分子生物学实验

分子生物学实验

注意:分子生物学实验共3个，一周内完成。

1-26号第6周做实验，27-52号第8周做实验。

实验一:周三下午，具体时间待定。(13:00开始，或14:30开始。若16:30开始，请先吃晚餐)

实验二、三:周四上午10:00开始(预计34，56，78节)

做实验之前请先做好预习，并写好预习疑问

实验一实验药品试剂配制、酵母菌培养

一、目的

1(学会基因组DNA提取常用的几种药剂的配制。

2(学会酵母菌的活化及培养过程。

二、原理

三、实验器材

电热重蒸水器;手提式高压灭菌锅、座式自动电热压力蒸汽灭菌器;电子天平;

离心机;酸度计;恒温振荡摇床;移液器;容量瓶

四、实验试剂

酵母提取物，蛋白胨，葡萄糖，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，氯化钠，氯化镁，Triton X-100，SDS(十二烷基硫酸钠)，Tris(三羟甲基氨基甲烷)，盐酸，冰醋酸，硼酸，EDTA(乙二胺四乙酸)，醋酸钾，酚，氯仿，异戊醇，醋酸钠，RNaseA 。

五、操作

(一)酿酒酵母的培养

1(YPD液体培养基的配制:

准确称取酵母提取物5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，加热溶解于450ml ddHO 后，用2ddHO定容至500ml。分装于两个250ml三角瓶，每瓶200ml。116?高压灭菌20min。 2

2. 酿酒酵母的活化及培养。

在超净工作台中，从保存的酿酒酵母菌株INVSc1中挑取单菌落，转入5mlYPD

培养基30?摇菌24hr;按1:10的比例转接入新鲜灭菌的YPD培养基中30?摇菌12hr;按1:10的比例重复转接培养一次;按1:200的比例转接入新鲜灭菌的YPD培养基中30?摇菌 14hr左右，当OD值在0.4,0.6之间时为成功活化。在OD600在0.4,0.6之间时，停止培养，600

及时离心收集或者放入4?冰箱保存。

(二)几种常用药剂的配制

1. PBS(0.01mol/L，pH7.0):

称取NaCl 0.8g，KCl 0.02g，NaHPO 0.144g，KHPO 0.024g，溶解于80ml ddHO中，24242用HCl调节至pH7.0，用ddHO定容至100ml。分装后121?高压灭

菌20min，室温保存。 2

2. 1mol/L NaHPO: 24

称取NaHPO?12HO 3.5814g，或者NaHPO?7HO 2.6814g用ddHO定容至10ml。24224223. 1mol/L NaHPO: 24

称取NaHPO?2HO 1.5601g用ddHO定容至10ml。 2422

4. 磷酸缓冲液(1mol/L ，pH7.4 ):

量取1mol/L NaHPO7.74ml，1mol/L NaHPO2.26ml，混合后，用ddHO定容至

100ml。 24 24 25. 1mol/L MgCl : 2

称取4.7605g MgCl，用ddHO定容至50ml，用0.22微米细菌滤膜过滤。 2 2

6. 蜗牛酶缓冲液(20mg/ml，0.1 mol/L ，pH

7.4磷酸缓冲液，0.25 mol/L ，MgCl ): 2

称取蜗牛酶干粉 200mg

磷酸缓冲液(1mol/L ，pH7.4 ) 1ml

1mol/L MgCl 2.5ml 2

用ddHO定容至10ml。 2

7. 1%SDS裂解液(2% Triton X-100，1%SDS，0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl pH8.0，

1mmol/L EDTA):

量取Triton X-100 200μl

10%SDS 1ml

0.02mol/L Tris-HCl(pH8.0) 5ml

0.5mol/L EDTA(pH8.0) 20μl

称取NaCl 0.0584g

混合，用ddHO定容至10ml，用0.22微米的细菌滤膜过滤除菌，室温存放。 2

8. 10%SDS:称取SDS 1g，用ddHO定容至10ml。 2

9. 0.02mol/L Tris-HCl(pH8.0):

量取 0.1 mol/L Tris碱溶液 20ml

0.1 mol/L HCl溶液 11.68ml

混合，用ddHO定容至100ml。 2

10. 0.1 mol/L Tris碱溶液:称取Tris 1.2114g，用ddHO定容至100ml。 211.

0.1 mol/L HCl溶液:称取HCl 3.646g，用ddHO定容至1000ml。 2

12. 0.5mol/L EDTA(pH8.0):称取18.61g EDTA-Na?2HO，加入80ml ddHO中，剧烈搅22拌，用NaOH调节pH至8.0，用ddHO定容至100ml，分装后高压灭菌。2

13. 5mol/L Kac (pH8.9):称取 24.535g Kac，溶于40ml ddHO中，用冰醋酸，或者NaOH2调节pH至8.9，用ddHO定容至50ml，分装后高压灭菌。 2

14. 乙醇

15. 75%乙醇

16. TE缓冲液:(10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0))

量取0.02mol/L Tris-HCl(pH8.0) 5ml，

0.5mol/L EDTA(pH8.0) 20μl，

用ddHO定容至10ml，高压灭菌后贮存于4?C冰箱。 2

17. RNaseA:

18. 酚:氯仿:异戊醇(体积比25:24:1)

19. 3mol/L NaAc (pH5.2):NaAc?3HO 40.18g，或者NaAc 24.609g，加dd HO 50ml，22用冰醋酸调节pH值至5.2，用ddHO定容至100ml，分装后高压灭菌，贮存于4?冰箱。 2

20. 5TBE缓冲液:称取Tris 54g，硼酸 27.5g，0.5mol/L EDTA(pH8.0)

20mL，用ddHO2定容至1000ml。

六、注意事项

1. 正确使用各种仪器设备。

2. YPD培养基灭菌温度不能过高。

实验二酵母染色体DNA的制备

一、目的

掌握酿酒酵母染色体DNA提取方法。

二、原理

酵母是一种易于培养的典型单细胞真核生物，有“真核生物中的大肠杆菌”之美称。单倍体酵母细胞基因组为15Mb，含16条大小约为200,2200kb的线性染色体。酵母不仅含有高等真核生物细胞中的膜性亚细胞器，而且还有细胞骨架的结构。酵母DNA只存在于核内，尽管无组蛋白H1，但染色体DNA的核小体结构与高等真核生物仍十分相似。酵母的良好的遗传背景，为进行真核生物的基因操作提供了有效的研究工具，并积累了大量的研究经验。

酵母菌的培养不但简单经济，而且快捷高效，在营养丰富的培养基中，大约

90min的时间即可增殖一代。酵母DNA通常与蛋白质及部分RNA结合成染色体形式存在，因此分离核酸首先破碎细胞，然后采用各种方法将蛋白质、糖类、脂类和盐类等物质除去以纯化DNA。在提取过程中，要保证DNA不被内源或外界污染的DNAase降解，以保持DNA的完整性，并要排除其他分子的污染，以获得高纯度的DNA。

三、实验器材

1. 台式低高温高速离心机;

2. 电泳仪;

3. 恒温摇床;

4. 涡旋仪;

5. 恒温水浴锅

6. 冰箱;

7. 灭菌锅;

8. 电炉;

9. 三角瓶;10. 试管

四、实验试剂

1. YPD培养基，见实验一。

2. Ura缺陷型的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeINVSc1)酿酒酵母菌株INVSc1。

3. RNase A 10mg/ml。 (-20?保存)

4. PBS(0.01mol/L，pH7.0)

5. 蜗牛酶缓冲液(20mg/ml)

6. 1%SDS裂解液

7. 5mol/L Kac (pH8.9)

8. 乙醇

9. TE缓冲液

10. 酚:氯仿:异戊醇(体积比25:24:1)

11. 3mol/L NaAc (pH5.2)

12. 75%乙醇

五、操作

1. 用1.5ml离心管，分次收集2-3ml菌液，12000rpm，离心2min，弃去上

清，收集沉淀。 2. 在沉淀中加入500μl PBS(0.01mol/L，pH7.0)，用移液器吹

打重悬沉淀，12000rpm，离心2min，弃去上清。

3. 重复第2步。

4. 在沉淀中加入100μl 蜗牛酶缓冲液(20mg/ml)，45?C作用2hr。

5. 加入100μl 1%SDS裂解液，-20?C冷冻，室温振荡溶解，反复3次。

6. 向悬浮液中加入150μl 5mol/L Kac (pH8.9)，轻轻颠倒离心管混匀，10000rpm，离心5min，吸取上清到一新的1.5ml 离心管中。

7. 加入上清2倍体积的乙醇，颠倒离心管轻轻混匀，室温放置5min，

12000rpm，离心10min，弃去上清，收集沉淀。

8. 加100μl TE缓冲液，溶解沉淀。再加6μl RNaseA，37?C温浴30min。 9. 加入等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，颠倒混匀，12000rpm，离心10min，吸取

上层水相到一新的1.5ml 离心管中。

10. 上清，重复第9步骤。

11. 加入1/10体积的3mol/L NaAc (pH5.2)，2.5倍体积乙醇，沉淀DNA。 12. 12000rpm，离心2min，弃去上清。

13. 加入500μl 75%乙醇，洗涤沉淀。重复一次。

14. 打开离心管盖子，干燥。

15. 加入20μl dd HO溶解DNA。 2

六、注意事项

1. 混匀一定要温和，否则DNA大分子将被打断，而部分降解。

2. YPD培养基灭菌的时间不能过长，否则，葡萄糖会焦糖化。灭菌后如培养基颜色变成焦糖色则要重新配制。

七、思考题

1. 为什么人们把酵母作为真核生物研究的重要模式生物,

2. 从原理来看，核酸提取可分为哪几个步骤,

3. 如何粗略测定DNA浓度,

实验三琼脂糖凝胶电泳

一、目的

1. 掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理。

2. 学习并掌握使用水平式电泳仪的方法。

二、原理

琼脂糖凝胶电泳是重组DNA研究中常用的技术，可用于分离，鉴定和纯化DNA 片段。不同大小、不同形状和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下(如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等)，有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。凝胶中的DNA可与荧光染料溴化乙锭(EB)结合，在紫外灯下可看到荧光条带，籍此可分析实验结果。

三、实验器材

1. 琼脂糖凝胶电泳系统;

2. 紫外透射观测仪;

3. 电炉或微波炉;

4. 250ml三角瓶

5. 微量移液取样器 (枪头);

6. 灭菌锅

四、实验试剂

1. 琼脂糖

2. 6×加样缓冲液:0.25%溴酚蓝、40%蔗糖

3. DNA分子量标准(,DNA HindIII:23130，9420，6560，4360，2320，2030，560，130 bp)

4. 0.5 × TBE电泳缓冲液:45 mmol/L Tris?硼酸;1 mmol/L EDTA(pH8.0)

5. 0.8%琼脂糖:0.8g琼脂糖用100ml 0.5 × TBE沸水浴溶解

6. 0.5μg/μl溴化乙锭溶液

7. 无菌dd HO 2

五、操作

1. 称取0.8g琼脂糖粉，放入三角瓶，加入100ml 0.5×TBE电泳缓冲液，瓶口上倒扣一个小烧杯或小平皿，将该三角瓶置于微波炉或电炉加热直至琼脂溶解。注意观察三角瓶中的琼脂糖粉末，待完全熔化后停止微波炉或电炉(切不可让胶溶液溢出到微波炉或电炉中～)。

2. 戴上线手套，从微波炉或电炉上取出三角瓶，置桌面上冷却致不烫手(约

50-60:C)。 3. 胶板的制备:将有机玻璃内槽洗净、晾干，放入制胶模具中，并在固定位置插上梳子。将冷却至60?左右的琼脂糖凝胶液轻轻摇匀，小心地倒在有机玻璃内槽上，使胶液缓慢展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置30 min左右，凝固完全后，轻轻拔出梳子，这时在胶板上即形成相互隔开的上样孔。将用手指捏住铺好胶的有机玻璃内槽两侧的高边缘，取出模具和凝胶放入电泳槽中间的平台上，凝胶要没入0.5，TBE电泳液中。电泳缓冲液液面要高于凝胶1mm。凝胶上有样品孔的一侧要朝向电泳槽的负极。 4. 加样: 剪1片封口膜或塑料膜，点2,l 6，加样缓冲液，再加入8,L酵母染色体DNA(实验一获得)制成10,l DNA样品。用10,l的吸液头分别将管中的样品加入凝胶的加样孔中(如果需要时，在相邻的加样孔中加入1.5,3,l DNA分子量标准物)。加样时持移液器的手以肘部固定在桌上，用另一只手扶住持移液器手的手腕，以减少移液器的抖动。看

到蓝色的样品吸管尖头伸进加样孔后(不能伸得太深，以免穿破凝胶的底部)缓缓将蓝色的样品压入加样孔中，切不可使蓝色样品流到孔外。每加完一个样品，换一个加样头。 5. 电泳:加完样后的凝胶板可以通电进行电泳。根据电泳槽的长度把电泳仪的电压调至80-100V(5V/cm)电压或35mA下电泳。打开电源开关，样品将形成一条蓝色的横带向前移动(如果发现蓝色向后移动，立即关闭电源，调换电极)。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1 cm处时，停止电泳。

6. 染色、观察和拍照将电泳完成后的凝胶浸在含有溴化乙啶(终浓度为

0.5μg,mL)溶液中，染色约20min，在紫外灯(254 nm或302 nm波长)下观察染色后的凝胶。DNA存在处显示出红色的荧光条带。

六、注意事项

1. 实验前把移液器吸头装入相应的吸头盒高温灭菌。

2. 在低电压条件下，线形DNA片段的迁移速度与电压成比例关系。但在电场强度增加时，不同相对分子质量的DNA片段泳动度的增加是有差别的。随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围会随之减小。为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5 V,cm。电泳温度视需要而定，对大分子DNA的分离以低温为好，也可在室温下进行。在琼脂糖凝胶浓度低于0.5,时，由于胶太稀，最好在4?进行电泳。

3. 在自外透射观测仪观察凝胶时，应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免眼睛遭受强紫外光损伤。

4. EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。染有EB的凝胶要放到专用的垃圾袋中作专门处理，以免污染环境。

七、思考题

1. 溴酚蓝的迁移率相当于多少bp的DNA?