第六章微生物的生长及其控制

第六章微生物的生长及其控制

微生物的生长：在适宜环境条件下，微生物吸收营养物质，进行新陈代谢，有机体的各细胞组分协调而平衡地增长，为生长。

微生物的繁殖：单细胞微生物当细胞增长到一定程度时，就以二分裂等方式形成子细胞，引起个体数目的增加，为繁殖。多细胞微生物唯有通过形成无性孢子和有性孢子等使个体数目增加的过程才能称为繁殖（细胞数目的增加若不伴随着个体数目的增加，只能叫生长，不能称繁殖）。

微生物的发育：从生长到繁殖是一个从量变到质变的过程，这个过程就是发育。

个体生长个体繁殖群体生长

群体生长=个体生长+个体繁殖

第一节测定生长繁殖的方法

一、测生长量

测定生长量（原生质含量的增加）的方法很多，适用于一切微生物。

（一）直接法

1、粗放的测体积法

2、精确的称干重法

（二）间接法

1、比浊法

用分光光度计对无色的微生物悬液进行测定，不同浓度的菌悬液光密度吸收值呈线性关系。常选450～650nm波段。光束通过菌悬液时引起光的散射或吸收，从而降低透光度。

菌悬液中细胞浓度与混浊度成正比，与透光度成反比。测定菌悬液的光密度或透光度即可反映细胞的浓度。将未知细胞数的悬液与已知细胞数的悬液相比，可知前者所含细胞数。

2、生理指标法

与微生物生长量相平行的生理指标很多：

含氮量（细菌含氮量为干重的12.5%、酵母见7.5%、霉菌为6.5%,含氮量×6.25为粗蛋白含量）；

含碳、磷、DNA、RNA、ATP、DAP、几丁质、N-NAM 及产酸、产气、耗氧、粘度、产热等。

二、计繁殖数

单细胞状态的细菌和酵母菌要一一计算各个体的数目，放线菌和霉菌等丝状生长的微生物只能计算其孢子数。

（一）直接法

用血球计数板在光学显微镜下直接观察细胞并进行计数的方法。得到的数目是死、活细胞的总菌数。特殊染料可将死、活细胞区分开，可用于活菌和总菌记数。

（二）间接法

活菌计数法。活菌在液体培养基中会使其变混或在固体培养基上（内）形成菌落。常用菌落计数法。

1、平板菌落计数法

可用浇注平板或涂布平版等方法进行，适用于各种好氧菌或厌氧菌。

菌落形成单位（colony forming unit，cfu）：一定菌样中的单个微生物经培养后，形成的单菌落。根据每皿上形成的cfu数乘上稀释度即可推算出菌样的含菌数。

2、丝状真菌——霉菌生长的测定

霉菌的生长表现为菌丝的伸长和分枝，可以其菌落的直径或面积作为生长的指标。

3、厌氧菌的菌落计数

亨盖特滚管培养法。

半固体深层琼脂法——厌氧菌活菌计数。

第二节微生物的生长规律

一、微生物的个体生长和同步生长

（一）微生物的个体生长

微生物与其他个体一样，自小到大的生长过程。

（二）同步生长

1、同步培养

设法使某一群体中的所有个体细胞尽可能的都处于同样细胞生长和分裂周期中，然后通过分析此群体在各阶段的生物化学特性变化，来了解单个细胞的的相应变化规律。

2、同步生长

通过同步培养的手段使细胞群体中各个体处于分裂步调一致的生长状态。

3、获得同步生长的方法

（1）环境条件诱导法

用抗生素抑制细菌蛋白质的合成；诱导细菌芽孢发芽；光合微生物的光照、黑暗控制；短期热休克；营养物质控制等。

（2）机械筛选法

利用处于同一生长阶段细胞的体积、大小的相同性，用过滤法、密度梯度离心法、膜洗脱法收集同步生长的细胞。

★这种细胞在培养过程中，一般经2 – 3个分裂周期就会丧失其同步性。

二、单细胞微生物的典型生长曲线

生长曲线：定量描述液体培养基中微生物群体生长规律

的实验曲线。

微生物的典型生长曲线：当把少量纯种单细胞微生物接种到衡容积的液体培养基中，在适宜的条件下培养，该群体就会由小到大，发生有规律的增长。如以细胞数目的对数作纵坐标，以培养时间作横坐标，就可画出一条曲线（延滞期、指数期、稳定期和衰亡期）。

微生物的生长数率常数：每小时分裂次数（R）。

（一）延滞期（停滞期、调整期、适应期）

少量单细胞微生物接种到新鲜培养液中后，在开始培养的一段时间内，因代谢系统适应新环境的需要，细胞数目没有增加的一段时间。

1、特点

（1）R=0；

（2）细胞形态变大或增长，许多杆菌可长成丝状；

（3）细胞内的RNA尤其rRNA含量增高，原生质呈嗜碱性；

（4）合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加速，易产生各种诱导酶；

（5）对外界不良条件（Nacl溶液浓度、温度）和抗生素等理化因素反应敏感。

2、延滞期出现的原因

接种到新鲜培养液的种子细胞中，一时还缺乏分解或催化有关底物的酶或辅酶，或是缺乏充足的中间代谢物，需要有一段用于适应的时间。

3、影响延滞期长短的因素

（1）接种令：接种物或种子的生长年龄（指某一群体的生长年龄）；

（2）接种量：接种量的大小明显影响延滞期的长短。发酵工业常采用种子：发酵培养基=1：10（V/V）；

（3）培养基成分：应适当丰富，且发酵培养基成分尽

量与种子培养基的成分接近。

（二）指数期（对数期）

在生长曲线中，紧接着延滞期的一段细胞数以几何级数增长的时期。

1.指数期的特点

（1）生长速率常数R最大，细胞每分裂一次所需的时间——代时（G 世代时间、增代时间）或原生质增加一倍所需的倍增间最短；

（2）细胞进行平衡生长（菌体各部分的成分十分均匀）；

（3）酶系活跃，代谢旺盛。

2．指数期中的3个重要参数

（1）繁殖代数（n）

（2）生长速率常数（R）

（3）代时（G）

3．影响指数期微生物代时长短的因素

（1）菌种：不同菌种其代时差别极大。

（2）营养成分：同一种微生物，在营养丰富的培养基上生长时，其代时较短，反之则长。

（3）营养物浓度：营养物的浓度（浓度0.1~2.0mg/mL——2.0~8.0mg/mL时）既可影响微生物的生长速率，又可影响它的生长总量。

生长限制因子：较低浓度时可影响生长速率和菌体产量的某营养物。

（4）培养温度：温度对微生物的生长速率明显的影响。

4、实践意义

指数期的微生物具有整个群体的生理特性一致、细胞各成分平衡增长和生长速率恒定等优点，是：

（1）用作代谢、生理等研究的良好材料；

（2）是增殖噬菌体的最适宿主；

（3）是发酵工业中用种子的最佳材料。

（三）稳定期（恒定期、最高生长期）

1．特点：

（1）R=0，即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等，或正生长与负生长相等的动态平衡之中。

（2）菌体产量达到了最高点；

（3）菌体产量与营养物质的消耗间呈现出有规律的比例关系（可用生长产量常数Y——生长得率来表示）；

意义：消耗每g或mol营养物质所产生的菌体干重（g）。

（4）细胞内开始积聚糖原、异染颗粒和脂肪等内含物；

（5）芽孢杆菌一般在这时开始形成芽孢；

（6）通过复杂的次生代谢途径合成抗生素等对人类有用的各种次生代谢物（稳定期产物）。

2．稳定期到来的原因：

（1）营养物尤其是生长是限制因子耗尽；

（2）营养物的比例失调；

（3）酸、醇、毒素或H2O2等有害代谢产物的累积；

（4）pH、氧化还原势等物理化学条件越来越不适宜；等等

3．生产实践的重要指导意义

（1）对以生产菌体或菌体生长相平行的代谢产物的最佳收获期；

（2）是对维生素、碱基、氨基酸等物质进行生物测定的最佳测定时期；

（3）通过对稳定期到来原因的研究，促进了连续培养原理的提出和工艺、技术的创建。

（四）衰亡期

1．特点

（1）R＜0，微生物的个体死亡速度超过新生速度，整

个群体呈现负生长状态

（2）细胞形态发生多形化（膨大、不规则的退化形态）；

（3）有的微生物因蛋白水解酶活力的增强而发生自溶；

（4）有的微生物合成或释放对人类有益的抗生素等次生代谢物；

（5）芽孢杆菌在此期释放芽孢；等等。

2．产生衰亡期的原因

外界环境对继续生长越来越不利，从而引起细胞内的分解代谢明显超过合成代谢，继而导致大量菌体死亡。

三、微生物的连续培养（开放培养）

是相对于绘制典型生长曲线时所采用的单批培养（密闭培养）而言，为防止稳定期的到来而设计的一种培养方法。

（一）连续生长

1、单批培养与连续培养

单批培养微生物指数期后期时，一方面以一定速度流入新鲜培养基、通入无菌空气，并立即搅拌均匀；另一方面，以同样的流速不断流出培养物。

容器内的培养物达到动态平衡，其中的微生物即可长期保持在指数期的平衡生长状态和衡定的生长速率上，形成了连续培养。

2、连续培养的类型

（1）按控制方式分

1）恒浊连续培养

根据培养器内微生物的生长密度，借光电控制系统来控制培养液流速，以取得菌体高密度、生长速度恒定的微生物细胞。

2）恒化连续培养

设法使培养液的流速不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率的条件下达到连续培养。

（2）按培养器级数分

1）单级连续培养

某微生物代谢产物的产生速率与菌体生长速率平行，用单级恒浊连续发酵器进行研究与生产。

2）多级连续培养

若生产的产物与菌体生长不平行，则根据两者的产生规律，设计与其相适应的多级连续培养装置。

（二）连续发酵

将连续培养用于发酵，即为连续发酵。

SCP的生产、乙醇、乳酸、丙酮和丁醇的发酵、石油脱蜡、污水处理等应用。

四、微生物的高密度培养（高密度发酵）

（一）高密度培养

微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术。

（二）应用

用基因工程菌生产多肽类贵重药物（胰岛素、白细胞介素、干扰素、生长激素等）。

不同菌种和同种不同菌株间，达到高密度的水平差别很大。E.coli可达174~175g(湿重)/L。

（三）高密度培养的具体方法

1、选取最佳培养基成分和各成分含量

主要营养物的抑制浓度，C/N是高密度培养的基础。

2、补料

采用逐量流加的方式进行。

3、提高溶解氧的浓度

可大大提高高密度培养的水平。

4、防止有害代谢产物的产生

选用天然培养基、调整培养基的PH、调整培养温度、替换培养基成分等。

第三节影响微生物生长的主要因素影响微生物生长的外界因素很多，如：O2、温度、PH 值、水活度、渗透压、Eh、辐射、UV、电离辐射、超声波、化学药剂等。

一、温度

1、生长温度的三基点

任何微生物的生长温度有宽有窄，，可分为：最低生长温度、最适生长温度、最高生长温度。

（1）最低生长温度：一般-10—-5，极端为-30。

（2）最适生长温度（最适温度）：

嗜冷菌：＜20（一般为15）。

中温菌：20—45，室温菌约25，体温菌约37。

嗜热菌：＞45，一般约50——60。

（3）最高生长温度：一般80—95，极端为105—150。

★宽温微生物与窄温微生物。

2、最适生长温度

某菌分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度。

对同一种微生物，最适生长温度并非一切生理过程的最适温度。

如：产黄青霉的青霉素发酵

30℃25℃ 20℃25℃

0 h → 5 h → 40 h → 125 h → 165 h

二、氧气

1、微生物与氧的关系