共聚焦原理及操作

一、细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)的测定

按经典方法，以钙离子敏感的荧光探针Fura-2/AM或Fluo-3/AM来检测细胞内[Ca2+]i。Fura-2的结构类似于四羧酸的Ca2+螯合剂EGTA，能以1：1的比例特异性地与Ca2+结合，与EGTA 不同的是Fura-2可发出荧光，并且结合Ca2+后荧光特性有改变，Fura-2及其与Ca2+结合后的复合物的最大激发波长分别为380 nm和340 nm，这种变化可指示Ca2+的存在及其浓度。Fura-2为一极性很大的酸性化合物，不能进入细胞内，但在其负性基团部位结合上乙酰氧甲酯基后则成为Fura-2/AM。后者脂溶性很强，又消除了负电荷，容易通过细胞膜，随后被细胞内的非特异性酯酶水解掉分子中的酯基后又变为Fura-2，与胞浆中的游离Ca2+结合后即可被特定波长的紫外光(340 nm)激发产生荧光。并且，Fura-2与Ca2+解离容易，随着游离Ca2+的增加或减少，其荧光强度便随之变化。因此，Fura-2的荧光强度与[Ca2+]i呈比例关系，据此可以测定[Ca2+]i及其变化(Malgaroli, A., et al., 1987)。

Fluo-3/AM是继Fura-2/AM等之后研制的新一代Ca2+ 荧光指示剂，与Fura-2/AM类似，Fluo-3/AM进入细胞后，酯基被水解掉，Fluo-3与细胞内游离Ca2+ 结合，因而其荧光强度可以反映细胞内游离Ca2+ 的浓度。但优于Fura-2/AM的是，Fluo-3与Ca2+ 结合时的荧光强度较未结合Ca2+ 的游离形式高40 ~ 100倍，避免了自发荧光的干扰，因而直接在单波长激发光下检测其荧光强度即可反映[Ca2+]i的变化。此外，Fluo-3与Ca2+ 亲和力低，易解离，适合测定细胞内Ca2+ 的快速、微量变化。Fluo-3 在可见光光谱激发，激发波长为488 nm，可避免紫外光对细胞的损伤(Greimers, R., et al., 1996)。Ca2+荧光探针用于检测[Ca2+]i 的基本原理如图7.1所示。

图Ca2+荧光探针检测[Ca2+]i的基本原理

a，代表一个细胞模型；b，Ca2+荧光探针的负载；

c，Ca2+荧光探针去酯化；d，去酯化的Ca2+荧光探针与细胞质内游离Ca2+结合。

Fig. The mechanism for [Ca2+]i detection by fluorescent Ca2+ probe.

[Ca2+]i的检测方法根据文献(Pan, Z., et al., 2000)，并作适当的改进。具体过程如下：

1 Ca2+荧光探针负载

1. 以无菌D'-Hanks液清洗各处理细胞三次，加入适量的Fura-2/AM或Fluo-3/AM(终浓度为

4 μM)和Pluronic-F127(终浓度为0.05%)，避光，37℃恒温轻轻振荡，孵育4

5 min。

2. 负载后的细胞以含0.2%牛血清白蛋白的Hanks液清洗两次，Hanks液清洗一次，以充分洗去细胞外未负载的残余荧光染料。

3. 按上所述，向各实验组细胞中加入相应的孵育缓冲液，室温放置20 min，按实验设计作相应检测。

2 Ca2+荧光强度的测定

2.1 荧光双波长分光光度计测定[Ca2+]i

1. Fura-2的荧光强度测定用日立F-3000型荧光双波长分光光度计进行。测定条件为：激发光光栅5 nm，发射光光栅10 nm，测定温度为(37±1)℃。

2. 取一定量(1×106个细胞)负载Fura-2/AM的细胞悬液，加入到测量用荧光杯中，在上述测定条件下，以激发光波长300 ~ 450 nm，发射光波长500 nm进行扫描，检查荧光峰值达最高时的激发波长，判断细胞负载情况，以峰值在340 nm左右处为最佳负载状态。

3. 将测定方式转换为改变波长的时间扫描(波长变换间隔为2秒)，按以上参数执行双波长测定。

4. 测定最大荧光比值(Rmax)和最小荧光比值(Rmin)：加破膜剂Triton X-100(终浓度为0.1%)，使Fura-2和Ca2+结合达饱和时，测得的F340/F380为Rmax；加入高浓度的Ca2+螯合剂EGTA(终浓度为5 mM, pH8.5)，以充分螯合Ca2+，使Fura-2游离，测得的F340/F380为Rmin。

2.2 激光共聚焦显微镜测定[Ca2+]i

1. 对于1组实验中的细胞，直接取细胞皿置激光共聚焦显微镜的载物台上，以488 nm的氩激光激发Fluo-3产生绿色荧光，观察各皿中细胞的形态、细胞中Ca2+ 的荧光强度及分布变化，拍照。

2. 对于其他组的细胞样品，置激光共聚焦显微镜的载物台上，连续动态扫描选定细胞内Ca2+荧光强度的变化。激发波长为488 nm，发射波长为515 nm，采样频率为488 Hz, 每隔20 sec扫描一次。细胞内Ca2+ 荧光强度变化图像由随机软件进行分析处理，得到细胞内Ca2+ 变化(相对荧光强度值)的时间~ 效应曲线，再转换为时间~ [Ca2+]i曲线。

激光扫描参数在整个实验过程中不变。为保证实验结果具有良好的重现性，每实验组先后重复3次，结果重复性良好。

2.3 [Ca2+]i的计算

根据Grynkiewicz, G.等(1985)提出的经典公式计算细胞内游离Ca2+([Ca2+]i)的浓度。

Fura-2/AM检测的[Ca2+]i计算公式为：

[Ca2+]i = Kd[(R-Rmin)/(Rmax-R)](Fmin/Fmax)

其中，Kd为Fura-2与Ca2+反应的解离常数，为224 nM；R为各测定点F340/F380荧光强度比值；Rmax、Rmin分别为上述测定的最大和最小荧光比值；Fmin、Fmax分别代表Ca2+为零及饱和时，在380 nm激发光下测得的Fura-2荧光强度(F380)。实际计算由日立F-3000钙测定系统钙定量软件自动求出。

Fluo-3/AM检测的[Ca2+]i计算公式为：

[Ca2+]i = Kd[(F-Fmin)/(Fmax-F)]

其中，Kd为Fluo-3的解离常数，为400 nM；F为对样品检测得到的荧光强度值，Fmax、Fmin分别为加0.1% Triton X-100及5 mM EGTA 时测得的荧光强度值。

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单个细胞也是一样的原理：

细胞内Ca2+浓度测定需要的几个基本配套仪器：倒置荧光显微镜一台，CCD（信息采集系统，照相功能），POL YCHROME，MONOCHROMA TOR，加药系统一套，TILLVISION 处理软件一套，细胞内Ca2+结合荧光染料（我们也用FURO-2）计算机一套暗室

当单个或培养的是少数细胞时操作如下：

1.先将母液FURO-2配好（1MG/ML用荧光专用的DMSO溶解置-20度冻存备用）

2.观察正常细胞形态

3.打开所有仪器预热

4.配孵育液（取1UL加到HANKSBUFFER 1ML中使其终浓度为1UMOL/ML）

5.细胞清洗干净，然后将其放于孵育液中约半小时（可试情况加热37度）

6.清洗细胞后换上新的孵育液以备加药用，此时置于浴槽中

7.将显微镜的油镜滴上油

8.将浴槽放于显微镜上

9.先肉眼观察细胞细胞，将所要监测的细胞置于视野最中央

10.将显微镜打到SP状态，镜头打到油镜

11.打开软件，点击照相即可以观察到细胞

其他的关于PROTOCOL的设置和数据处理就不用我罗嗦了吧

整个实验的注意事项：

1.所有的只要涉及到有FURO-2的步骤都要避光，从配液到孵育和整个的实验过程都要避光孵育时可以在外面罩上锡泊纸实验时要关掉所有光源

2.荧光DMSO有毒性配置时要带手套

3.肉眼看细胞时显微镜置于眼睛状态采集数据时打到SP状态光路才通

这个没有什么难的，首先

1.激光共聚焦镜样本制备

常温下取所测细胞悬液于一次性塑料试管中。将细胞悬液进行离心,1000r/min,每次10min。反复清洗3次，吸出上清液后吹打混匀。取50μl的细胞悬液，加入17μl的Fluo-2钙探针，放入36.5℃的水浴箱中温育40min。取温育液1μl，滴片后拉片，迅速上机观察。

2.细胞内游离Ca离子浓度测定

将负载有Fluo-2的细胞滴加在载玻片上后拉片，置激光共聚焦显微镜载物台上在荧光镜下观察细胞形态及负载情况，氩激光预扫描，设置扫描条件为激发波长480nm，发射波长530nm；扫描密度：1024×1024；Pinhole1.00,物镜放大倍数40×。调节信噪比及焦聚在最佳状态时，以点扫描方式(2×6)扫描，将图像存盘，分析时重新读取。分析软件我们用的是TCS-SP2型,根据荧光强度与钙离子浓度成正比，所以用平均荧光强度代表游离钙离子浓度。要点：按此protocol操作基本上没有什么问题，一些参数可以根据实际仪器和情况作调整。

Fura－2/AM,测Ca离子浓度

一．试剂配制：

1．Hanks buffer 500ml:

NACL 4.00 g KCL 0.20 g CACL2 0.07 g MgSO4 0.10 g NA2HPO4 0.03 g KH2PO4 0.03 g GLUOSE 0.5 g PHENOL RED 0.01 g，加500 ml超纯水，

hepes 1.19g，调PH值7.4，过滤，4度冰箱保存。10mM Hepes (PH 7.4)

2．EGTA(乙二醇二乙醚二胺四乙酸)标准滴定溶液（浓度=0. 1mol/L）

配制称取3.8g乙二醇二乙醚二胺四乙酸（分子量＝３８０），置于200mL烧杯中，加约50mL水，低温加热，在不断搅拌下，滴加氢氧化钠溶液(至试剂溶解（ＰＨ值8.2，），冷却至室温。移入100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。水用纯净。

3．10%的TritonX-10

300ul TritonX-100加3ml hanks ，混匀，冷藏备用。

4. Hanks buffer+BSA的制备

Hanks buffer100ml 加100μl BSA(1g/ml)，震荡混匀。

5. 0.25mmol /L Fura－2/AM 储备液

0.5mg Fura－2/AMf粉末溶于2ml DMSO 中，分装冷藏备用。

二．实验原理

作为细胞内钙离子浓度测定的主要荧光染料有5中Quin-2，Indo-1，Fura-2，Fluo-3，Rhod-2。它们均是钙离子的螯合剂EDTA的衍生物，有较好的量子产额并队钙有较强的特异性亲合力，这些荧光染料本身不能透过细胞膜进入细胞内，将它连接一个乙酰甲酯后宁可将染料导入细胞中，经细胞内的非特异性的酯酶水解该酯键，释放出染料分子。

三．实验方法

1.细胞悬液的制备：

将细胞以1*10^6个种入皿中，24小时后加药，加药48小时后用hanks buffer 洗两次，trypsin 消化，离心（1000rp,10分钟），洗1次，将细胞悬浮于1ml Hepes缓冲的HANKS+BSA液中，细胞计数后，使终浓度为1*10^6-10^7/ml，

2.钙荧光的导入

加入0.25mmol /L Fura－2/AM 20μl ，使Fura－2/AM浓度为5μmmol /L，加入细胞悬液中，37摄氏度培养箱里温育半小时。离心，然后用Hepes缓冲的HANKS buffer，洗涤1次。使终浓度为2*106/ml，上机检测。

3．上机检测：

Fura－2的发射波长为500，激发波长（340/380），fura-2与钙结合后的最大激发波长从380nm 漂移到340。检测340、380两个波长处的值。

A.样品上机检测，

B.加入10%Tritonx-100 使终浓度是0.1%,半小时后上机检测最大值, 检测340、380两个波

长处的值。

C.加入EGTA,是终浓度是5mmol /L，1ml 加半小时后检测最小值. 检测340、380两个波长处的值。

4 细胞内钙浓度分析

上述检测到的是其相对值，要获得真正浓度要对紫蓝光分析[钙离子]i=kd （FD/FS）*（R-Rmin/Rmax-R）,R是实验观察到的荧光比值（F340/F380）,KD是fura-2与钙反应的解离常数，生理条件下KD为224nmol/L,Rmax是fura-2全部为钙饱和时的荧光比值，Rmin 是fura-2完全未结合钙时的荧光比值，FD和FS分别代表无钙和钙饱和状态下380nm处的荧光强度。

HEPES是一种缓冲剂,具有稳定PH值的作用，分子式C8H18N2O4S，分子量238.31，使用最终浓度为10mM标记细胞时，10的七次方细胞每mL，5uM fura－2，在上面的buffer中，37度30min。然后用没有fura－2的buffer，洗涤3次。上机检测。

细胞数目，可以根据实验要求调整。