凝胶胶内酶解技术路线
凝胶胶内酶解技术路线
用到的试剂如下：
1．100mMNH4HCO3：称取1.975g NH4HCO3溶于250mL的双蒸水中
2．脱色液：乙腈:50mM NH4HCO3=1:1
3．10mmol/LDTT还原液：称取0.0154g溶于10mL 100mM NH4HCO3中
4．55mmol/L烷基化溶液：称取0.102g碘乙酰胺溶于10mL100mM NH4HCO3
5．酶解贮液：Trypsin(Promega，V5111)制备为0.5μg/μL水溶液，分装1-3μg－20℃保存6．酶解工作液：Trypsin终浓度为0.125μg于25mMNH4HCO3溶液
7．肽提取液Ⅰ：5%TFA（v/v）水溶液
8．肽提取液Ⅱ：乙腈:5%TFA=1:1
9、考染脱色液（100ML）：乙醇25 ml、乙酸8 ml、水67ml混合
一、Hela细胞线粒体、细胞核、胞浆的提取。（详见各试剂盒的操作说明书）
二、蛋白质SDS-PAGE分离和酶切肽提取
蛋白质SDS-PAGE分离,每个泳道上样量为50μg,共10个泳道，恒压100伏。考马斯
亮蓝染色，加脱色液至无色。
电泳后样品的酶切肽提取过程如下：
1．考马斯亮蓝染色凝胶，用解剖刀将胶带切成1-2mm2大小的胶片。
2．加入脱色液(乙腈:50mM NH4CO3=1︰1)100μL浸泡，振荡20min，弃去溶液，重复1-2次直至蓝色褪尽。
3.加入50μL DTT（10mmol/L）还原液，30min，56℃；弃废液，加100μL乙腈脱水5-10min。4．加入50μL碘乙酰胺(55mmol/L)烷基化，于暗处30min。
5．加入100μL脱色液，洗5-10min,弃废液，冰冻干燥20min。
6．加入15-20μL酶液（12.5ng/μL），置于4℃放置30min，待酶液完全被吸收，补充酶解缓冲液15-20μL，使胶完全浸没。37℃保温15小时或过夜。
7．加提取液Ⅰ（5%TFA）100μL，40℃加热水浴1小时，30min时，超声3min左右. 8．将提取液吸到另一干净的管中，冰冻干燥；向胶块中加入提取液Ⅱ(50%乙腈，2.5%TFA)100μL，30℃保温1小时，30min时，超声3min左右
9．将提取液合并，氮气吹干乙腈后，真空离心干燥。将相差10KD左右的蛋白条带提取液进行混合，如30KD-40KD,减少样本量，节约成本。
10.加入5-10μL的5%TFA溶液混匀，质谱分析。
三、液相色谱分离和质谱鉴定
1液相色谱条件
酶切后冻干的肤段用色谱A液(5%乙睛，0.1%三氟乙酸水溶液)溶解，离心后取上清，色谱柱进样19川。毛细管反相柱的色谱条件为:缓冲液有流动相A液组成，洗脱液由不同比例的流动相A(0.1%甲酸水溶液)及流动相B(0.1%甲酸溶于99.9%乙睛中)组成，总时间是120分钟，0一60分钟，流动相中B比例由5%上升至40%;60一75分钟，B液比例由40一95%;维持巧分钟后，以A液平衡色谱柱30分钟，控制两个泵的流速使分流后流至色谱柱的流速为1一2ul/分钟。
2质谱条件
由反相色谱流出的洗脱组分经由纳升级电喷雾接口从金属针喷出，电喷雾的电压 1.8KV;粒子传输毛细管温度设为180℃;质谱分析以一个全扫描(FullMS:350-1600) 及三个分段扫描
(MassRange:m/z350-700/680-1000/950-2600模式，一级质谱采集后依次选取离子强度大的三个离子经CID采集串联质谱，归一化碰撞能量为35%;采用串联质谱扫描的动态排除功能(Dynamicexclusion)，设置排除时间是5分钟。
3.数据标准
由串联质谱产生的原始文件经Xcalibur处理得到dia文件，用Bioworks3.O软件(ThermoFirmigan TM公司)的sequest进行检索，数据库来自国际蛋白质数据索引（International Protein Index，IPI）的Human IPI3.24数据库。对鉴定数据的评价采用了搜索混合数据库的方法，首先将下载的人数据库做成反转数据库，即将人蛋白质的氨基酸序列完全倒置，而后再与原始的人数据库结合，从而构成混合数据库。质谱产生的原始数据就根据构成的混合数据库进行检索。检索后根据Sequest算法对不同电荷的肽段给出一系列的卡值，即Xcorr值。对于每次卡值得到的肽段，再根据倒置序列占全部肽段的比例来计算假阳性率。根据文献报道，我们将假阳性率控制在5%，最终得到的数据卡值标准如下:Xeorr值，1.84(+l)，1.85(+2)，2.69(+3);△Cn值大于0.08。同时搜索反库用于评价数据可信度。检索设定肽段序列氨基酸固定修饰为半胱氨酸(C，+57.02Da)、甲硫氨酸(M，+15.99Da)，肽段质量允许误差 1.4Da，水解酶为胰酶。
尿液中囊泡的提取和鉴定概要
尿液中exosome的提取和鉴定 一、exosome的提取 （一）实验准备 1.试剂：Sigma P2714，三乙醇胺，NaOH，蔗糖，去离子水 耗材：超速离心管50mL，15mL （二）实验步骤(Pisitkun 2004; Gonzales, Zhou et al. 2010) 1. 将－80℃冻存的尿液取出解冻，涡旋，分装在50mL离心管中。 2.从-20℃中取出Sigma P2714 蛋白酶抑制剂，加入5mL二次水混匀。 3.每50mL尿液中加入625 μL溶解后的蛋白酶抑制剂（12.5 μL/mL Urine）。 4.于4℃，17000 × g 离心15 min。（新鲜尿液25℃离心）（超速离心机型号Hitachi CP 80MX） 5.取上清液置于超速离心管中，装3管，每管分装8mL， 4℃ 200 000 × g离心1 h。（同上新鲜尿液25℃） 6.离心后弃上清，再取17000 × g上清各8mL分置3管中，同上述条件离心。 7.弃上清，3管中各加50μL isolation solution，涡旋混匀30 s，转移到一个1.5 mL Eppendrof 离心管中。 8.加1 mL 200 mg/mL DTT 95℃孵育2 min。 9. 将上述溶液转移至高速离心管中，并加入8 mL isolation solution 17000 × g超高速离心10min。 10.弃上清，加50 μL isolation solution溶解沉淀物，在17 000 × g 离心15 min。
取上清做1D SDS/PAGE. 11.Bradford 法测蛋白总浓度。 12.按1:4体积比加入5×SDS-Laemmli 缓冲液（含60 mg/mL DTT），涡旋混匀。 13.60℃加热10 min，-80℃保存。（for western blot） 朱墨桃师姐提取exosome方法(Zhu, Li et al. 2012) 1.2,000 g for 10 min at 4 °C ，除去死细胞； 2.取上清，4 °C 10,000 g 离心30 min，除去细胞碎片； 3.取上清，4 °C 110,000 g离心70 min，弃上清； 4.PBS清洗并重新分散，-80 °C保存。 5.microbicinchoninic acid assay (Applygen Technologies Inc, China)测定蛋白含量。 二、负染电镜分析 （一）实验准备 4% paraformaldehyde 多聚甲醛（in PBS，pH 7.4），1 % Uranyl acetate乙酸双氧铀in dd-H2O，石蜡膜，200 目镍网 （二）实验步骤 1.将20μL exosomes 小体悬样与4% 多聚甲醛（in PBS，pH 7.4）1：1混匀。 2.取10μL混合物滴于石蜡膜上，将200目镍网置于液滴中悬浮10min。 3.用毛边滤纸从侧面吸干多余液体。 4.在20μL PBS液滴中悬浮5min，重复。 5.在20μL 去离子水液滴中悬浮5min，重复。 6.1% 乙酸双氧铀负染液负染1 min，用毛边滤纸从侧面吸干多余液体。 7.将镍网正面朝上置于滤纸上，在有盖的玻璃皿中干燥15min。 8.样品准备完毕，进行EM分析。 三、1D SDS-PAGE （一）实验准备 储存液配制： （1）2 M Tris-HCl （2）100 g/L SDS 溶液 （3）75%（v/v）甘油 （4）10 g/L 溴酚蓝溶液 电泳工作液配制： （1）Acr-Bis液 （2）4×分离胶缓冲液 （3）100 g/L 过硫酸铵溶液 （4）TEMED 成品液 （5）5×样品缓冲液 （6）10×电泳缓冲液
常用胶粘剂
常用胶粘剂
常用胶粘剂 合成胶粘剂的几种分类 酚醛-氯丁橡胶胶粘剂 由树脂&tracelog=pd_info_promo" target="_blank">酚醛树脂和氯丁橡胶混炼胶溶于苯或醋酸乙酯和汽油的混合溶剂中配制而成的。由于初粘力强，又能在室温下粘接和固化，使用简便，所以应用较广，适用于粘接金属和非金属材料。市售的商品有铁锚801强力胶、百得胶、JX－15－1胶、FN－303胶、CX－401胶、XY－401胶、CH－406胶等。 有机硅胶粘剂 它的主要组分是有机硅氧烷。它有优良的耐紫外线、耐臭氧、耐化学介质和耐潮湿，还有很好的热稳定性和低温柔韧性。它能粘接金属、玻璃、陶瓷等材料，特别能粘接通常不易粘接的硅橡胶、氟橡胶等。主要用于电子工业中的灌封、电器元件连接部位和接头处的密封，以防止灰尘和潮气等的侵害。还可作建筑工程的防水密封材料。有机硅胶粘剂分单组分、双组分、室温硫化和加热硫化等多种，室温硫化型的主要产品牌号有703、704、D－05、FS－203、GD－400等。 瞬间胶粘剂
是由α-氰基丙烯酸酯单体和少量稳定剂、增塑剂等配制而成的。这类胶组分简单，不用配料，能在常温常压下迅速固化，因此获得瞬间胶粘剂的美称。使用时，被粘物表面不需特殊处理，能满足工业自动化流水线的需要。它无毒，因而应用范围广，不仅适合粘接各种金属、非金属材料，还用于医疗方面的粘结。这种胶的缺点是不适宜于大面积和多孔材料的粘接。常用的是α-氰基丙烯酸乙酯，商品牌号为502胶，医用的α-氰基丙烯酸丁酯，商品牌号为504胶。 厌氧胶 该胶的主要成分是甲基丙烯酸双酯。它在室温、有空气时不能固化，排除空气（即无氧条件）就能迅速固化。根据不同需要，可加入引发剂、促进剂、增稠剂和染料等组分。它的主要用途是作螺纹的紧固密封和轴承的装配。对非活性金属，如不锈钢、锌、银等需加入促进剂以加速固化。它不宜粘接多孔材料和填充较大缝隙。产品分高、中、低档强度和粘度，牌号有铁锚300系列，GY－100、200、300系列，Y－150胶等。 聚醋酸乙烯酯 聚醋酸乙烯酯乳液是醋酸乙烯的聚合物。它就是市售的白胶。这种胶粘剂能在室温下自干，化学稳定性好，容易跟填料、增塑剂等相互混合，粘接度可自由调节，有较好的早期粘接强度。它可以单独使
纤维蛋白原降解产物FDP液体双试剂使用说明书
纤维蛋白及纤维蛋白原分解产 物测定试剂 Reagent for P-FDP Test 版本号：YS2012-A01 编制日期：2012年1月 【预期用途】 本试剂用于体外定量检测人血浆中的纤维蛋白及纤维蛋白原分解产物（FDP：Fibrin and Fibrinogen Degradation Products）的含量。FDP是纤溶酶分解纤维蛋白及纤维蛋白原的多种产物的总称，因为纤溶系统的亢进而增加，从而引起纤溶系统的异常，特别是在播散性血管内凝血（DIC：Disseminated Intravacular Coagulation Syndrome）诊断，病程观察中，成为重要检查项目之一。随着凝固纤溶系统与肾病的关联被关注，可检测作为肾小球局部的凝固纤溶动态指标的尿中FDP。现在应用于肾炎，接受肾脏移植的患者，膀胱肿瘤，妊娠中毒症的诊断，病程观察，还用于对肾小球体内，下部尿路，流血中等反映凝固纤溶动态的检查。 【测定原理】 本品以乳胶凝集法为原理。样本中的FDP，可与附着在乳胶颗粒上的抗体产生抗原抗体的凝集反应，凝集反应产生的浊度的变化可通过测定特定波长的吸光度值，即可算出样本中FDP的含量。 【试剂成份】 组成规格比例主要组份 FDP试剂1：1 缓冲液、抗人FDP单克隆抗体胶乳颗粒 FDP校准品1ml(冻干) FDP、稳定剂，定值见瓶签 FDP质控品0.5ml(冻干) FDP、稳定剂，定值见瓶签 【试剂制备】 液体双试剂，可直接使用。 【稳定性和贮存】 本试剂在2~8℃避光条件下贮存（勿冷冻）可稳定至失效期；若试剂空白>1.5则视为失效。 【标本收集和处理】 新鲜血液9份体积与1份体积的0.11mol/L柠檬酸钠混合后，离心（3,000rpm，10～30分钟）后得到的上清可作为血浆样本使用。样本要采血后直接离心，当天进行检测。如当天不能检测的情况下，冷藏（2～10℃）可保存1天，冷冻（-80℃）可保存1个月。但是，解冻后的样本只限1次使用，不能反复冻溶。【操作参数】 【测定步骤】 空白管（B）校准管（S）样品管（U）蒸馏水（μL） 4 ― ― 校准液（μL）― 4 ― 样品（μL）― ― 4 试剂1（μL）100 100 100 混匀，37℃孵育3~5分钟 试剂2（μL）100 100 100 混匀，37℃孵育20秒后读取第一点吸光度，5分钟后读取第二点吸光度。将第二点吸光度减去第一点吸光度，读取各管的吸光度变化ΔA。【结果计算】 样本中FDP浓度（μg/mL）=×C S 式中：ΔA U样品管的吸光度变化 ΔA S校准管的吸光度变化 ΔA B空白管的吸光度变化 C S校准液中FDP的浓度 根据多点校准品浓度和对应吸光度变化值ΔA，采用多点非线性校准模式确定工作曲线，样本吸光度变化在工作曲线上相对应的浓度值即为测定浓度。 【校准】 请使用“yesen” FDP校准液。 【质量控制】 为确保测试质量，请使用“yesen”或其他商品化的定值控制血清与被测样本同时测试。控制血清给定的值必须经本方法确认。控制血清的使用可以检查仪器及试剂的性能。可能影响测试结果的因素包括仪器性能、温度控制、器皿的清洁和加样器的准确性。 【注意事项】 1.本试剂仅用于科研、实验、技术支持，不直接用于临床诊断； 2.请避免接触皮肤、眼睛及粘膜，一旦接触，应即用水冲洗污染部位； 3.试剂体积和样本体积可因仪器要求不同，按比例增减，计算公式不变； 4.不同方法学试剂的质控结果之间会存在差异，使用时请确保质控选择与试剂的方法学保持一致； 5.不同批号的试剂不建议混用，如混用应重新校准。 6.试剂中含有动物源性物质“抗体”，来源于非疫区，并经检验检疫，不排除含有其他未知的传染性物质存在，因此在使用时应按传染性物质对待。 7.当样本中FDP的浓度超过100μg/mL时，应将样本稀释后再测，测得的结果乘以稀释倍数。 【参考值（参考范围）】 ＜5μg/mL，建议各实验室应建立自己的参考范围。可取本区域内健康体检者样品进行测定，得FDP均值和标准差s， 以±1.96s即95%置信区间为参考范围。 【性能数据】 下面结果是用本试剂在全自动生化分析仪上测试获得的。 1.试剂空白吸光度≤1.5（570nm，37℃）。 2.分析灵敏度：当样品中FDP浓度为20μg/mL时，其吸光度A≥0.010。 3.测量精密度：重复性CV批内%≤8%、CV批间%≤15%； 4.准确性：相对偏差不超过±15％； 5.线性范围：2.5μg/mL～100μg/mL (r>0.99)； 6.抗干扰性：当样品中TBIL≤342μmol/L、TG≤20mmol/L、TC≤20mmol/L、Hb≤ 5.0g/L时对测定结果无显著影响； 7.方法比对：用本试剂与进口相同方法的试剂分别测定100例样本中FDP含量，结果y=0.982x+0.052r=0.999。 【产品特点】 1.消浊配方设计，保证很好的抗干扰性。 2.采用高品质的单克隆抗体，与其它蛋白不发生交叉反应。 3.测定灵敏度高，特异性好； 4.配套校准品，保证结果的准确性。 方法：终点法反应时间：10分钟 主波长：570nm 副波长：无 样品量：4μL 试剂量：100μL/100μL 反应方向：正向定标方式：多点非线性元升生物科技（上海）有限公司 电话：（021）67827182 传真：（021）67827181 http//https://www.360docs.net/doc/4a14950988.html, E-mail：yesenbio@https://www.360docs.net/doc/4a14950988.html, 技术支持与用户服务 E-mail：yesen2011@https://www.360docs.net/doc/4a14950988.html, yesen1998@https://www.360docs.net/doc/4a14950988.html, (中国) E-mail：yesen2013@https://www.360docs.net/doc/4a14950988.html, yesen2014@https://www.360docs.net/doc/4a14950988.html, (境外) 地址:上海市松江工业区泖亭路188弄财富兴园-国际企业公园5号103-3 ΔA U－ΔA B ΔA S－ΔA B x x
(完整版)SDS-PAGE蛋白电泳方法
SDS-PAGE 一. 实验原理 SDS 是一种阴离子表面活性剂，在蛋白质溶液里加入 SDS 和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原， SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS 复合物。在一定条件下，SDS 与大多数蛋白质的结合比例为 1.4:1。由于十二烷基磺酸根带负电，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样，约为 1.8nm ，而长轴则随蛋白质的 Mr 成正比的变化。基于上述原因，蛋白质-SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度有关，也就是蛋白质 Mr 的函数。 二. 试剂器材 30%凝胶贮液(100mL)：称取试剂Acr 29.2g和Bis 0.8g置于100mL烧杯中，向烧杯中加入约60mL双蒸水，充分搅拌溶解后加双蒸水定容至100mL，置于棕色瓶内4℃贮存，每过1-2个月应重新配制； 注意：丙稀酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用有积累性，配制时应戴手套和口罩等。 分离胶缓冲液(1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8，100mL)：称取Tris 18.2g 溶于约80mL 双蒸水，用6mol/L的HCl 调整pH值至8.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；堆积胶缓冲液(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8，100mL)：称取Tris 6.0g溶于约80mL双蒸水，用1mol/L的HCl 调整pH值至6.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；
α-氰基丙烯酸酯胶粘剂特点
α-氰基丙烯酸酯胶粘剂的特点和性能如何？ α-氰基丙烯酸酯胶粘剂其主要成分为α-氰基丙烯酸酯，含少量的增稠剂、稳定剂，由于能够瞬间快速固化，习惯上被称为瞬干胶。它是当前大力发展的工程胶粘剂之一，也是重要的家用胶粘剂。 α-氰基丙烯酸酯胶粘剂具有一下特点： 1) α-氰基丙烯酸酯胶粘剂含有强极性的氰基和酯键，对极性被粘物有很强的粘附力，表现出很高的粘接强度，可粘接经喷砂处理的中碳钢。α-氰基丙烯酸甲酯胶粘剂（即501胶）的粘接强度高达22MPa,α-氰基丙烯酸乙酯胶粘剂（502胶）则17MPa. 2) α-氰基丙烯酸酯胶粘剂不需另加固化剂，可通过吸收空气中或被粘物表面上的湿气，发生阴离子聚合实现固化，因而固化速度极快，胶粘后10-30s即有足够的强度。 3) α-氰基丙烯酸酯胶粘剂为单液型，粘度低，便于涂布，容易湿润与渗透，不需要加热或加压，按压即可，使用方便。 4）耐油性和气密性好。 5)脆性较大，剥离强度低，不耐冲击和振动。 6）耐热、耐水、耐溶剂和耐老化等性能比较差。 7）如果操作环境湿度较大，则易起霜白化，影响外观。 8）相对其他胶粘剂而言价格较贵。
α-氰基丙烯酸酯胶粘剂的优异性能，决定了它能够粘接金属、橡胶、塑料、玻璃、陶瓷和石材等，作为工业加工过程中的暂时粘合也是非常合适的。国产牌号有501、502、KH-502、新KH-502、504、508、CAE-150等，其中504和508为医用胶粘剂，可用于止血、代替缝合、吻接血管及连接骨骼等。 α-氰基丙烯酸酯胶粘剂应用时须注意如下几个问题：1.不适合大面积的粘接，用于快速固定效果最好；2。属低粘度胶液，不能用于胶粘多孔材料；3.粘接金属、玻璃的耐水性不好，而粘接塑料、橡胶，或塑料、橡胶与金属粘接则有较好的耐水性；4.固化后的胶层为线型结构，能够溶于丙酮、甲苯、甲乙酮等溶剂，可用此方法清除成胶或拆开粘件；5.有一定的刺激性，环境要注意通风；6.对于肌肉和组织有良好粘合性，但要防止接触皮肤，切勿溅入眼中。 。
胶回收方法全攻略
胶回收方法全攻略 说到电泳凝胶的片断回收，想来在实验室久已的“老手”们都会不屑一顾。确实，一般在各个和分子生物学沾到一点边儿的实验室里，从琼脂糖凝胶中回收DNA，仅仅是一种简单不过的常规实验操作。虽说早期的凝胶电泳片断回收没有1—2个小时是搞不定的，每个实验室也有自己的独门秘诀，可后来各大品牌纷纷推出了了多种不同用途，不同价钱的快速凝胶回收试剂盒，一下子将胶回收的时间缩短到10多分钟，操作也大大简化，胶回收就变成“小菜一碟”了。然而，从bbs逛上一圈下来，发现实际上还是有不少人为胶回收这种看似简单的操作而 烦恼。到底是什么导致了实验新手，甚至是老手在这个已经发展近40年的常规性实验中卡壳?由于胶回收的质量和数量直接影响后继的一系列实验——比如 酶切连接、转化筛选、测序或者PCR 扩增、标记乃至显微注射等等，为大家搜罗各种产品和方法的优缺点，注意事项，做一个胶回收全攻略篇。 一、胶回收的关键参数 胶回收的质量直接影响后继实验的成功与否。要想做好胶回收，无论是自己亲力亲为还是借助目前五花八门的胶回收试剂，最基本的评定标准无外乎这么几个:质量( 回收产物的纯度和浓度)，回收效率，操作方便(速度)，柱子的载量等等。 回收产物质量：回收产物的质量主要指纯度。常规电泳过程中，普通级别的琼脂糖自带的一些性状不明的多糖，会连同DNA一起从凝胶中抽提出来，会强烈抑制后继的连接、酶切、或者标记、扩增等实验。从凝胶中回收DNA片断，产物的纯度自然是我们考虑的第一要务。对于大片断DNA回收，质量还包括了产物的完整与否，如果机械剪切力使得回收产物大小不一致，后果决不是你希望碰见的。而对于较小片断回收，质量其实还包括了回收产物的浓度。因为产物浓度太小，对后继实验同样也有影响，比如连接、标记实验等等就很不爽，往往不得不再浓缩一次，增加了操作的复杂性。此外，极微量的纯化介质或者是某些试剂混入回收产物中也会对结果产生致命的影响。 回收率：回收得率，是我们考虑的另一个重要参数。由于上电泳的样品量通常都很少，电泳的过程本身也会导致样品的分散和损失，因而尽可能多的回收电泳凝胶条带中的目的片断，提高产物得率，对于后继实验来说是非常重要的。回收率的多少通常和回收产物的大小以及量的多少有关，比如DNA片断越大，和固相基质的结合力越强，就越难洗脱，回收率就低;又比如说，DNA的量越少，相对损失越大，回收率越低。因此，根据情况选择不同的方法是很重要的。值得注意的是，由于样品的大小和多少对回收率都有显著的影响，所以回收率并非是一成不变的。 其他：操作方面，相信大家都会比较喜欢操作简单，快速，应用起来方便的方法或者产品。比如溶胶的缓冲液中添加指示剂，可以指示溶胶的溶液pH值就是很方便的设计;离心过柱就比离心沉淀要简单方便。载量，就是每次回收最多能回收的产物的量。这个自然是越大越好了，因为对于纯化柱或者一定量的纯化介质，过量的产物吸附不了就是被浪费掉的。难免有时你需要回收比较大量的产物，大载量就很有优势——同一个片断你要用2个柱子，多郁闷啊。
冻干人纤维蛋白原说明书
冻干人纤维蛋白原说明书 【批准文号】 国药准字S1******* 【中文名称】 冻干人纤维蛋白原 【产品英文名称】 Human Fibrinogen, Freeze Dried 【生产企业】 上海生物制品研究所 【功效主治】 1.先天性纤维蛋白原减少或缺乏症。 2.获得性纤维蛋白原减少症：严重肝 脏损伤；肝硬化；弥散性血管内凝血；产后大出血和因大手术、外伤或内出血等引起的纤维蛋白原缺乏而造成的凝血障碍。 【化学成分】 主要组成成分：人纤维蛋白原。 【药理作用】 在凝血过程中，纤维蛋白原经凝血酶酶解变成纤维蛋白，在纤维蛋白稳定因子（FXIII）作用下，形成坚实纤维蛋白，发挥有效的止血作用。 【药物相互作用】 不可与其他药物同时合用。 【不良反应】 一般无不良反应，仅少数过敏体质患者会出现过敏反应，严重反应者应采取应急处理措施。 【禁忌症】 在严格控制适应症的情况下，无已知禁忌症。 【产品规格】 0.5g 【用法用量】 用法：使用前先将本品及灭菌注射用水预温至30～37℃，然后按瓶签标示量注入预温的灭菌注射用水，置30～37℃水浴中，轻轻摇动使制品全部溶解（切忌剧烈振摇以免蛋白变性）。用带有滤网装置的输液器进行静
脉滴注。滴注速度一般以每分钟60滴左右为宜。 用量：应根据病情及临床检验结果决定，一般首次给1～２g，如需要可 遵照医嘱继续给药。 【贮藏方法】 应严格保存于10℃以下避光干燥处。效期：在瓶签标明的有效期内使用。【注意事项】 1 本品专供静脉输注。 2 本品溶解后为澄清略带乳光的溶液，允许有少量细小的蛋白颗粒存在， 为此用于输注的输血器应带有滤网装置，但如发现有大量或大块不溶物 时，不可使用。 3 在寒冷季节溶解本品或制品刚从冷处取出温度较低的情况下，应特别注 意先使制品和溶解液的温度升高到30～37℃，然后进行溶解。温度过低 往往会造成溶解困难并导致蛋白变性。 4 本品一旦溶解应尽快使用。 招商代理信息 药店名称药店地址药店联系方式更新时间 冻干人纤维蛋白原网友点评 查看更多评论
血清蛋白电泳操作规程
血清蛋白电泳 一．项目名称 血清蛋白电泳（HYDRAGEL PROTEIN） 二．检验方法名称 琼脂糖凝胶区带电泳 三．方法学原理 蛋白电泳是临床实验室中一种常用的蛋白质剖析技术。它可以对血清或其他体液中的异常蛋白质进行筛选。它是以区带电泳为基础在一种合适的支持介质—琼脂糖上进行的电泳。血清蛋白质在给定的PH条件下主要根据其所带电荷数将其分离成五种片段：白蛋白,α1球蛋白,α2球蛋白,β球蛋白,γ球蛋白，每一区带含有一种或多种血清蛋白质。 四．方法学溯源 自1930年由Tiselius发现了移界电泳（moving boundary eectrophoresis），而后，这种技术的各种局限性已逐渐被区带电泳（zone elecrrophoresis）所克服，区带电泳的条件和支持介质的选择是电泳成败的关键。血清蛋白区带电泳是在临床实验室中常用的技术之一，可定性和/或半定量各条正常或异常蛋白区带。 五．仪器 （一）型号：SEBIA HYDRASYS (PN1210) （二）分析和计算参数： 1．处理量：约162个样本/小时 2．所需样本量：10ul 3．检验时间：约半小时 4．重复性：有良好的批内和批间重复性 5．电泳参数：电压0－300V（可选至3000V） 电流0－500mA 功率0－100W 六．试剂及配套品 （一）试剂 1．HYDRAGEL 7 PROTEIN(E)试剂盒 HYDRAGEL 15 PROTEIN(E)试剂盒 HYDRAGEL 30 PROTEIN(E)试剂盒 （1）商标：SEBIA （2）包装规格：70测试/150测试/300测试 （3）货号：PN4100/ PN4120/ PN4140 2．脱色液 （1）商标：SEBIA （2）包装规格：Pack for 10×100ml （3）货号：PN4540 (4) 成分：柠檬酸
胶内酶解
一、试剂准备 1．30mmol/L K3Fe(CN)6铁氰化钾 9.9 mg K3Fe(CN)6溶于1mL Milli-Q水 2．100mmol/L Na2S2O3硫代硫酸钠 24.8 mg Na2S2O3溶于1mL Milli-Q水 3．200mmol/L NH4HCO3碳酸氢铵 0.079g NH4HCO3溶于5 mL Milli-Q水 4. 覆盖液（酶解缓冲液） 40mmol/L NH4HCO3, 10% ACN 200ul 200mmol/L NH4HCO3, 100ul ACN, 700ul Milli-Q水 5. 萃取液 50％ACN，0.1% TFA 6. 胰蛋白酶 贮存液：胰蛋白酶溶于50mM醋酸溶液中（1mL Milli-Q水加入冰醋酸2.86 uL），浓度1ug/uL，即每管20ug，溶于20uL 50mM醋酸溶液中。 工作液：使用覆盖液稀释至10ng/uL
7. 脱色液 银染脱色液：30mmol/L K3Fe(CN)6与100mmol/L Na2S2O3 1:1混合 考染脱色液：50％ACN, 40mmol/L NH4HCO3 以上试剂单独存放在质谱准备室，不要使用其他来源的药品、试剂，其中脱色液需现用现配。 二、实验步骤 1. 切胶 用剪刀剪断Tip（进口Tip），将蛋白质斑点从凝胶上切下，置于0.5 mL EP管内（进口产品），每管加Milli-Q水400 uL振荡洗涤2min，吸出液体后重复一次，以保证酸液被洗净。 2. 脱色 银染样品：每管加入现配脱色液50-80uL（视胶粒大小而定），静置2min左右，当胶粒由棕黑色变成亮黄色（与脱色液颜色相同时），迅速加入400uL Milli-Q水终止反应，重新加入400uL Milli-Q水振荡洗涤一次，吸出多余的液体。 （3％H2O2/25mM NH4HCO3/H2O） 考染样品：每管加入现配脱色液50-80uL（视胶粒大小而定），静置2min左右，待胶粒蓝色褪却时，加入400uL Milli-Q水终止反应，重新加入400uL Milli-Q水振荡洗涤一次，吸出多余的液体。 3. 洗涤 向每管加入200uL 40mmol/L NH4HCO3，振荡洗涤2min，多余液体吸出丢弃，重复1次。
琼脂糖凝胶电泳片断回收的常用方法
琼脂糖凝胶电泳片断回收的常用方法 琼脂糖凝胶电泳片断回收的常用方法20世纪70年代是一个奠定现代分子生物学的时代，1973年冷泉港实验室的Joseph Sambroo k和Phillip Sharp发明了利用琼脂糖凝胶分离DNA 和EB染料观测DNA 相结合的技术。现在，琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离、鉴定和纯化核酸和蛋白质片断的标准方法。这里首先介绍的是琼脂糖凝胶电泳片断回收的常用方法： 1.柱回收试剂盒：可谓目前最简单快速的回收方法，只需要将电泳凝胶中的产物条带切下，用溶解Buffer彻底溶解，上包埋有纯化填料的纯化柱，离心，再洗涤一次，离心后用洗脱缓冲液洗脱。全程不过10多分钟，得到的产物溶液可以直接用于后继实验。这个方法几乎不需要什么技巧就能得到稳定的结果，也是目前最多商品化试剂盒选择的方法。但是这个方法不适合用于大片断的回收。 2.玻璃奶/纯化填料胶回收试剂盒：这个方法比前面的方法更为灵活，可以根据每次回收实验时预期回收量来调整纯化填料的量，使得实验不受限于柱子的载量，也不会造成浪费。前面的操作步骤和上者一样，将电泳凝胶的条带切下，Buffer溶解，（区别在于这里）加入纯化填料填料吸附混合，快速离心沉淀去上清，洗涤沉淀后，干燥沉淀，最后用洗脱液纯化介质中吸附的片断释放出来，离心，取上清，
就是回收的产物。这个方法适合各种不同大小的片断，特别是大片断的回收，但是操作就较前者复杂一些，涉及到多次离心沉淀和取上清，有可能会误吸了微量的沉淀；另外干燥的程度也有点技巧，干过了不好洗脱，没干透又影响结果。后来的改进版本有将混合了纯化介质后的凝胶溶解液加入到一种离心过滤柱上，这种柱子不带纯化填料，只有一层过滤膜，离心过滤后，填料在柱子里，溶液被甩掉，这样就避免了上述的问题。 3.低熔点琼脂糖：传统手工操作方法之一，低熔点琼脂糖制备凝胶，电泳后切割目的条带，在TE溶液中65度保温融化，用传统的酚氯仿抽提，乙醇沉淀。这个方法需要用到酚氯仿等有机试剂，由于乙醇沉淀需时较长，现在用的人已经不多了。想当年经费紧张的时候，低熔点琼脂糖贵，不舍得这么浪费的，比较取巧省钱的法子就是常规琼脂糖电泳后，在目的条带前方挖槽，灌入低熔点琼脂糖，凝胶后再电泳一小会儿，等条带进入低熔点琼脂糖区域再将那块家伙切出来，就可以非常非常节约了。除了直接酚抽低熔点琼脂糖凝胶，还有人用琼脂糖酶来消化琼脂糖凝胶，条件也相当温和，只是那酶价格并不便宜（光那酶的成本就至少5-6块，还不算其他的麻烦事），多数的酶只适合用低熔点琼脂糖，问题是我不用酶也可以直接酚抽，费时间还特长，所以，并不觉得特别好用。后来据说T家的琼脂糖酶可以用于常规琼脂糖，前提是你有办法在65度把那胶化了。但那需要极好的耐心。
SDS-PAGE电泳实验步骤
垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质 一、实验目的 学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。 二、实验原理 蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。 聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。本实验采用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时，分子量大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，采用两种缓冲体系；上层胶pH=6.7—6.8，下层胶pH＝8.9；Tris —HCI缓冲液中的Tris用于维持溶液的电中性及pH，是缓冲配对离子；CI-是前导离子。在pH6.8时，缓冲液中的Gly-为尾随离子，而在pH＝8.9时，Gly的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性，控制了慢离子的解离度，进而达到控制其有效迁移率之目的。不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后，各种蛋白质由于所带的静电荷不同，而有不同的迁移率。由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子筛效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。 如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)，由于SDS带有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性的蛋白质—SDS复合物；此时，蛋白质分子上所带的负电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。蛋白质分子量愈小，在电场中移动得愈快；反之，愈慢。蛋白质的分子量与电泳迁移率之间的关系是： M r =K(10-b·m) logM r =LogK—b·R m ， 式中M r ——蛋白质的分子量； logK——截距； b——斜率； R m ——相对迁移率。 实验证明，蛋白质分子量在15,000—200,000的范围内，电泳迁移率与分子量
胶内酶解
1.2.2 蛋白质谱鉴定 （1）胶内酶解 斑点切取：用剪刀将200 μL枪头尖端剪掉约1-2cm，孔的直径约为2-3 mm，用修剪后的吸头从凝胶上戳取蛋白质点，再转入200μL离心管中（离心管灭菌后浸泡于75%乙醇，用时取出自然干燥）。操作时注意减少污染，戴帽子手套操作，尽量减少所切取蛋白质点周围的凝胶体积，勿使样品干燥。 脱色、脱水：每管加入100 μL脱色液（50% 乙腈，25 mM 碳酸氢铵），室温放置30 分钟，吸去脱色液，重复以上步骤脱色至胶块无色透明。加入60 μL 乙腈使凝胶脱水10 min，丢弃上清液。 酶解：每块凝胶加入约8 μL（浓度为12.5 ng/μL）溶于100 mmol/L 碳酸氢铵的胰蛋白酶，4℃ 吸胀1 h，吸出多余酶液，倒置于37℃温箱中保温12 h。加入10 μL 5% 三氟乙酸，1 h后将溶液转移到新的Ep管内，重复2次将溶液合并。加入10 μL 2.5% 三氟乙酸，1 h后将溶液与之前溶液合并，重复2次。将肽段溶液在冻干机中真空低温冻干，以备用于质谱鉴定。用0.2%三氟乙酸充分溶解肽段，立即进行质谱鉴定。保存？？？ （2）质谱鉴定 ①点靶：将冻干肽混合物中加入2μL 0.2% 三氟乙酸溶液，充分溶解肽段。取每个样品0.6 μL手工点于MALDI靶板上，避光干燥。再取0.6 μL饱和基质α-手工点于MALDI靶板上，避光干燥。待溶剂挥发后，将MALDI靶置入MALDI-TOF-TOF质谱仪(4800 Proteomies Analyzer)。 ②质谱鉴定：样品用4800串联飞行时间质谱仪4800 Proteomies Analyzer 进行质谱分析，采用反射模式，一级、二级质谱连续自动检测，采用自动获取数据的模式采集数据。肽指纹图谱（PMF）质量扫描范围为800-4000Da，且一级质谱强度最大的 5 个峰进行串级质谱分析。谱图用myoglobin酶解肽段进行外标校正。
胶回收
除了选择合适的方法外,实验中还要注意以下几点: (1)防止抽提过程中污染DNA酶 与回收片段接触的试剂与器皿等都应进行灭菌(酶)处理,即使是不能用干热或湿热法灭菌的器皿也要用乙醇浸泡以灭杀活菌与DNA酶,不然可能发生回收片段部分降解的现象,有时甚至一无所获.即使是轻微的降解反应——当发生在粘性末 端时也会导致严重的连接困难. (2)紫外照射选择长波段 回收过程往往需在紫外等监测下进行,与一般观察电泳结果不同的是这时应用长波紫外灯.因为短波紫外线(254nm)会引起DNA的断裂或是形成TT二聚体,前者会使以后的连接与转化等实验失败,后者可能造成基因突变,给克隆工作带来麻烦.即使是使用了长波紫外照射,回收DNA时也要尽量短时照射,避免连续长时间照射. (3)实验操作要轻柔 特别在处理较大片段时应防止机械剪切作用DNA对的破坏,如吸取液体,转动离 心管等操作均应缓慢,轻柔. 综上所述,只有在合适的回收方法基础上注意具体操作步骤是才能有效回收所需片段,为以后的酶切,连接,标记等工作打下良好基础. 3 实验步骤 一、试剂盒法(Kit回收法,以上海申能博彩生物科技有限公司生产的试剂盒为例) (1)从电泳板上切割含目的DNA片段的凝胶块(割胶尽可能的小,提供后续回收效率) (2)凝胶称重后并将其放入1.5ml管中,将其适当切小,加速溶解.每100mg凝胶加入400μl solution SN.(若称重省略,一般加入400μl SN) (3)凝胶溶解:55-60℃,保温5-10分钟,每2分钟混匀一下,使凝胶溶解,胶完全融化后每400μl solution SN中加入solution B 100μl,混匀. (4)将3S柱装入2ml洗管,将上述混合液转移至3S柱,室温放置2min.室温10 000 rpm离心1分钟,稳定45秒. (5)取下3S柱,倒掉收集管中的废液,将3S柱放入同一收集管中,加入600μl Wash Solution,室温10 000 rpm离心1分钟. (6)重复步骤5一次. (7)取下3S柱,倒掉收集管中废液,将3S柱放入同一收集管中,室温10 000 rpm 离心2分钟. (8)将3S柱放入新的离心管中,在3S柱子膜中央加30μl ddH2O,不加盖室温放 置2分钟. (9)盖上离心管,室温10 000 rpm离心1分钟,离心管中的液体即为回收的DNA 片段. 胶回收 一. 提高胶回收量的办法： 1) 增加电泳时的上样量。 2) 电泳缓冲液用新鲜配制的。
人纤维蛋白原
人纤维蛋白原 【药品名称】 通用名称：人纤维蛋白原 英文名称：Human Fibrinogen 【成份】 主要组成成分：人纤维蛋白原。 【适应症】 1.先天性纤维蛋白原减少或缺乏症。 2.获得性纤维蛋白原减少症：严重肝脏损伤；肝硬化；弥散性血管内凝血；产后大出血和因大手术、外伤或内出血等引起的纤维蛋白原缺乏而造成的凝血障碍。 【用法用量】 用法：使用前先将本品及灭菌注射用水预温至30～37℃，然后按瓶签标示量注入预温的灭菌注射用水，置30～37℃水浴中，轻轻摇动使制品全部溶解（切忌剧烈振摇以免蛋白变性）。用带有滤网装置的输液器进行静脉滴注。滴注速度一般以每分钟60滴左右为宜。用量：应根据病情及临床检验结果决定，一般首次给1～２g，如需要可遵照医嘱继续给药。 【不良反应】 一般无不良反应，仅少数过敏体质患者会出现过敏反应，严重反应者应采取应急处理措施。【禁忌】 在严格控制适应症的情况下，无已知禁忌症。 【注意事项】 1本品专供静脉输注。2本品溶解后为澄清略带乳光的溶液，允许有少量细小的蛋白颗粒存在，为此用于输注的输血器应带有滤网装置，但如发现有大量或大块不溶物时，不可使用。
3在寒冷季节溶解本品或制品刚从冷处取出温度较低的情况下，应特别注意先使制品和溶解液的温度升高到30～37℃，然后进行溶解。温度过低往往会造成溶解困难并导致蛋白变性。4本品一旦溶解应尽快使用。 【特殊人群用药】 儿童注意事项： 尚无研究资料 妊娠与哺乳期注意事项： 对孕妇及哺乳期妇女用药应慎用，只有经过利弊权衡后认为患者确有必要使用时方可使用，并在医师指导和严密观察下使用。 老人注意事项： 尚无研究资料 【药物相互作用】 不可与其他药物同时合用。 【药理作用】 在凝血过程中，纤维蛋白原经凝血酶酶解变成纤维蛋白，在纤维蛋白稳定因子（FXIII）作用下，形成坚实纤维蛋白，发挥有效的止血作用。 【贮藏】 应严格保存于10℃以下避光干燥处。效期：在瓶签标明的有效期内使用。 【有效期】 24个月 【批准文号】 国药准字S2*******
SDS-PAGE电泳操作规范
聚丙烯酰氨凝胶电泳 一简介 作用原理：聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）及SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由shapiro 于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂（SDS即十二烷基磺酸钠）后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。 二作用 SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇(DTT)能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选
TRIS/HCl缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCl解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。 三电泳过程 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用。当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙醇，可使蛋白质分子中的二硫键还原。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质—SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为18A(1A=10的负十次方米），这样的蛋白质—SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小由于蛋白质－SDS复合物在单位长度上
蛋白胶内酶解方法
三、制备方法 （一） 胶内酶解方法[9] 1.操作步骤 1)用手术刀片切下电泳胶上目标条带(或用自制切点器切下感兴趣的点)，置于EP管中(胶块切成约 1mm3大小)，同时切下空白胶块作对照 2)加入200～400ul 100mM NH4HCO3/30%ACN脱色，清洗至透明，去除上清，冻干(注：脱色液体积过 量为好，脱色至透明，不必担心蛋白的损失，因为完整蛋白在此条件下很难被洗脱) (若为银染)[10]取30～50ul 30mM K3Fe(CN)6:100mM Na2S2O3=1:1(体积比)加入胶块内，清洗至蛋白点棕色消失，去除上清，立刻加200ul水终止反应，10分钟后，去除上清，再加入100ul 100mM NH4HCO3,静置20分钟，去除上清 3)(若是2-D gel，则跳至第8步) 每管加入90ul 100mM NH4HCO3，10ul 100mM DTT，56℃孵化30分 钟，还原蛋白质(注：溶液体积过量，若温度为室温，反应时间相应延长至1～2小时) 4)去上清，每管加100ul 100%ACN，5分钟后吸去 5)每管加入70ul 100mM NH4HCO3，30ul 200mM IAA(现配，避光保存)，暗处20分钟 6)去上清，每管加入100ul 100mM NH4HCO3，室温15分钟 7)去上清，加入100ul 100%ACN，5分钟后吸去，冻干 8)冻干后，各加入5ul 2.5～10ng/ulTrypsin溶液，置于4℃冰箱30～60分钟，使胶块充分吸胀(若仍有剩 余液，吸出打掉)注：50ng酶量是基于考染一块胶1mg的上样量，12.5ng是基于银染一块胶100ug的上样量。上样量增加，酶量同比增加，酶与被分析蛋白质量比一般为1：20～1：100[11,12] 9)再加入20~30ul左右50mM NH4HCO3缓冲液(无Trypsin)，PH 7.8～8.0(Promega)注：缓冲液体积视胶 块体积而定，一般没过胶块20ul左右 10)37℃反应过夜，20小时左右 11)吸出蛋白酶解液，转移至新EP管中，原管加入100ul 60% ACN/0.1%TFA,超声15分钟，吸出溶液， 并入前次溶液，反复抽提3次，合并，冻干 12)样品制备完成，可以复溶，点样，进行质谱分析 2.注意事项 1)若样品种类较多，切记编号离心管，样品对号入管 2)考染方案各注释均适用于银染方案 3)整个操作过程应注意角蛋白等的污染 4)佩带一次性乳胶手套，使用洁净的离心管及Millipore H2O 5)不同公司的酶，最适PH范围不同，调节PH值 3.试剂配制 1)100mM NH4HCO3：称取1.581g NH4HCO3(MW 79.06)溶于200ml Milli Q水中 2)50 mM NH4HCO3：称取0.791g NH4HCO3溶于200ml Milli Q水中 3)100mM DTT：称取DTT(MW 154.3)0.0154g溶于1ml 100mM NH4HCO3溶液中 4)200mM IAA：称取IAA(MW 185.0)0.0370g溶于1ml 100mM NH4HCO3溶液中 5)TPCK-Trypsin无需配制，Promega公司已提供成品，浓度为0.5ug/ul，用时可按需稀 6)30mM K3Fe(CN)6：称取K3Fe(CN)6(MW 329.25)0.0099g溶于1ml Milli Q水中 7)100mM Na2S2O3·5H2O：称取Na2S2O3(MW 248.11)0.0248g溶于1ml Milli Q水中 8)银染脱色液：将6)和7)以1:1体积混合，现配