生态毒理学中生物标志物研究进展

038　生态毒理学中生物标志物研究进展

万　斌

(中国预防医学科学院环境卫生与卫生工程研究所,北京　100050)

摘要:　生物标志物是生物体受到严重损害之前,在分子、细胞、个体或种群水平上因受环境污染物影响而产生异常变化的信号指标。对它的检测可为严重毒性伤害提供早期警报,因此受到国内外学者普遍关注。本文对生态毒理学领域中生物标志物的特性及其在行为、生理、生化方面的研究进展加以综述。关键词:　生物标志物;生态毒理学;生物标志物检测

中图分类号:　X 17115 文献标识码:　A 文章编号:　100121226(2000)022********

审校者:修瑞琴

收稿日期:1999205207;修回日期:1999209227

美国国家科学院生物标志物委员会于1987年对生物标志物(b i om arker )进行了系统论述[1]。目前,生物标志物已被许多学科发展运用,越来越受到人们关注。生态毒理学领域中,生物标志物也占有重要位置,其概念和检测研究均有所扩展,本文对这方面的研究情况进行了综述。

1　生态毒理学中的生物标志物

在美国国家环保局发表的有关生物标志

物的报告中,将生物标志物概括为:穿过机体屏障并进入人类组织或体液的环境污染物或其产生的生物效应。对它们的检测结果可作为生物体暴露、效应及易感性的指示物[2]。90年代初,D ep ledge 和Fo ssi 等[3,4]曾先后提出生态毒理范畴的生物标志物,认为生物标志物是生物体组织或体液样品中或在个体水平上所能检测到的生化、细胞、生理或行为变化,这种变化可阐明生物体暴露和产生生物效应的信息。Gok soyr 等[5]认为这些生物标志物系统是生物体暴露于亚致死剂量下的有毒化合物而发生异常变化的信号指标,这种指标不仅可为环境质量退化提供早期警报,而且可以特异性地检测到环境中致癌、致畸、致突变化合物的生物可利用性。

环境污染物首先必须进入生物体,到达靶位点后,才可能产生生物学变化。广义上说,从暴露到效应产生,其间的级联生物效应都可用适当的生物标志物进行检测,这些生物反应从分子相互作用到细胞损伤及至整个生物体的毒性显现都反映了生物系统与环境因子的相互作用,这些作用可发生在分子、细胞及个体水平上,使生物体产生功能、生理、生化变化。如果这些生物反应先于严重的结构损害,标志物就有助于确定生物体所处的污染状态及其潜在危害,为严重毒性伤害提供早期警报。2　生物标志物的特性

确定一个与各毒性终点相关的实用标志物需多学科的合作研究。污染导致的最初反应是从分子相互作用开始的,因此,基于分子机制的标志物研究也是十分必要的[6]。使用与毒性相关的标志物可加速环境污染危险评价进程,增大其可靠性。

一种标志物应能敏感有效地反映出生物体发生严重损伤之前的生物变化。在用动物模型研究低浓度污染物效应时,选择敏感的标志物尤为重要。有人曾用处于胚胎或幼体时期的生物体来检测生物的生理变化,如

En senbach 等[7]

发现斑马鱼在胚胎仔鱼阶

段,生长、发育和存活率对有机污染十分敏感,很低浓度的3,42二氯苯胺(40m g L )

高丙体六六六(2Λg L)的混合暴露即可明显减缓仔鱼的生长发育,80Λg L的林丹可降低仔鱼的存活率。

标志物要在生态系统现状研究中广泛运用,还应对一类污染而非针对某一种污染产生反应[5]。特异性标志物可反映特定污染物的不良效应,有助于建立暴露2效应关系。在混合暴露时,高特异性标志物可用以确定污染物的化学性质[8]。但非特异性标志物也可提供环境暴露的有关信息[9]。在实际应用中,所发生的标志物反应还应有一段稳定时间,而不是瞬间反应,从而可稳定地加以检测,同时要快速、技术易于掌握[9,10]。但一种标志物常难以同时具备这些特性。意大利V igana 等[11]提出同时用几种标志物进行检测,以减少结果的模糊性和误导性。在标志物选取时还应选择在标志物检测时对受试生物损害较小的标志物指标,称为非破坏性标志物[4,8,9]。

3　生物标志物检测

生物标志物是与环境污染的生物检测密不可分的,它是一种有效、前景广阔的环境危险评价工具。目前研究热点有行为、生理、生化等标志物。

311　行为标志物

行为标志物的检测可反映发生在较低生物水平(细胞或分子水平)所产生的综合效应。包括四种主要杀虫剂在内的许多毒物都可导致神经毒性,亚致死剂量下生物神经系统的生化变化将直接影响生物体的正常行为[9,12]。若行为的变化影响了生物的繁殖、行动、捕食、回避等行为,则将对生物的生长、发育乃至存活产生不利影响,从而间接导致种群水平的变化。如:美国的B ridges[13]研究发现315m g L西维因可降低蝌蚪90%的行动能力,且其冲刺游动速度和距离也显著降低,捕食能力、逃避天敌的能力受到影响。从而其生长率及适应环境的能力大大降低。有人报道用鱼的栖息地选择行为或游动行为来检测腐殖质变化对鱼的影响[14]。大型氵蚤(D ap hn ia

m ag na)由于具有敏感等优越性,也已用于行为测试。Hoof等[15]概述了大型氵蚤行为测试,包括趋光性分析和运动分析。此外还有用牡蛎壳运动反应,发光菌、藻尖荧光等进行标志物研究的报道。

近来,行为标志物检测已采用计算机辅

助生物测试系统。有人用这套系统研究了重

金属对一种海滩蟹(Ca rcirus m aenas)的行为影响,检测其活动时间、平移速度、运动距离等指标,但重金属暴露的行为变化指标的敏感性和特异性仍有待验证[3]。行为标志物检测的一大优点是对生物不产生损害。

312　生理标志物

生理标志物包括一些特异的生理反应终

点,如免疫学反应,也包括普通的生理现象,

如生长、繁殖、发育等。确认污染诱导的生理

变化首先要了解测试生物的正常生理状态。

近年技术发展已使人们可同时监测多个生物

体的生理指标。D ep ledge[3]曾报道同时监测

多个甲壳类动物的心脏活动,对其正常生理

活动和变化进行较全面、深入研究。这些监测

系统也可用于检测捕食率、尿量、粪量、生长

率等。对水生生物进行的连续检测有血循环、

分泌、渗透压调节、生长、繁殖等。有的生理指

标既是生理参数又是行为参数。如鱼的换气

行为是与耗氧率密切相关的,鱼鳃组织是首

先接触污染物的组织,故会产生明显生理变

化,影响鱼的呼吸,同时伴随相应行为变

化[12,15]。这些生理指标都涉及多个组织或系

统,对它们的损害将导致生存活力下降。31211　生长余能检测

生长余能(scope fo r grow th,SFG)是对生物能量状态的综合测试,它基于的理论是:生物体在保证正常状态所消耗的能量之外,剩余能将用于生长、发育和繁殖。生物体暴露于环境污染物时,其防御机制消耗能量,这样将减少用于生长、发育、繁殖的能量。从整个生态系统来看,这将对个体生物乃至整个种群产生不利影响[9]。Sm aal等[16]通过研究双

壳类的SFG指标,认为它是生物检测的敏感标志物。还有报道认为对暴露生物生长的直接测定(如:体长、体重)及对能量贮备的间接测定(如:甘油三酯 总脂)都是较为可靠的生物标志物。B en ton等[1]测得一种鳉鱼(S a ilf in m olly)的体重增加百分比、脂类百分比、甘油三酯百分比等与DD T(o,p′2 DD T)的浓度呈负相关。尽管有许多研究成功地用RNA DNA为暴露指标,但大多情况下,对水生无脊椎动物是不适用的,而且对不同鱼类,其敏感性也不同[18]。对水生无脊椎动物来说,直接热量测定(如热损耗率)可反映细胞修复机制、生理性适应的后果,这种方法既可检测生物毒性效应,也可揭示毒物的代谢特征[19]。SFG检测的不足之处在于它忽略了污染物对能量利用率的影响,而且其假设的剩余能量全部用于生长、繁殖,仍有待证明。

31212　免疫毒理学标志物检测

水生生态毒理学的免疫标志物研究主要以鱼类为测试生物。鱼的特异性免疫反应包括T细胞和B细胞介导的免疫反应。

E lgendy等[20]曾利用尼罗罗非鱼(T ilap a n ilotica)的脾细胞增殖反应来评价有机磷化合物诱导的细胞免疫反应,发现免疫反应的抑制程度与污染(克瘟散和草甘磷)的浓度相关,血清抗体效价也随暴露不断下降。非特异性免疫反应则涉及细胞的防御机制,其中巨噬细胞功能测试有:趋化性、核噬作用、胞饮作用等。W ester等[21]论述了鱼类免疫毒理学标志物有:①结构性参数,如:细胞数、组织重量、形态、血清蛋白等。②免疫调节功能参数,如:对疾病的易感性。并指出有一些免疫参数有望成为有效的实用标志物。目前,免疫毒理学标志物的进一步确立和完善仍需对免疫机制进行深入探索。

31213　组织病理标志物

近年来,许多学者开始采用组织病理方法进行标志物检测。Hon rub ia[22]研究了抗蚜威(01002%,01014%)导致的一种蝌蚪

(R ana p erez i)的组织病理变化(包括鳃、肝、胆囊、心脏及脊索)和死亡率变化,发现存在直接的剂量2效应关系。组织病理变化一般不受生物体自身状态及正常环境影响(如季节变化、性别、年龄等),而大多与污染物或不良环境条件有关。

313　生化标志物

生化标志物是生物体中最早可测得的污染物诱导反应,因而可为更高生物水平可能产生的损害提供信息[11,23]。生化变化常涉及蛋白水平的变化、酶活性改变或DNA分子的变化。

应激蛋白是环境压力促使特定基因表达的产物,包括H SP(热休克蛋白)家族及相关蛋白(如葡糖调节蛋白),它是细胞保护机制的重要部分。污染物可诱导H SP60和H SP70浓度上升,通过对它们的测定可定量地检测环境污染物的不良生物效应,而且对H SP60和H SP70积累的检测有利于大范围调查监测的回顾性研究[24]。应激蛋白受到生物种类、年龄及外界环境影响,其产生是一种低剂量效应,可说明生物体及其所在生态系统的一般状态。对污染物和环境因子(冷、热)诱导的H SP70蛋白水平的检测可用H SP70广谱抗体通过W estern b lo tting进行[25]。Goering[23]还总结了用c DNA探针技术、代谢标记、蛋白染色等技术来检测生物体内应激蛋白的表达水平。

与细胞色素P450相关的混合功能氧化酶(M FO)系统已广泛用于污染物的标志物检测。P450活性对有机污染(如PA H s,PCB s 等)极为敏感,且许多有机物代谢早期都由M FO介导[20]。M FO活性不仅可在肝脏中和皮肤活组织中检测,也可通过检测转基因细胞株中P4501A1基因表达报告基因来评价污染物诱导的M FO系统成分活性[26,27]。M FO系统成分中的常用指标有羟乙基试卤灵2O2脱乙基酶(EROD)及芳香烃羟化酶(A HH)、氨基比林2N2脱甲基酶(A PDM)、尿苷二磷酸葡糖转移酶()

细胞色素还原酶、细胞色素b5、总细胞色素等。有报道EROD活性与有机污染并非呈简单线性关系,至少在比目鱼(P.f lesus)中是如此[5]。此外,加单氧酶活性变化也可以作为污染物检测的生物标志物[28,30]。

Co ssu等[31]发现抗氧化机制中,硒依赖型谷胱甘肽过氧化物酶(Se2GPx)、谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽均是污染物毒性的良好标志物。但在意大利Po河中却发现这些指标并不能明显反映鱼类所处的污染状态[11]。Gok soyr[5]也发现在比目鱼肝脏中GST并未产生污染物诱导的标志物反应。而有人报道牡蛎(M y tilus g a llp rou incia lis)中GPx活性与组织中污染物水平相关[26]。因此,对这些抗氧化酶在不同污染、不同测试生物中的反应差异有待深入研究。另外,超氧化物歧化酶和金属硫蛋白也被认为是重金属或有机污染的标志物,且有报道金属硫蛋白可随暴露顺序和成分不同而变化,因此可反映暴露情况[5]。

乙酰胆碱酯酶这一对特定类毒物敏感的标志物也可受到另一些物质的影响,如某些金属和M FO诱变剂等。研究证明除有机磷农药外,包括氯化烃在内的污染物也可抑制鳟鱼和比目鱼肌肉的乙酰胆碱酯酶活性,且伴随M FO酶系活性诱导[29]。

另一类分子生物标志物是DNA分子的诱导变异。有关遗传毒理标志物检测与毒性效应之间的关系尚不清楚,对水生无脊椎动物研究也很有限。目前主要标志物检测有:姊妹染色单体互换(SCE),染色体异常(CA)及微核(M N)等,其中微核被认为是水生生物检测诱变效应的有用标志物[32]。

在标志物研究中,常根据实际目的和要求采取多终点分析,以获得更多生物信息,其终点检测结果在污染物之间以及单体生物之间也更有可比性[33]。

4　结语

生物标志物检测能提供有毒化学污染物环境生物效应的信息,对生态毒理研究和环境危险评价具有重要意义。标志物早期检测可使人们采取措施预防或缓解污染物危害,因此加强生物标志物在生态危险性评价中的作用,充分发挥其预警优势是十分必要的。自然环境系统十分复杂,生物体常暴露于混合污染中,故实验室条件下联合毒性及长效应研究应受关注。同时仍需注意标志物研究的生态相关性应尽可能反映实际环境暴露情况。

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