激光共聚焦显微镜的原理和应用_李楠

激光共聚焦显微镜的原理和应用李　楠　王黎明　杨　军

关键词　激光;显微镜;原理和作用

中国图书资料分类法分类号　R318.51

激光共聚焦显微镜是80年代发展起来的一项划时代意义的高科技新产品,它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置,利用计算机进行图象处理,使用紫外或可见光激发荧光探针,从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象,在亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值,膜电位等生理信号及细胞形态的变化,成为形态学,分子细胞生物学,神经科学,药理学,遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。

1994年在姜泗长院士的提议下,我院引进了目前世界上档次最高,功能最全的美国M eridian公司的产品:Acas系列U ltima型和扫描速度最快的Insight型两台激光共聚焦仪。仪器自1995年5月份到货安装以来,已为我院7个科室的10个课题所应用,目前主要开展的研究内容有:(1)细胞内游离钙的实时监测;(2)细胞通讯的研究;(3)细胞形态学的研究。

1　基本原理和功能

1.1　基本原理　传统的光学显微镜使用的是场光源,标本上每一点的图象都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰;激光共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面上的每一点扫描,标本上的被照射点,在探测针孔处成像,由探测针孔后的光电倍增管(PM T)或冷电耦器件(cCCD)逐点或逐线接收,迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图象。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭

作者单位　解放军总医院实验仪器中心,北京　100853的,焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔,焦平面以外的点不会在探测针孔处成像,这样得到的共聚焦图象是标本的光学横断面,克服了普通显微镜图象模糊的缺点。

在显微镜的载物台上加一个微量步进马达,可使载物台上下步进移动,最小步进距离为的0.1L m,则细胞或组织各个横断面的图象都能清楚地显示,实现了“光学切片”的目的,这就是“细胞CT”名称的由来。

1.2　激光共聚焦显微成像仪的图像处理功能1.

2.1　“细胞CT”功能　通过狭缝扫描技术将我们对细胞的研究由多层迭加影像推进到真正的平面影像水平,使图像更加清晰,从而为分子细胞生物学的深入研究拓宽了视野。

1.2.2　三维成像与细胞内部结构图像相结合的功能　激光共聚焦显微成像仪可以将断层图像与三维重建图像有机的结合起来,不但能揭示细胞内部的结构和提供细胞的长、宽、厚、断层面积、细胞体积等参数,而且可以给人以三维立体的概念。例如:可以使细胞旋转起来从而能随意观察细胞各个侧面的表面结构。

1.2.3　将形态学、生理学与分子细胞生物学的研究相互结合　利用激光共聚集显微成像仪不但可以观察细胞形态的动态变化,而且用适当的荧光探针可以观察细胞内部的生物化学变化。如细胞内游离Ca2+、pH值及其它细胞内离子的实时测定。荧光原位杂交的杂交点观测和定量分析。

1.3　激光共聚焦显微成像仪的细胞生物学功能

1.3.1　粘附细胞分选技术　U ltima型激光共聚焦显微成像仪是目前世界上唯一能对粘附细胞进行分选的仪器,而这种不改变细胞周围培养环境,细胞铺展程度和生长状态的分选方式

是至关重要的。

1.3.2　细胞激光显微外科及光陷井技术　该仪器可将激光当作一把“光刀子”使用,完成诸如细胞膜瞬间穿孔,染色体切割,神经元突起切除等一系列细胞外科手术,也可以作光陷井操作。

1.3.3　荧光光漂白恢复技术　该技术用来测定活细胞的动力学系数。通过对活细胞的动力学系数的测定,可对细胞骨架构成、核膜结构、大分子组装和径跨膜大分子迁移率等领域进一步研究。

1.3.4　光活化技术　该技术通过笼锁与解笼锁测定,可以人为控制多种生物活性产物和其它化合物在生物代谢中发挥功能的时间和空间。

1.3.5　细胞膜流动性的测定功能　细胞膜流动性的定性和定量测定在膜的磷脂酸组成分析,药物的作用点和温度反应测定等方面有着重要的意义。

1.3.6　胞间通讯的研究　通过测量细胞缝隙连接的分子转移,研究相邻细胞间的通讯。此项研究用于监测环境毒素和药物在细胞增殖和分化中所起的作用,肿瘤启动子和生长因子对缝隙连接介导的胞间通讯的作用,以及细胞内Ca2+,pH和CAM P对缝隙连接作用的影响。

2　应　用

2.1　细胞内游离钙测定

细胞内钙作为第二信使,对细胞生长分化起着重要作用,而目前用于监测细胞内游离钙的方法少之又少,激光共聚焦仪的诞生为人们提供了一有效工具。目前已应用的课题有:临检科“不同刺激物对血小板胞内钙的应用”、内分泌科“免疫球蛋白对甲状腺细胞内钙的作用”、眼科“糖性白内障晶体上皮细胞内钙的变化”。其技术难点及处理方法如下。

2.1.1　细胞的获取　细胞内游离钙的测定需要活的生长旺盛的细胞。其来源可从细胞株培养获得,也可由动物活体直接取得。培养优良的细胞,是一件非常辛苦又花费精力的工作,但它可以确保每次都有足够多的细胞供实验使用;从动物的活体上直接取细胞,需要实验人员高超的手术技巧,能准确地摘取标本,并且尽量避免细胞的丢失和死亡。

2.1.2　细胞的染色　根据各种细胞的特性和活性,确保每次染色成功,是技术性很强的实验技术,需要一段摸索的时间。首先确定加多大浓度的钙敏荧光染料FLUO-3/A M,在CO2培养箱中孵育多长时间,是否需要加去污剂F-127助溶?这些在几次试验以后才能够确定。

2.1.3　药物对细胞内游离钙的影响　实验设计中加入药物对细胞内游离钙的刺激是上升还是下降或者根本无影响,这些在开始实验前必须心中有数,在加药过程中还需要考虑所加药物的PH值,渗透压是否合适,是否会引起细胞内钙的变化。药物对细胞内游离钙的作用是瞬间上升下降,还是钙的振动。要对出现的实验现象作出解释。

2.1.4　细胞的粘附　如果培养的是粘附细胞,那么它们会较为牢固地粘附在培养皿上或载玻片上,可是悬浮的细胞如血小板,红细胞很难贴壁。为了解决这个问题必须对载玻片进行处理。处理主要方法为使用多聚赖氨酸,蛋清,聚乙烯醇等作粘贴剂。实验者必须根据细胞特性来选取不同的处理方法。

2.2　细胞通讯

近年来细胞通讯是分子细胞生物学的研究热门。但是对于细胞缝隙间细胞通讯的研究,由于缺少检测手段,一直阻碍人们去深入探索。自激光共聚焦显微镜诞生以来,尤其是M er idian 公司的Acas系列的推出,为研究细胞通讯提供了新的手段。目前已完成的课科题有:“肾小球成纤维细胞胞间通讯影响的研究”。

实验方法为:首先观察原细胞的通讯情况,测定其恢复速率,然后在不同药物作用下,监测其通讯情况,对恢复速率做统计学处理,推断药物对细胞通讯的作用。其技术难点及处理方法为:

2.2.1　确定原细胞通讯情况　并非所有的细胞都有这种缝隙连接的通讯,例如:淋巴细胞,部分癌细胞就没有这种通讯,因此,必须预先对原细胞作用出判断。

2.2.2　细胞通讯测定结果的统计学处理　由于细胞处于不同的生长期,即使同一细胞系,其恢复速率也不完全一致。这就必须取得尽可能多的标本数据来进行统计。

2.2.3　观察细胞的选择　在一个视野里有若干个细胞。作为数据采集对象必须选择3组细胞为观察目标:(1)对照组:选孤立的单个细胞1～2个,由于此类细胞与其它细胞不相连接,因而就不会有细胞通讯的机能,适合用作对照;

(2)观察组:选相互紧密相连的细胞5～6个,这种细胞间存在通讯,可作为测试对象;(3)校正组:选相互紧密相连的细胞1～2个,不用激光去淬灭,用于作空白校正,这是因为细胞在激光照射下,其荧光强度会产生自然漂白,为消除这种因素影响,必须对背景进行校正。

2.3　细胞形态学研究　细胞形态测量是激光共聚焦显微镜最广泛的用途之一,这些测试的技术难点在于如何选择荧光探针标记,如何获取样品,样品的处理方法及染色方法。如:“肾小管上皮细胞对成纤维细胞表达的粘附因子的影响”。

3　工作设想

总结Confocal在我院的应用情况,考虑今后我们的工作重点主要有3个方面。

3.1　积极与临床各科研配合,做好技术保障工作。

3.2　加强仪器功能的开发和方法学的研究。U LTIM A型是功能很强大,技术很复杂的科研仪器,目前我们只开发出很小一部分功能,今后将在这方面组织人力物力进行研究和探索。例如,在细胞形态学方面的研究和分子细胞生物学方面的研究。

3.3　样品前处理技术的提高。Confocal是精密科研仪器,对样品的质量要求极高。目前工作难以开展的原因很重要一点是由于样品处理(包括细胞培养,染色等)达不到仪器所要求的技术水平。

激光共聚焦显微镜作为我院投资最大的科研仪器之一,为我院科研水平的提高,提供了崭新的,强有力的技术手段。我们将和各科同志共同努力,使其在“九五”期间发挥更大的作用。

(1996-01-30收稿,1996-02-13修回)

(上接226页)

服20余剂,诸症渐消。不意月经来潮,量中色黯,夹有黑色血块,历时4d而净,乳胀、小腹坠胀也随之消失。停用降压药,血压亦能稳定在正常范围。阴火既降,遂改予益肾健脾,调畅气血治疗。随访3月,月事如常。

2　讨论　夫阴阳之机,清者属阳,浊者属阴。清阳贵升,浊阴宜降。清阳不升则浊阴不降,中气下陷则阴火上乘,即所谓“阴火乘其土位”。清浊相干,则诸症丛生而变化万端。众所周知,补中益气汤乃东垣所创之名方,具补中益气,升阳举陷,升清降浊之功效,用之临床奥妙无穷。对该患者应用此方乃病情所需,月事久闭而不治自通实属意外。然仔细斟酌,亦自有其内在之理。经曰“冲为血海,任主胞胎”,又云“任脉通,太冲脉盛,月事以时下”。正常的月事和胎孕有赖于冲、任二脉的充盛与畅通。如任脉不通,太冲脉衰,则月事为之变,经闭而无子。该患者年届六七有余,太冲渐衰;中气下陷,清阳不升,陷于胞宫;心情不舒,气血不畅,气滞血瘀,阻于胞宫;诸因相用,清浊相干,清者不升,浊者不降,任脉阻滞,月事为之闭阻不通。而取东垣补中益气汤为主,益元气,健脾运,升清阳,泻阴火,辅以川楝子、赤芍、丹参、东前草等行气活血、清利下焦,理贯而药合,清阳得升,浊阴百降,阴阳调和,太冲充盛,任脉通达,诸症自愈而月事自通。

(1996-05-08收稿,1996-06-11修回)