由基对机体活动的影响 3.自由基清除剂的基本概念 随着生命科学的飞速发展，英国人Harman于1956年提出了自由基学说。该学说认为，自由基攻击生命大分子造成组织细胞损伤，是引起机体衰老的根本原因，也是诱发肿瘤等恶性疾病的重要起因，其中的观点被越来越多的实验所证明。 自由基（Free radical）是人体生命活动中各种生化反应的中间代谢产物，具有高度的化学活性，是机体有效的防御系统，若不能维持一定水平则会影响机体的生命活动。但自由基产生过多而不能及时地清除，它就会攻击机体内的生命大分子物质及各种细胞器，造成机体在分子水平、细胞水平及组织器官水平的各种损伤，加速机体的衰老进程并诱发各种疾病。 近年来，国内外对自由基及自由基清除剂的研究十分活跃，在各类食品科学、生命科学及医学书籍上都有许多关于自由基及其清除剂的研究报道，自由基清除剂作为功能性食品的重要原料成分之一，通过人们日常消费的食品来调节人体内自由基的平衡，已受到食品营养学家的广泛重视。 第一节自由基理论 一、自由基的产生机理及来源 自由基又叫游离基，它是由单质或化合物的均裂（Homdytic Fission）而产生的带有未成对电子的原子或基团。它的单电子有强烈的配对倾向，倾向于以各种方式与其他原子基团结合，形成更稳定的结构，因而自由基非常活泼，成为许多反应的活性中间体。 人体内的自由基分为氧自由基和非氧自由基。氧自由基占主导地位，大约占自由基总量的95%。氧自由基包括超氧阴离子（O2－·）、过氧化氢分子（H2O2）、羟自由基（OH·）、氢过氧基（HO2－·）、烷过氧基（ROO·）、烷氧基（RO·）、氮氧自由基（NO·）、过氧亚硝酸盐（ONOO－）、氢过氧化物（ROOH）和单线态氧（1O2）等，它们又统称为活性氧（reactive oxygen species，ROS），都是人体内最为重要的自由基。非氧自由基主要有氢自由基（H·）和有机自由基（R·）等。 （一）自由基的产生 人体细胞在正常的代谢过程中，或者受到外界条件的刺激（如高压氧、高能辐射、抗癌剂、抗菌剂、杀虫剂、麻醉剂等药物，香烟烟雾和光化学空气污染物等作用），都会刺激机体产生活性氧自由基。 人体内酶催化反应是活性氧自由基产生的重要途径。人体细胞内的黄嘌呤氧化酶、髓过氧化物酶和NADPH氧化酶等在进行酶促催化反应时，会诱导产生大量的自由基中间产物。除酶促反应外，生物体内的非酶氧化还原反应，如核黄素、氢醌、亚铁血红素和铁硫蛋白等单电子氧化反应也会产生自由基。外界环境，如电离辐射和光分解等也能刺激机体产生自由基反应，如分子中的共价键均裂后即形成自由基。 自由基反应包含3个阶段，即引发、增长和终止阶段。反应之初，引发阶段占主导地位，反应体系中的新生自由基形成许多链的开端，反应物浓度高。引发后的扩展阶段为反应的主体，若起始有几个引发自
清除氧自由基
1、超氧负离子 黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶系统产生超氧负离子产生超氧负离子 黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶、 清除超氧自由基负离子O2- 徐艳,曲婷婷. 甘草消除氧自由基的体外研究[J]. 食品研究与开发,2006,(8). 2、1.2.2NBT 光还原反应中主要试剂的配制 1.2.2.1 测试缓冲液: 0.026 mol/LMet- 磷酸钠缓冲液具体配制方法: 首先配制0.1 mol/LpH7.8Na2HPO4- NaH2PO4缓冲液 a 称取Na2HPO4·12H2O( MW=358.14) 3.581 4 g 于100 mL 小烧杯中, 加少量蒸馏水溶解后, 移入100 mL容量瓶中, 用蒸馏水定容至刻度。 b 称取NaH2PO4·2H2O(MW=156.01)0.780 g 于50 mL小烧杯中, 加少量蒸馏水溶解后, 移入50 mL 容量瓶中, 用蒸馏水定容至刻度。 c 量取91.5 mL a 液与8.5 mL b 液混合后, 该液即为0.1 mol/LpH7.8 磷酸钠缓冲液。 d 称取L- Met( MW=149.2) 0.194 1 g 于50 mL 小烧杯中, 用少量0.1 mol/LpH7.8 磷酸钠缓冲液溶解后, 移入50 mL 容量瓶中, 用0.1 mol/LpH7.8 磷酸钠缓冲液定容至刻度。 1.2.2.2 NBT( 氯化硝基四氮唑蓝) 的配制(7.5×10-4mol/L) 称取NBT( MW=817.7) 0.061 3 g 于50 mL 小烧杯中, 用少量蒸馏水溶解后, 移入100 mL 容量瓶中, 用蒸馏水定容至刻度。 1.2.2.3 核黄素溶液(2×10-5 mol/L) a.称取EDTA( MW=292) 0.002 92 g 于50 mL 小烧杯中, 用少量蒸馏水溶解。 b.称取核黄素( MW=376.36) 0.073 5 g 于50 mL 小烧杯中, 用少量蒸馏水溶解。合并 a 液和 b 液, 移入100 mL 容量瓶中, 用蒸馏水定容至刻度( EDTA0.1 mmol,核黄素2 mmol)。贮于冰箱中, 避光保存, 用时稀释100 倍。 1.2.3 甘草提取物溶液的配制 1.2.3.1 甘草酸溶液的配制 称取甘草酸0.05 g 用少量稀醇(10 %乙醇溶液)溶解后, 移入50 mL 容量瓶中, 用稀乙醇定容至刻度, 即为 1 g/ mL 的甘草酸溶液。 1.2.3.2 甘草次酸溶液的配制 称取甘草次酸0.05 g 用少量稀醇(10 %乙醇溶液)溶解后, 移入50 mL 容量瓶中, 用稀乙醇定容至刻度,即为 1 g/mL 的甘草次酸溶液。 1.2.3.3 甘草总黄酮组溶液的配制
如何清除体内自由基
如何清除体内自由基 消除体内自由基，应该要了解自由基的来源，从外界到身体内部的代谢一起中和性的描叙不要单方面的讲叙体内各种酶与自由基之间的关系 人体内的自由基有两个来源：其一是来自环境，如环境污染、食品污染、过度的紫外线照射和各种辐射、杀虫剂、室内外废气、吸烟、二手烟、酗酒、工作压力、生活不规律等等，都会直接导致人体内产生过多的自由基（活性氧）；食品添加剂、食用脂肪和熏炸烤肉、某些抗癌药物、安眠药、抗生素、有机物腐烂物、塑料用品制造过程、油漆干燥挥发、石棉粉尘、空气污染、化学致癌物、大气中的臭氧等也都能诱发人体内产生自由基。 其二是来自体内，人体内组织细胞的新陈代谢也会产生自由基，这是人体代谢过程的正常产物，十分活跃又极不稳定，它们会附着于健康细胞之上，再慢慢瓦解健康细胞，而被破坏的细胞则又再转而侵害更多健康的细胞，如此恶性循环从而导致人体的衰老和疾病的发生。另外，组织器官损伤后的缺血一段时间后又突然恢复供血(即重灌流)，如心肌梗塞、脑血栓、外伤、外科手术后，自由基会大量生成。正常人体有一套清除自由基的系统，但这个系统的力量会因人的年龄增长及体质改变而减弱，致使自由基的负面效应大大增强，引起多种疾病发病率的提高。活性氧自由基对人体的损害实际上是一种氧化过程。因此，要降低自由基的损害，就要从抗氧化做起。 听说过抗氧化剂吗？它对人体的健康可是有着密切的关系。既然自由基不仅存在于人体内，也来自于人体外，那么，降低自由基危害的途径也有两条：一是，利用内源性自由基清除系统清除体内多余自由基；二是发掘外源性抗氧化剂——自由基清除剂，阻断自由基对人体的入侵。 大量研究已经证实，人体内本身就具有清除多余自由基的能力，这主要是靠内源性自由基清除系统，它包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等一些酶和维生素C、维生素E、还原型谷胱甘肽、β-胡萝卜素和硒等一些抗氧化剂。酶类物质可以使体内的活性氧自由基变为活性较低的物质，从而削弱它们对肌体的攻击力。酶的防御作用仅限于细胞内，而抗氧化剂有些作用于细胞膜，有些则是在细胞外就可起到防御作用。这些物质就深藏于我们体内，只要保持它们的量和活力它们就会发挥清除多余自由基的能力，使我们体内的自由基保持平衡。 要降低自由基对人体的危害，除了依靠体内自由基清除系统外，还要寻找和发掘外源性自由基清除剂，利用这些物质作为替身，让它们在自由基进入人体之前就先与自由基结合，以阻断外界是自由基的攻击，使人体免受伤害。在自然界中，可以作用于自由基的抗氧化剂范围很广，种类极多。目前，国内外已陆续发现许多有价值的天然抗氧化剂。如β－胡萝卜素（维生素A）、维生素C、维生素E、番茄红素、辅酶q10、等等。此外，我国很多中草药植物中的有效成分都是天然抗氧化剂，例如，银杏黄酮、甘草黄酮等，另外还有巴西菇、灰树花、茯苓、黄芪、丹参、银杏、枸杞、灵芝、人参......。 吃什么可以减少体内自由基 在正常的生命过程中，自由基为维持生命所必需。体内自由基不断产生，也不断地被清除，两者 处于动态平衡之中，使之维持在一个正常的生理水平上。自由基在生物体内具有参与吞噬病原体，参 与前列腺素和凝血酶原的合成、解毒，参与体内部分生化反应和胶原蛋白的合成，调节细胞增殖与分化，参与机体免疫和环核苷酸的生物合成，以及生殖和胚胎发育等重要的生理功能。但是当自由基过 量时，自由基在机体内损伤蛋白质、核酸和生物膜，导致细胞凋亡，并参与许多疾病的发病过程。 由基清除剂即抗氧化剂清除机体自由基，保护机体免受氧化损害中起重要作用。因此，近年来对 自由基清除剂的研究备受关注。多吃点抗氧化剂食物有利于减少体内多余自由基。 方法/步骤 1.全面复方自由基清除剂：葡茶多酚胶囊。适当吃葡茶多酚可以全面清除体内多余自由
植物生理学实验
口试部分 实验一多酚氧化酶（PPO）活性的测定 实验原理：多酚氧化酶是植物体内普遍存在的一种非线粒体内的末端氧化酶。他可以把酚类物质如单酚、邻苯二酚、邻苯三酚、对苯二酚等氧化为氧化为相应的醌类物质。醌类物质对病原微生物起抑制作用或杀伤作用，具有一定的抗病能力。因此，在感病的植物体中，PPO 活性都具有不同程度的提高，以抵抗病原体进一步侵染健康的植物组织。此外，PPO对食品和饮料生产也会产生重大影响，它影响其品质，特别是在制作绿茶、红茶、烤烟和水果类饮料的过程中更为突出。所以，准确测定PPO活性，具有重要的生理和现实意义。多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在有氧的条件下，能使酚氧化产生醌，PPO反应在3分钟内呈直线上升，其后反应速度变慢，因而在研究时，用分光光度在3分钟内于410纳米波长下测其吸光度，即可计算出PPO的活力和比活力。 思考题：1、粗酶液提取中丙酮和磷酸缓冲液的作用，提取液为什么要预冷：丙酮是有机溶剂，能提取PPO，磷酸缓冲液为了保持酶活性，预冷降低酶活。 2、为什么要先在37度下恒温，再加酶液：使酶和底物处于最适状态。 实验二硝酸还原酶（NR）活性的测定 实验原理：硝酸还原酶是植物氮代谢中的关键酶，植物吸收的硝酸根，首先通过硝酸还原酶的催化，还原成亚硝酸根（NADPH+NO3-NR-NO2+NAD+H2O)。亚硝酸根可用磺胺显色法测定，即在酸性条件下，亚硝酸根与对氨基苯磺酸发生重氮反应，生成的重氮化合物又与盐酸萘乙胺生成红色偶氮化合物，可在520纳米下比色测定。 思考题1、为什么标准液与样品液的测定要在同一条件下：亚硝酸的磺胺比色法显色速度受温度和酸度等因素影响。 2、NR活性测定时取材为什么要进行一段时间的光和作用：进行光合作用积累一定糖类，否则酶活偏低。 3、测量酶活是为什么要在暗处：光下光反应会将形成的亚硝酸根转变成铵根，影响结果。 4、如果实验材料酶活过低怎么办：可在取样的前几天，用50mmol/l硝酸钾加在培养液中，以诱导硝酸还原酶的生成。 5、为什么要严格控制时间：本实验要是酶在最适条件下测酶活，要严格控制时间。 磺胺、盐酸萘乙二胺和硝酸钾的作用：在酸性条件下，亚硝酸根与对氨基苯磺酸发生重氮反应，生成的重氮化合物又与盐酸萘乙胺生成红色偶氮化合物，硝酸钾作为酶促反应的底物，亚硝酸钠用于制作标准曲线的梯度亚硝酸浓度。 6、粗酶液提取中丙酮和磷酸缓冲液的作用：磷酸缓冲液为了保持酶活性。 实验三电导法测定植物细胞膜透性 实验原理：植物组织在受到各种不利环境条件危害时，细胞膜的结构和功能首先受到伤害，细胞膜透性增加，其外渗液中的电解质的含量比正常组织的外渗液含量增加，组织受伤害越严重，电解质的含量增加的越多。用电导仪测定外渗液电导值的变化，可反映出质膜受伤害的程度，也可反映植物的抗逆程度。 思考题：1、在处理材料时，为什么要用真空泵抽气：以抽出细胞间隙空气，缓慢放入空气中，水即渗入细胞间隙。 2、为什么要清洗电导电极和温度传感器以及其他玻璃器皿：由于电导值变化非常灵敏，稍有杂质就会产生很大误差，因此所用的玻璃器皿均需多次冲洗干净。 3、抗逆性强的植物材料外渗液中的电导率高还是低，为什么？电导值与抗性成反比。 实验四植物光合与呼吸速率的测定 实验原理：由异原子组成的偶极距的气体分子，如CO2、CO、H2O、SO2、NO、NH3和CH4等，都有红外吸收带，其中CO2、H2O的吸收率最大，可用红外线分析法测定。CO2的吸收峰分别在2.69、2.77、4.26、14.09um，其中只有4.26um的吸收带不与水的吸收带重
超氧阴离子清除能力检测试剂盒说明书 可见分光光度法
第1页，共2页 超氧阴离子清除能力检测试剂盒说明书可见分光光度法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。货号:BC1410规格:50T/48S 产品内容: 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。试剂一：液体2mL×1瓶，4℃避光保存。 试剂二：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加8mL蒸馏水充分溶解。试剂三：液体10mL×1瓶，4℃保存。试剂四：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。试剂五：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。产品说明: 超氧阴离子自由基作为生物体代谢过程中产生的一种自由基，可攻击生物大分子，如脂质、蛋白质、核酸和聚不饱和脂肪酸等，使其交链或者断裂，引起细胞结构和功能的破坏，与机体衰老和病变有很密切的关系，清除超氧阴离子自由基的研究已经得到了广泛的关注。 AP-TEMED系统产生超氧阴离子，与盐酸羟胺反应生成NO 2－ ，NO 2－ 与对氨基苯磺酸和α－萘胺的作用生成红色的偶氮化合物，在530nm处有特征吸收峰，样品对超氧阴离子的清除能力与530nm的吸光值呈负相关。自备实验用品及仪器: 天平、研钵、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、1ml玻璃比色皿、恒温水浴锅。操作步骤:一、样品处理 1.组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提 取液，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。
2.细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取 液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。 3.培养液或其它液体：直接检测。 4.粉剂药物可配制成相同浓度，比如1mg/mL。 二、测定操作 空白管对照管测定管 试剂一（μL）404040 试剂二（μL）160160 H2O（μL）260100 充分混匀，25℃反应1min 样品（μL）100 试剂三（μL）200200200 充分混匀，37℃反应30min 试剂四（μL）200200200 试剂五（μL）200200200 充分混匀，37℃显色20min，于1ml玻璃比色皿，以空白管调零，在530nm处测定对照管 和测定管的吸光值，分别记为A对照管和A测定管。 注意：空白管只需测定一次。 三、计算公式 超氧阴离子清除率I%=（A对照管-A测定管）/A对照管×100% 注意事项： 1.试剂一4℃可保存2个月，配制好的试剂二4℃可保存一周，建议实验前配制，并尽快使用。 2.样品处理完后立即进行测定，或者低温保存不超过24小时。 第2页，共2页
自由基及检测方法
ESR 电子顺磁共振（EPR）或称电子自旋共振（ESR）现象最早发现于1944年。它利用具有未成对电子的物质在磁场作用下吸收电磁波的能量使电子发生能级间的跃迁的特征，对顺磁性物质进行检测与分析。 自旋捕集方法是将不饱和的抗磁性化合物（自旋捕集剂）加入反应体系,与反应体系中产生的各种活性高、寿命短的自由基结合形成相对稳定的自旋加合物,以适于ESR检测其原理是利用适当的自旋捕捉剂与活泼的短寿命自由基结合,生成相对稳定的自旋加合物,可以用电子自旋共振波谱法检测自旋加合物的数量,利用自旋加合物的数量来计算原来自由基的多少。 H： V： ESR测自由基是怎么被检测的（细胞，组织，溶液？体内，体外？） (MGD)2 - Fe2 +,是含有10mmol·L- 1MGD 和2mmol·L- 1FeSO4的溶液。 体外捕集：处死后取组织（血液、细胞），加入捕集剂，ESR测定 体内捕集：腹腔注射捕集剂，处死取组织（血液、细胞），ESR测定 腹腔注射几乎没有检测到自由基信号，或者信号很弱，而处死后样品加捕获剂则可以检测到自由基信号。 通用捕获剂 典型的自旋捕捉剂是亚硝基化合物或氮氧化合物，把足够量的自旋捕捉剂加入到产生自由基的体系中，自旋捕获剂就会快速地和任何出现的自由基反应，最后给出稳定的可检测的氮样氧自由基加合物。所形成的自由基加合物的ESR 谱上有被捕自由基基因给出的超精细分裂,可鉴别被捕自由基通用自旋捕获剂所形成的自由基加合物对自由基结构变化相当敏感， ESR 技术检测O-2 O-2可以与1，2-二羟基苯-3，5-二磺酸钠(Tiron)(钛铁试剂)快速反应生成一种称之为“Tiron 半醌自由基”的自旋加合物，比较稳定，可在室温下应用电子顺磁共振波谱仪(EPR)进行检测，从而解决了生理条件下水溶液中寿命极其短暂的O-2·的定性和定量问题 ESR 技术检测·OH DMPO作自由基捕获剂对自由基结构变化相当敏感,可以提供自由基结构的详细信息。它与·OH产生的自旋加合物的ESR谱表现出特别容易识别的特征谱线。在溶液中容易形成的自我捕集产物二聚体自由基不会干扰实验结果。 ESR 技术检测血红蛋白结合的一氧化氮 在组织或血液中，一氧化氮大多与氧或过渡金属反应生成了硝酸盐或亚硝酸盐以及一氧化氮与金属的配合物。一氧化氮与血红蛋白的结合速率常数非常高，而且能够得到有特征的ESR 波谱。利用这一性质，我们可以用血红蛋白作为一氧化氮的捕集剂检测一氧化氮自由基。但是，HbNO 极易氧化，这就限制了这种方法在富氧条件下的应用。 ESR 技术检测生物体系产生的一氧化氮 一氧化氮与含金属蛋白反应产生的亚硝酰的金属配合物，往往会抑制细胞中许多重要的酶，对细胞产生毒害作用。目前应用较多的捕集剂的有Fe2+- (DETC)2，它可与一氧化氮形成稳定的单亚硝酰-铁配合物MNIC，给出特征的ESR 波谱。但由于Fe2+-( DETC)2不溶
超氧阴离子自由基荧光探针法检测及其应用研究
网络出版时间：2012-12-19 08:52 网络出版地址：https://www.360docs.net/doc/4617810792.html,/kcms/detail/11.2206.TS.20121219.0852.010.html 2012-11-20 超氧阴离子自由基荧光探针法检测及其 应用研究 赵永强1,2，林洪1，李来好2,*，杨贤庆2，郝淑贤2，张牧天3 (1.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛 266003； 2.中国水产科学研究院南海水产研究所，农业部水产品加工重点实验室，国家水产品加工技术研发中心，广 东广州 510300； 3. 北京师范大学-香港浸会大学联合国际学院，广东珠海 519085) 摘要：该研究以2-氨基吡啶与吡啶-2-甲醛为原料，经亲核取代反应合成了一种新型荧光探针：2-（2’-吡啶 亚胺甲基）吡啶（2-APC），所得目标产物经熔点测定、元素分析、红外光谱与核磁共振波谱等方法表征确认。 利用2-APC与超氧阴离子自由基（O2·-）发生荧光淬灭反应的原理，建立了一种测定邻苯三酚自氧化体系 产生O2·-的方法，该方法反应体系最佳条件为：反应pH=8.2；反应温度T=40℃；反应时间t=40 min。测 定条件为：λex=295 nm、λem=365nm，狭缝宽度5 nm。邻苯三酚在0.4×10-6~8.0×10-6 mol?L-1浓度范围内 与相对荧光强度呈良好线性关系，线性回归方程为y=37.567x+55.581，R2=0.9834。应用该方法对L-抗坏 血酸清除O2·-能力进行评价，结果表明L-抗坏血酸清除O2·-的IC50值为0.182 mmol?L-1。 关键词：超氧阴离子自由基；荧光探针；合成；应用 Fluorescence Probe Method for Superoxide Anion Radical Detection and its Application Study ZHAO Yong-qiang 1,2，LIN Hong1，LI Lai-hao2,*，YANG Xian-qing2，HAO Shu-xian2，ZHANG Mu-tian (1. College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, P.R.China； 2.Key Laboratory of Aquatic Product Processing, Ministry of Agriculture, National R&D Center for Aquatic Product Processing, South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Science, Guangzhou 510300, P.R.China； Beijing Normal University-Hong Kong Baptist University United International College, Zhuhai 519085, P.R.China) Abstract：A novel fluorescence probe 2-APC was synthesized by 2-aminopyridine and 2-pyridinecarbaldehyde based on nucleophilic substitution reaction in this study. The reaction product was characterization by melting test, elemental analysis, infrared spectrum and 1HNMR. A fluorescence probe method for superoxide anion radical detection was established. The optimum conditions of this reaction system were as follows, pH, temperature and time of reaction system was 8.2,40 oC and 40 min respectively. The conditions of fluorimetric determination were as follows, λex=295 nm, λem=365nm and the slit width was 5 nm. In the range from 0.4×10-6 M to 8.0×10-6 M, relative fluorescence intensity (y) and pyrogallol concentration (x) were shown a good linear relationship, y=37.567x+55.581，R2=0.9834. Superoxide anion radical (O2·-) scavenging activity of L-ascorbic acid was evaluated using the above mentioned method, the results showed that the IC50of L-ascorbic was 0.182×10-3mol?L-1. Key words：superoxide anion radical, fluorescence probe, synthesis, application 中图分类号：O657.34 文献标识码：A 文章编号： 活性氧是需氧生物细胞进行正常代谢的产物，生物体生命代谢过程中通过非酶反应与酶反应不断产生各种活性氧自由基，如超氧阴离子自由基（superoxide anion radical, O2·-）、过氧化氢（hydrogen peroxide, 收稿日期：2012 基金项目：国家科技支撑计划项目(2012BAD28B00)；国家现代农业产业技术体系(CARS-49)；国家海洋局海 洋公益性行业科研专项(201005020；2013418018)；茂名市科技计划项目(2011A01002) 作者简介：赵永强(1985—)，男，博士研究生，研究方向为水产品加工及贮藏工程。E-mail：zhaoyq1122@https://www.360docs.net/doc/4617810792.html, *通信作者：李来好(1963—)，男，研究员，博士，研究方向为水产品加工与质量安全。E-mail：laihaoli@https://www.360docs.net/doc/4617810792.html,
清除自由基能力的研究概况
清除自由基能力的研究概况 陶涛 （西南林业大学林学院农学（药用植物）昆明 650224） 摘要：自由基及其诱导的氧化反应是导致生物衰老和某些疾病如癌症、糖尿病、一心血管疾病等的重要因素。乳酸茵作为一种高效、低毒的生物源天然抗氧化荆，正逐步受到食品、制药、化工等领域的广泛关注。就目前国内外常用的乳酸茵抗氧化活性的筛选方法、乳酸茵抗氧化机理的国内外研究进展及未来的发展趋势作一综述。 关键词：自由基；乳酸茵；抗氧化． Study on the scavenging ability of lactic acid bacteria on free radical bstract：Free radical and its inducing oxiditative reaction may CaUSe biological doat and certain diseases such as Cancers，diabetes and the cat- diovascular．The lactic acid baaeria as one ofbiological SOUrCeS oxidation inhibitor is becoming more and more popular in the fields offood．，drug manufacture and chemical industry．This article mainly reviews the screening methods for antioxidative of lactic add bacteria among domestic and foreign countries，the advance of the research progress in lactic add bacteria antioxidative and r∞earch trends in future． 引言 氧化过程可以提供能量．对大多数生物体来说，是维持生命必不可少的一个能量转化过程。但过多的氧化过程会对生物大分子引起损伤．氧化损伤主要是由于自由基和过氧化产物作用于人体而产生的。 自由基(free radicals)27．．称游离基．为人体氧化代谢过程中形成含有一个不成对电子的原子或原子团。人体的自由基主要包括超氧阴离子自由基(o2)、
潘铜华 超氧阴离子的组织定位
超氧阴离子的组织定位 园艺学院潘铜华 1 前言 【目的】探索超氧阴离子在植物组织中的分布情况，了解超氧阴离子的对植物的影响，学会超氧阴离子含量测定及超氧阴离子组织定位的方法。【意义】超氧阴离子的组织定位是目前国内外许多科研人员正在探索的新方向，国内此方向的研究成果尚存在空白，了解超氧阴离子的组织定位有利于我们下一步的科研进展。【原理】Met+核黄素→超氧阴离子(光下)超氧阴离子+NBT→NBT（蓝色），超氧阴离子+NBT+E（酶）→NBT（淡蓝色） 2. 材料与方法 2.1 材料 新鲜小白菜（切下叶片） 2.2 实验方法 2.2.1 取一颗新鲜的小白菜，剪下上面4片叶片，洗净后放在桌面上一一拍照，然后一起拍照。 2.2.2 将叶片放入250ml烧杯中，加入反应液（含0.1%的NBT，10mmol/L的Nan3的PBs6.4 50ml）中，抽真空20min.，此过程重复2次。 2.2.3 取出叶子，放入固定液中，暗中放置1小时，将烧杯放入100摄氏度水浴中若干分钟以使叶片褪色为黄色。 2.2.4 加入95%的乙醇固定照相，分别对每片叶片拍照及对总体拍照。 3结果如果如下图所示： 3.1实验前小白菜叶片照片： 3.2实验后相应小白菜叶片照片：
4 讨论： 活性氧自由基如超氧阴离子等是与植物的衰老、胁迫伤害等生理过程密切相关的自由基，而植物体内同时存在清楚活性氧的酶系如SOD、 POD 、CAT等，能清除活性氧对植物生理产生的破坏。正常情况下活性氧与清除酶系处于动态平衡关系。逆境胁迫下活性氧自由基含量增加。活性氧能使NBT变蓝，而植物体内消除活性氧的酶系如SOD等能降低活性氧的浓度而使NBT蓝色变淡。在活性氧一定的情况下，颜色越浓说明超氧阴离子浓度越多，反之越少。由图可知，植物叶片颜色更浓的部分超氧阴离子含量更多。 小白菜的维管束是运输有机物的主要通道之一，超氧阴离子会抑制有机物向库的运输，因而在小白菜的维管束周围活性氧的含量更高。 5 实验注意事项： 5.1实验中的很多药品是致癌性药品，在实验过程中务必使人体的任何部位与药品的直接接触，必要时一定要带上手套、口罩，穿实验服等，以免造成不必要的人身伤害。 5.2实验药品不能浪费，适量最好。试验药品用的越多产生的污染就就严重。同时，浪费试验药品也是不爱护公共财产的表现。 5.3叶片最好使用同一颗小白菜的叶片，这样他们的其他条件更趋一致，实验结果更准确。 5.4 拍照时可选纯黑、大红、白色三种北京，拍出的照片效果更好。 5.5 实验时间务必把握好，及时做好实验记录与结果，查询资料，了解实验的一些研究进展。