虫草素

一、2010版中国药典标准-冬虫夏草

冬虫夏草：为麦角菌科真菌冬虫夏草菌Cordyceps.sinensis(Berk.)Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体。夏初子座出土、孢子未发散时挖取，晒至六七成干，除去似纤维状的附着物及杂质，晒干或低温干燥。

【性状】

本品由虫体与从虫头部长出的真菌子座相连而成。虫体似蚕，长3～5cm，直径0.3～0.8cm；表面深黄色至黄棕色，有环纹20～30个，近头部的环纹较细；头部红棕色；足8对，中部4对较明显；质脆，易折断，断面略平坦，淡黄白色。子座细长圆柱形，长4～7cm，直径约0.3cm；表面深棕色至棕褐色，有细纵皱纹，上部稍膨大；质柔韧，断面类白色。气微腥，味微苦。

【含量测定】

照《高效液相色谱法检验标准操作程序》测定。

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐缓冲液(pH6.5)[取0.01mol/L磷酸二氢钠68.5ml与0.01mol/L磷酸氢二钠31.5mL，混合(pH6.5)]～甲醇(85：15)为流动相；检测波长为260nm。理论板数按腺苷峰计算应不低于2000。

对照品溶液的制备取腺苷对照品适量，精密称定，加90%甲醇制成每1mL 含20μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备取本品粉末(过三号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入90%甲醇10ml，密塞，摇匀，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用90%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各l0μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品含腺苷(C10H13N5O4)不得少于0.010%。

二、来源

获取虫草素的办法不外乎三条途径：从天然虫草中提取、人工合成和通过生物工程的方法从北虫草组织液中提取。

化学合成目前处于探索阶段，国外有报道虫草素能够人工合成，但过程复杂且产量极低，因此如何提高蛹虫草中虫草素的含量并实现虫草素的工业化生产,是目前国内外研究的主要方向。

天然虫草资源稀缺，价格昂贵，含量甚微，很难成为主要原料。人工合成虫草素虽然在上个世纪六十年代我国曾有报道，但由于合成的起始原料较贵或设备投入巨大或产业化工艺缺失或总收率太低或合成工艺技术无法重复，迄今难以实现产业化。因此，通过生物工程的方法，从人工培育的虫草子实体中提取虫草素，是实现虫草素作为治疗药物产业化生产的最可行的途径。

三、提取及纯化工艺

溶解性：虫草素溶于水、热乙醇、甲醇，所以一般采用水、乙醇或甲醇等作为溶剂提取虫草素。

热稳定性：较差。

1、虫草素的提取方法

目前常用的有4种提取方法：浸提法、超声法、索氏提取法和回流法。

（1）索氏提取法提取虫草素时，水作溶剂得率最大：

钟艳梅采用索氏提取法提取虫草素，并比较了不同提取溶剂：蒸馏水、无水乙醇、浓度95％乙醇，浓度75％乙醇，发现用索氏提取法提取时，若采用水作提取溶剂，虫草素得率最大。

（2）超声波提取法最佳

张嘉等用正交试验法研究了对虫草素的提取过程，分别采用了水热回流法、醇热回流法、超声波水提法，超声波醇提法。其研究结果表明，乙醇超声波提取法的得率最高，并确定其最佳提取工艺如下：

浓度75%乙醇超声波提取3次，每次40 min，料液比1：20。

凌建亚研究了上述4种方法对虫草素提取的影响，试验发现浸提法耗时过长，而且提取效果一般，不利于下一步试验进行。如果分别调整回流法、索氏提取法、超声法的作用时间，均可获得相近的提取结果，研究发现，采用超声波法提取过程更简便，其受试验环境、仪器及人员条件等因素的影响较小。另外，可减少回流前后称重补足溶剂定溶所带来的误差，因此，采用超声波法提取虫草素为佳。

陈尚卫等比较了超声波法和回流法提取虫草素，认为两者结果相近，但超声波法操作更简便,回流法则需要较高的温度，但虫草素的热稳定性较差。

2、虫草素的富集纯化工艺

（1）离子交换树脂法

实例：Cunningham首先报道了从虫草菌的培养液中分离虫草素，以培养滤液经Dowex-I-Cl-l离子交换树脂柱和活性炭柱层析，得到虫草素单体。

Suhadolnic[5]等则采用Dowex-I-OH-1树脂从蛹虫草的培养滤液中分离得到虫草素。

参考方法：潘中华等将北虫草子实体经过粉碎、脱脂、过滤、烘干、水浴、沉淀、过滤、离心沉淀、除色素、浓缩、过树脂柱等步骤的处理，最后析出结晶得到虫草素晶体。其离子交换树脂柱采用的是732-阳离子交换树脂。树脂经2N NaOH震荡2 h而后用蒸馏水冲洗至中性，再用2 N HC1震荡2 h，蒸馏水冲洗至中性，重复一次预处理树脂过程；装好柱后用pH值3.5的HCl 3倍柱体积过柱，至pH值不变时停止，尔后加样；样品完全进柱后，用pH值3.5的HCl平衡液固定被树脂吸附的虫草素，用双蒸水过柱除杂，在洗脱时用0.15 mol/L的NH3·H2O以1滴/s加到层析柱内，10 ml试管收集洗脱液，

6 ml/支，连续收集60支；收集液用红紫酸胺反应定性定量鉴定虫草素含量后

放入冰箱中，在温度低于40℃时结晶析出虫草素晶体。

钟艳梅等利用蛹虫草固体培养残基经过粉碎过筛、脱脂、索氏抽提或水浴浸提、除杂、浓缩、离子交换柱分离，最后收集获得虫草素晶体。陈星以蛹虫草固体干燥培养基为原料，通过粉碎、热浸、低度醇液提取、过滤，调pH值至8-9，流经717、732离子交换树脂时虫草素不交换，这样无关的有机或无机阴阳离子都被吸附。再调节pH值至l1，流经717离子交换树脂时，由

于虫草素带负电荷而被吸附在柱上面，后采用常规方法，用纯水或蒸馏水洗脱，加热，浓缩(或真空干燥)，在4℃下静置后出现絮状沉淀，经滤纸过滤得白色块状虫草素晶体，向50～95 ℃（最佳温度为60～90℃）热水中逐步加入虫草素粗品，使之饱和为止；过滤除杂，将饱和液冷却至结晶，如此反复数次即可得到纯度很高的晶体。该法打破了常规方法，获取了纯度较高的虫草素，且简便可行，有较高的工业应用价值。

潘中华等人主要对蚕蛹虫草中虫草素(3’-脱氧腺嘌呤核苷、学名3’-Deoxyadenosine)进行纯化及纯度鉴定。结果表明:经过对蚕蛹虫草子实体及菌丝的粉碎、石油醚脱脂、80℃水浴10小时、调节等电点沉淀、732-NH_4离子交换树脂的分离、浓缩、5℃下低温结晶,可得到一定纯度的虫草素晶体。（2）硅胶柱层析

姜泓等利用硅胶柱色谱法，经制备液相、薄层、凝胶柱层析等过程，从人工培养的蛹虫草子实体的醇提取物中分离得到了虫草素。陈伟等以菌丝体的醇提液为样品，经过硅胶柱层析，采用10倍体积的洗脱剂以0.8mL/min流速洗脱，手动进样2mL，流速为0.8 mL/min洗脱样品，自动收集器收集样品后，经检测，虫草素得率从1.40‰提高到20.89‰ 。并确定了硅胶柱层析最佳溶剂系统为氯仿：乙酸乙酯：异丙醇：水=400：100：300：24，每10mL流动相中加2滴氨水。此法可作为大量制备高纯度虫草素的产业技术。

（3）超临界流体萃取

陈顺志以北虫草人工培养后的发酵物为原料，采用超临界萃取技术提取其核苷类有效成分，并以乙醇等作为夹带剂减压分离获取核苷类多组分及单体。

该法采用蛹虫草人工培养后的固体或半固体培养基为原料，在提取过程中，将虫草培养物粉碎后加入萃取釜中，在高压条件下以CO2液体作为溶剂，提取其有效成分。在CO2流动过程中，分离釜中的压力、温度不同，使所需成分析出，结合I、Ⅱ、Ⅲ分离釜或分馏塔可使某一成分析出。在减压下CO2液体挥发后即可得到脱氧核苷组分或单体。后采用活性炭吸附，经有机溶剂去杂、重结晶或离子交换树脂去杂、冷冻干燥或真空干燥后得到粉状虫草素。（4）多种方法联合使用

Cunningham采用离子交换树脂柱和活性炭柱层析，得到虫草素晶体。徐文豪采用离子交换树脂、大孔吸附树脂处理和多次硅胶柱层析及薄层分离法得到了核苷类物质。虫草素也为核苷类物质，所以该法也可应用于虫草素的分离。

四、检测方法

（1）高效液相色谱法（HPLC）

张红霞等采用高效液相色谱法同时检测了5株北虫草菌株发酵液中的虫草素含量，设定的色谱条件：色谱柱为Kromasil 100-5C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm），流动相为水-甲醇=85-15，流速0.8 mL/min，检测波长260 nm，进样量10μL，温度30℃。以虫草素标准品作标准曲线，虫草素的线性范围为0.49～98μg/mL。虫草素的保留时间为11.443 min，回收率为103.22％，RSD=4-4%。

吴畏等采用HPLC检测北冬虫夏草子实体中的虫草素含量，色谱柱Kromasil ODS C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm ）；流动相为甲醇-水=15-85，流速0.8 mL/min，检测波长260 nm，进样量2μL，温度30℃。结果表明，所

做的样品子实体中虫草素的含量为2.82%。

温鲁等采用HPLC法测虫草培养基中虫草素的含量，色谱柱为Waters Nova-Pak C18柱（3.9 mm×300 mm，4μm）；流动相为水-甲醇-醋酸（185：14：1）；流速1.0mL/min，检测波长260nm。结果显示，分别测得的3份培养基粉末中虫草素的含量依次为4.26、0.72、3.79 mg/g。

（2）毛细管区带电泳（CZE）法

凌健亚等用CZE法测定了一株虫草属真菌培养基中的虫草素和腺苷酸含量。结果显示，使用长41 cm，直径为45μm的无覆盖层的硅胶毛细管拄，用浓度为0.05 mol/L或0.025 mol/L硼酸缓冲液时获得了很好的分离结果，但用0.025 mol/L的硼酸缓冲液更好，因为低的离子化强度能使运行时间更短。

最适操作温度为20℃，工作电压为20KV，pH值为9.4。该条件下虫草素的峰面积为6404（RSD=3.40%），腺苷酸的峰面积为20525（RSD=1.31%），它们的迁移时间分别为虫草素2.057 min（RSD=2.64%），腺苷酸2.881 min （RSD=1.27%）。回收率分别为虫草素97.2%，腺苷酸97.6%。从结果来看，目前的研究应用CZE法定量分析虫草素和腺苷酸是可行的。

（3）毛细管电泳技术（CE）

Yerra等研究后认为，CE法是一种快速简便的虫草素测定方法。紫外254 nm处检测，最适条件为硼酸缓冲液浓度20 mmol/L，缓冲液中含有28.6%甲醇，pH值9.5，分离电压20 KV，温度25℃。并且与HPLC对比，认为CE较之HPLC的优势在于分析时间更短，运行成本更低廉。

（4）薄层层析法(TLC)

雷帮星等将待虫草素待测样品与标准品点于已活化的薄层板上（110℃活化0.5h），待溶剂挥干后，在展开剂（氧仿:乙酸乙酯:异丙醇:水=8:2:6:0.3）中展开。挥干展层剂，将其置紫外线分析仪上，254nm显色，计算标准品和样品中各点的相对迁移率Rf。

（5）液相色谱、质谱联用技术（LC/ESI-MS）

Mina等利用LC/ESI-MS法测定了虫草素的含量，流动相流速为1.0 mL/min，柱温40℃，电喷雾离子化(ESI)技术被用来作为离子的来源，它所需的电压是4.5 KV。离子在毛细管中移动的温度设为200 ℃，电压设为10V。结果显示，他们所配的emilitaris NBRC菌株培养基中确实含有虫草素。

黄兰芳等利用灵敏且高重复性并配有电子喷雾离子化系统的高效液相色谱测定了腺嘌呤、腺苷、次黄嘌呤、虫草素和尿嘧啶的含量。分析柱为VP-ODS Shimadu 2.0 mm×l50 mm，使用流动相水、甲醇和蚁酸的比例为85-14-1得到了好的分离效果。选择性离子监控器模式（[M+H]＋at m/z 136、137、268、252和302）的使用可定量地分析4种活性组分的含量。试验主要研究了最适分离条件、最适ESI-MS条件、分析效能、应用等方面。试验结果表明，LC/ESI-MS是一种简单、迅速、独特的分析虫草菌中核苷类物质的方法。

用HPLC-ESI-MS-MS法，采用多反应检测(MRM)模式，同时测定了冬虫夏草及其代用品中腺苷和虫草素的含量。色谱条件：Water XTerra MS C18色谱柱(2.1mm×150mm，5μm)。流动相为水-甲醇-甲酸(89：10.5：1)，用0.22μm 微孔滤膜过滤，使用前超声脱气。柱温为25℃，流速0.2mL/min，进样量5μL。

质谱检测条件：离子化方式电喷雾离子化(ESI)；扫描方式离子扫描；检测方式多反应检测(MRM)；毛细管电压3.0kV；萃取锥孔电压210V；源温度110℃；去溶剂气温度300℃；去溶剂气流量550L/h；锥孔气流量50L/h。腺

苷和的虫草素的取样锥孔电压分别为25、22V,碰撞能量分别为17、15ev，监测离子对分别为268.3/136.1、252.4/136.1。