环糊精类手性固定相汇总

8.1引言

近年来手性色谱领域的发展，使对映体的分离逐渐趋向于正规化，环糊在这方面起着重要作用。环糊精由villiers于1891年发现，由于它没有还原性和能被酸分解，在外形上又与纤维素十分相似，所以称为木粉（cellulosine）[1]。12年后，schardinger首次鉴定出环糊精是一种低聚糖，同时详细地叙述了它的制备和分离方法[2,3]。Schardinger还成功的分离出纯芽孢杆菌，取名纯化芽孢杆菌（bacillus macerans）至今仍是环糊精生产和研究中经常用的菌种。环糊精可以由水解液选择性的分离，也可用吸附色谱和纤维素柱色谱分离和鉴定环糊精[4]。 Freudenberg等人认识到了环糊精配合物的稳定性[5].此后对环糊精及其配合物特性的研究进行了大量的研究工作。目前高效液相色谱环糊精键合固定相，衍生化环糊精键合固定相，在对映体分离领域中已成为很有用的工具。

环糊精（cyclodextrin,CD）是由一定数量的葡萄糖单元通过α－1,4葡苷连接的环状分子结构。由所含葡萄糖单元的个数不同，可分为α－CD,β-CD ,γ-CD . α－CD含有6个葡萄糖单元，β-CD含有7个葡萄糖单元，γ-CD含有8个葡萄糖单元。

目前还未发现少于6个葡萄糖单元的环糊精，已鉴定出多于8个葡萄糖单元的环糊精，某些支化结构的环糊精已有报告[4]。环糊精的分子示意图类似于厚壁截顶圆锥筒（见图8.1）。

图8.1环糊精结构

n＝1，α－CD；n＝2，β-CD；n＝3，γ-CD

每个葡萄糖单元的2,3位仲羟基在环的大口一方，6位伯羟基在环的小口一方。环的内侧是由氢原子和成桥氧原子形成的，所以环的内侧具有相对疏水性。环糊精分子中每个葡萄糖单元含有5个手性碳原子。因此α-CD，β-CD，和γ-CD 就分别含有30，35，40个手性碳原子。环糊精最突出的特点是能与许多有机分子形成包容配合物(inclusion complex),即客体分子部分或全部进入CD的空腔[5].环糊精的物理性质列在表8.1中

表8.1环糊精的物理性质

环糊精葡萄糖

单元

分子量

腔尺寸水溶性,M

外径内径深度

α－CD

697313.7 5.77.80.114

β-CD 7113515.37.87.80.016

γ-CD 8129716.99.57.80.179环糊精液相色谱固定相的发展大致可分为环糊精聚合物固定相，环糊精键合固定相，衍生化环糊精固定相或多模式环糊精固定相几个阶段。

1965年，Solms和Enli[6]合成出了保留环糊精包合作用性能的CD聚合物，他们把环糊精与3-氯－1,2还氧丙烷反应，得到适用于液相色谱标准粒径的不溶性聚合物的固定相。这种固定相对溶质的保留是CD-溶质包合常的函数，且对大量的天然产物，香料，芳香酸，核酸等有分离能力。其缺点是机械强度差，不能在高压下操作。以后的研究多集中在如何将环糊精连接在硅胶上，得到能在高压下使用的环糊精键合固定相。

1983年，Fujimura [7]和Kawguchi [8]合成出了硅基氨和酰胺键合固定相，但该固定相稳定性差，易水解。

1985年,Armstrong 研究组[9]合成除了不含硫,氮的环糊精手性固定相,这类固定相稳定性好，不易水解，目前这些稳定的固定相已作为Cyclobond 商品出售，Cyclobond 分别为β-CD，α-CD和γ-CD，对位置异构体和光学异构体都有很好的拆分能力。但是这类环糊精固定相只有在反相条件下才能使用才能有分离能力。在正相条件下，由于流动相中的非极性分子占据了环糊精内腔，使得溶质分子很难进入内腔，因而不能对溶质包合。对于手性化合物常常没有拆分能力，限制了它的应用范围。

为了克服环糊精键合固定相存在的上述不足，Hattori[10,11]报道了两种氨基改性的环糊精手性固定相。发展出了衍生化的环糊精固定相。Fujimura[12]合成出了两种氨基甲酸酯改性的环糊精固定相。Armstroing[13-15]等合成出了一系列酰基和异氰酸酯改性的环糊精手性固定相。环糊精键合相的衍生化，增大了固定相与溶质分子的疏水相互作用或π-π相互作用，扩大了手性拆分的范围和能力，在正相和反相条件下，都有很好的拆分能力，所以又称多模式手性固定相（multimodal csp,MMcsp）。与纤维素和淀粉类涂覆型固定相不同，衍生化的环糊精是共价键合到硅胶上的，所以对温度和溶剂的限制较少。（R,S）-萘乙基氨基甲酸酯β-CD 是最先使用的MMCSP。Li和Purdy[16]合成了一系列苯基、萘基和吡啶基改性的β-CDMMCSP,Okamoto等[17]合成了3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯β-CD-MMCSP,。这些固定相由于既具有环糊精疏水空腔的包合作用，又具有芳香环的π－π作用，氢键作用和立体排阻效应，所以又称为多作用手性固定相（Multiple－interraction chiral stationary phase）。

8.2环糊精键合固定相

8.2.1键合方式

环糊精最重要的特点是能与许多有机分子、离子、游离基、无机分子等形成包容配合物。这些包容配合物不仅能以固体状态存在，而且在水和某些有机溶剂中也是稳定的。在配合物中，环糊精被称为主体，进入空腔中的分子或离子被称为客体。客体分子能进入环糊精空腔，主要是疏水亲脂作用，范德华作用，静电引力作用，释放出包容的高能水分子和体系张力能的作用，而客体分子与环糊精空腔的体积匹配作用是最重要的。正是由于环糊精的这一特性和良好的手性识别能力，在液相色谱手性分离中常用作流动相添加剂和固定相。其中，由于环糊精固定相操作简便而得到广泛应用。

前已提及，早期使用的环糊精固定相是通过聚合、交联生成的颗粒。机械强度差，柱效低，不能进行高速高效分离，以后发展出的化合键合固定相克服了上述不足。

化学键合环糊精是利用环糊精分子中活性羟基，通过间隔垫分子把环糊精共价键合到硅胶表面。从化学反应活性考虑，环糊精分子中3种－OH的反应活性

顺序是C

6-OH>C

2

-OH》C

3

-OH. C

6

-OH的化学反应活性最强，而C

6

-OH又在环糊精分

子的小口一方，所以环糊精键合通常都是环糊精的小口边与硅胶上的间隔垫连接。

C 2与C

3

位羟基的活性也有明显的差别，C

3

位羟基的活性要比C

2

位低的多，由

于互相处于邻位，影响C

3位的取代反应不完全，但C

3

位羟基磺酰化之后，在碱

性条件下也易与C

2

羟基生成2,3－脱水环糊精。大体积的反应物优先靠近到

C 6-OH，它最容易接近。C

2

-OH的酸性最强，Pka＝12.2，在无水条件下易选择性

的去质子，进而与亲电试剂反应。C

3-OH反应性最低，在C

6

，C

2

位羟基被封锁之

后才能选择性的进行反应。羟基可以直接与烷基卤化物、环氧化物、烷基或芳基酰卤、异氰酸酯以及无机酸的卤化物反应生成酯或醚。

环糊精与硅胶键合连接的方式可以有以下几种：

1.胺键连接

氨丙基键合相与硅胶反应：

2.酰胺键连接

羧酸化的氨丙基硅胶键合相与乙二胺基环糊精反应：

3.碳氧碳键连接

醚基硅胶键合相与环糊精反应：

前两种键合方式在连接隔垫上含有氮原子，稳定性差，易水解，第三种不含氮的键合相已证明在标准高效液相色谱条件下，是相对稳定的〔〔[18,19,20]。目前这类固定相已作为Cyclobond商品出售。β-CD，γ-CD和α－CD键合相的商品名分别为CyclobondⅠ、Ⅱ、Ⅲ。Cyclobond被认为是最成功的液相色谱固定相之一。

8.2.2β-环糊精键合相

不含氮原子的醚键连接的β-环糊精键合固定相的制备方法有两种。一种是先将含有环氧基连接体键合在硅胶基质上，而后与环糊精反应得到环糊精键合固定相[21]〔。另一种合成方法[22]是先将连接体试剂与环糊精反应，再与硅胶反应得到环糊精键合固定相。我们通过对两种制备方法比较的结果表明[23]，用第二种方法制备的β-CD固定相含碳量高，对评价样品O-,M-,P-硝基苯胺异构体分离度好，说明固定相上β-环糊精的键合量比第一种合成方法得到固定相高。合成步骤下式所示：

在合成的β-环糊精固定相上，对如图8.1所示的三种硫代缩水甘油醚和两种硒代缩水甘油醚进行了拆分。

图 8.1外消旋化合物结构

影响手性分离的因素很多，在确定的固定相条件下，对确定的样品来说，流动相的组成是影响分离的关键因素。流动相的组成对样品保留和拆分的影响参见表8.2。可以看出，随着流动相中甲醇含量的增加，容量因子k减小除两个硒代缩水甘油醚外，分离因子α总的趋势也是减小的。这是由于随着流动相这甲醇含量的增大，相对疏水的甲醇分子占据环糊精内腔的几率也会增加，样品芳香环进入内腔的几率减小，故保留值减小。

表8.2 流动相甲醇含量对k’和α的影响

甲醇/ 40/60 45/55 50/50

缓冲液*（v/v）k

1’k

2

’αk

1

’k

2

’αk

1

’k

2

’α

样品1 4.00 6.74 1.69 2.34 3.38 1.44 1.64 2.09 1.28

2 6.99 11.2

3 1.61 3.22 5.13 1.5

4 1.87 2.71 1.45

3 12.2

4 16.53 1.3

5 5.05 6.71 1.33 2.72 3.51 1.29

4 8.08 10.31 1.28 4.20 5.3

5 1.33 1.9

6 2.50 1.28

5 4.93 7.27 1.47 3.10 4.04 1.30 1.91 2.61 1.37

缓冲液：0.3％醋酸三乙胺（PH5.0）

在用环糊精手性键合相拆分对映异构体时，对样品的结构有特殊要求，一是样品分子必须部分能够进入环糊精内腔，二是样品分子手性中心上的极性基团与环糊精腔中的羟基发生缔合作用[23]。所拆分的5种化合物都含有苯环或萘环，能与环糊精内腔发生包容络合作用。尽管样品分子中手性中心上的羟基距芳香环较远，但通过合适的取向，仍能与环糊精腔口的羟基形成氢建，所以这几种化合物的对映体在环糊精键合固定相上能得到较好的分离[24]。（见图8.2）。

图8.2缩水甘油醚对映体拆分图

柱：150×4.6mm；固定相：β-环糊精键合相；流动相：甲醇/0.3％醋酸三乙酯（PH5.0）＝40/60（v/v）;流速：1.0ml/min.

环糊精键合固定相有良好的化学和物理稳定性，是目前应用最广泛的手性固定相之

一。由于环糊精的内腔是疏水的，所以在反相分离模式条件下，疏水溶质占据环糊精的内腔并生成包合配合物是溶质保留和手性选择性分离的基础。在正相条件下，疏水性的流动相占据了环糊精的内腔，溶质与环糊精内腔口羟基的相互作用是主要的。因此，在正相条件下与二醇基柱类似[27]，手性选择性差。为了扩大环糊精键合相的应用范围，出现了改性环糊精键合固定相。通常有5种功能团可以连接在环糊精键合固定相上[25]：（1）乙酰基，（2）2－羟丙基，（3）萘乙基氨基甲酸酯，（4）二甲基丙基氨基甲酸酯，（5）对－甲苯甲酰酯。表8.3列出了已商

品化的环糊精键合手性固定相。这些衍生化的环糊精键合固定相可用于反相和正相两种分离模式，所以称为“多模式手性固定相”。

表8.3环糊精及其衍生物化学键合相固定相

1)取代基连接在C-2,C-3或C-6位氧原子上

8.2.3环糊精键合相的保留机理

在反相模式中，天然环糊精键合相有独特的选择性。对溶质的保留受包合配合作用的影响，[26-30]这种配合物的作用包括溶质分子的非极性部分与相对非极性的环糊精内腔之间的相互作用，作用的示意图如图8.3所示：

图8.3环糊精键合固定相可逆包合配合物生成的示意图

包合配合物由于范得华尔斯-伦敦（Vander walls －london）弥散力和氢键作用力而变得稳定[31，,32]。溶质分子的大小，形状是影响包合配合物的稳定性的关键因素，一个太大的分子要装进疏水性的内腔形成配合物是不可能的。对C

-OH

2 -OH产生氢建的极性分子通常会优先产生包合配合物作用[32]。苯分子能够渗和C

3

入α-环糊精内腔的深度是渗入β-环糊精的一半，β-环糊精对芘的亲和力比γ-环糊精低50％[32,33]。芳香基有与环糊精内腔的配糖共享电子的能力，因而能得到合适的定向[28,32]。环糊精固定相对多环芳香烃（PAH）的分离表明，它们的保留与分子的形状和大小关系比与分子量的关系更大[30]。饱和环也能被环糊精包合，但装配是无规则的，所以选择性差[30,34]。在适当几何形状和PH条件下，胺类和羧酸盐功能团与环糊精的羟基有强的作用，这对于手性选择性或许是必须的次级和三级相互作用。对系列化合物：９-氮杂芴，芴，硫芴，联苯氧芴，改变分子中的一个原子，可以极大改变保留（图8.4）[30]。这是由于溶质分子与β-环糊精仲羟基的相互作用所致。

环糊精键合相的相对极性对保留有贡献，许多其它的相互作用对保留也有贡献。例如，与硅胶表面的残留硅羟基和间隔臂之间就有相互作用[35]。

在天然环糊精键合固定相上，反相和正相两种洗脱模式都能观察到溶质保留。至今，用水、有机改性剂流动相的反相模式对对映体选择性分离已获得极大成功。正相模式对结构异构体[36-42]和胡萝卜素[43]的分离十分有效。对环糊精键合柱，正己烷和醇改性剂是典型的正相溶剂。

图8.4同系化合物分子这改变一个原子对保留影响的色谱图

8.2.4手性选择性

对天然环糊精键合固定相的反相洗脱模式，至少有下列两种作用才能有对映体选择性。第一，溶质与环糊精空腔之间必须发生紧密的配合。第二，溶质和环

糊精空腔口的C

2-OH和C

3

-OH之间必须产生某些相互作用[27]。而且上述两种作用

必须对三点作用有贡献，溶质和手性固定相之间的作用能量有差异，这一点对于手性识别十分重要[43,45]。

分子装配越好，手性分离的可能性越大[28]。通常认为，为达到滑动配合，溶质分子至少应有一个环或多个环。在大多数情况下，应有一个苯环[27,46-50]。在三种天然环糊精固定相中，CyclobondⅠ（β-CD）最常使用于手性分离。通常，β-环糊精键合相能分离具有两个芳环结构的溶质分子，如丹酰（dansyl，１-二甲胺基萘-５-磺酰）氨基酸，但对某些单环结构的化合物也能成功的进行分离[46-50]。这说明β-环糊精能紧密的包合萘基和联苯基结构大小的分子。腔体更大的γ-环糊精键合固定相（CyclobondⅡ）用反相模式可分离含有稠环的对映体如萘或多环芳烃[51]。

在α－环糊精键合固定相上分离了苯基丙氨酸，色氨酸、酪氨酸芳族氨基酸和19种相关化合物的对映体[49]，分离的数据列在表8.4中。所有被拆分的化合物在立体中心的β位都有一个单一的芳香环或芳香吲哚取代基，在立体中心与芳香环相对应的是胺和酸的功能团，这两种功能团都能有效的生成氢建。芳环上的取代基除可进入环糊精空腔的对－NO

2

,-OH和卤素可以提高配位作用外，其它取

代基都会使选择性降低。非极性取代基，如６－甲基或６－氟代色氨酸，因促使分析物倾斜地进入环糊精空腔（立体作用）而增加选择性。胺的衍生物能增加保留，但不增加选择性[50]。

表8.4芳香族氨基酸和相关化合物的对映体在α-CD键合固定相(Cyclobond Ⅲ)上分离的色谱数据

a 数据文献摘自[45]

b k’是先洗脱出的对映体,在此条件下, 通常L对映体先洗出

c流动相:缓冲液:甲醇(v/v), 缓冲液为1.0% 醋酸三乙胺(TEAA), PH 5.1，有机改性剂为甲醇。

含有单个芳环的手性化合物对映体能在β-环糊精键合固定相上分离，在α－环糊精键合固定相上同样也能得到相似的分离结果，分离数据列在表8.5中[49]。除５种氨基酸苯环取代基在立体中心的β-，γ-，位外这些外消旋化合物在立体中心的α位都有芳环。所有化合物（除２种以外），在立体中心之外都含有羰基。因此，全部外消旋化合物生成包合配合物时，靠近环糊精内腔口的羟基至少有一个能形成氢建。

表8.5芳香族氨基酸和相关化合物的对映体在α-环糊精键合固定相(CyclobondⅠ)上分离的色谱数据 a b

a. 数据文献摘自[44];

b. 用串联的两根25cm CyclobondⅠ柱得到的数据；

c. k,是第一个洗脱出对映体的容量因子；

d. 流动相:缓冲液:甲醇(v/v),缓冲液为1.0%醋酸三乙胺(TEAA)；

e. pH 7.1;

f. pH 4.1。

表8.6列出了在β-环糊精键合相上能够拆分的含有两个或两个以上环的外消旋化合物。上面提到的对单个环化合物的要求，这些化合物都具备。含有两个或多个环的化合物比单个环化合物有更强的保留，如果立体中心的位置处于两个芳环之间，或在一个芳环和另一个π体系之间，对映体选择性更大。

表8.6含两个环结构的对映体在β－CD键合固定相（CyclobondⅠ）上的分离a,b

a.摘自文献[35]

b.柱：两根25cm Cyclobond I柱串联

c.k’为第一个洗脱对映体的容量因子的容量因子

d.流动相：缓冲液：甲醇（v/v）；缓冲液为1%TEAA,PH 4.1

对一系列烟碱（nicotine，尼古丁）类似物的分离表明了不同立体、电子和氢建性能对手性选择性的影响[48]，表8.7列出了分离对映体的结构和色谱数据。不同的N-吡咯烷环上的取代基有不同的拆分结果，表明存在着牢固配合取代基。如，N-苯基去烟碱上的苯基，对手性分离有促进作用。另外，虽然N－吡咯烷取代基是牢固配位取代基，但对空间作用不利，也不会有对映体选择性，如N-α-

苯基-去烟碱在β-环糊精柱上就不能拆分[51]。同样，起氢键受体作用的氟取代基也能提高手性识别作用。吡咯环上引入烷基并不增加对映体的选择性，但是引入烷基取代基可使对映体得到分离[48]。

研究了环体系中含有立体中心的对映体的手性识别，色谱数据列在表8.8中。５－苯基乙内酰脲类对映体的分离结果表明，当立体中心有两个芳环体系时，对映体的选择性比仅有一个芳环的大。如果立体中心有两个芳环，而且其中一个是稠环，如（±）-1-〔5-氯-２-（甲氨基）苯基〕-１，２，３，４-四氢异喹啉，手性选择性非常大[40]，其原因可归因于分析物的刚性和最佳的空间排列。

表8.7烟碱及其类似化合物的对映体在β－CD柱上的分离

a. 摘自文献[43]

b.先洗脱出对映体的k’

c.流动相缓冲液；甲醇（v/v），缓冲液为1%TEAA,PH7.1

d.对映体不能被拆分

e.一根25cm Cyclobond I柱

f.两根25cm Cyclobond I柱串联

g.流速1.0ml/min，

h.流速0.8ml/min

i.流速0.5ml/min

8.2.5 流动相的选择

在环糊精键合相的手性分离反相模式中，流动相一般由水和有机改性剂组成。可以使用的有机改性剂有：甲醇、乙醇、丙醇、乙腈、二甲基甲酰胺、二氧六环等，但使用最多的是甲醇和乙腈。通常在水中环糊精包合有机分子的能力最强，随着有机改性剂的加入，由于有机改性剂与溶质分子相互竞争占据环糊精内

腔，使包合能力降低[27]，甲醇是醇类中最弱的顶替剂，乙腈的顶替能力要比甲醇和乙醇强。选择不同的有机改性剂，可以改善对映体分离的选择性。

图8.5是在Cyclobond固定相上得到的容量因子k’对有机改性剂百分含量的三种基本类型的曲线。

曲线A表明，k’值随有机改性剂百分含量的增加而降低，甚至最后降到零。这是最常见的一种保留行为的类型。

曲线B的前半部分与曲线A的基本相似，只是在有机改性剂的含量更高时保留值反而增加，这可能是由于环糊精键合相的硅胶残留羟基的正相吸附所致．曲线C表明，随有机改性剂百分浓度的增加，保留值增加．这是由于溶质在有机改性剂中的不溶性引起的，在环糊精键合相手性分离中并不少见．通过改变有机改性剂的类型，可以改变图8.5中曲线的类型，但是这三种常见的类型仍然可以观察到[27,28]。

表8.8环作为立体中心组成部分的化合物的对映体的分离a,b