浅谈性别控制技术

浅谈性别控制技术

摘要：家畜性别的控制与鉴定技术在畜牧业中的作用越来越重要。本文主要介绍了家畜性别控制技术的一些方法的原理、理论基础和基本方法，并进一步讨论了性别控制技术的研究进展、应用情况、存在的问题及发展前景。

关键词：性别控制、精子分离、胚胎性别鉴定

Abstract: Sex control and livestock identification technology in the increasingly important role in animal husbandry. This paper describes the animal control some of the ways gender principles, theory and basic methods, and further discussion of gender control technology research, applications, problems and prospects.

Key words: Sex Control，Sperm separation，Embryo sexing

动物的性别控制技术是通过对动物的正常生殖过程进行人为干预,使成年雌性动物产出人们期望性别后代的一门生物技术，它能显著提高家畜的繁殖效率，一直是生物科学领域的一项重要课题。

1 性别控制技术的意义

性别控制在畜牧业中具有重要的生产意义。第一，在经济方面，通过充分发挥优势性别作用以大大提高经济效益，如运用此技术提高大量雌性个体如奶牛、母鸡的数量，同时节约雄性个体在繁殖年度的饲料消耗，相反亦可通过此技术控制多产雄性肉牛、肉鸡、绵羊和猪等具有增重快、肉质优等特点的雄性后代。第二，在育种方面，通过性别控制可以增加选择家畜遗传和表型性别的强度,消灭不理想的隐性性状，加快家畜的遗传进展、畜群的更新。此外，随着分子遗传学和发育生物学以及其他相关科学的发展,性别控制技术将成为胚胎工程中的一项配套技术, 它对各项生物技术的发展和应用都具有重要的促进作用。

2 性别决定的研究

2.1 遗传机制

早在本世纪初,科学家就获知哺乳动物的雌、雄两性各具有不同的性染色体,

雄性具有X和Y各1条性染色体,雌性具有2条X性染色体。本世纪50年代末，对动物性别决定的研究有了较大突破。多篇研究证明鼠和人的雄性性别是由Y染色体决定的，并证明哺乳动物的Y染色体上有一个性别的遗传控制因子，称睾丸决定因子(test is-determining facter , TDF)，小鼠以Tdy(testis-det ermining Y chromo some) 表示，后由Jacobs等通过实验证明性别是由Y染色体短臂所决定。。

区的Sinclar 等、Cubbay 等分别在人和小鼠的研究中证实睾丸决定基因位于1A

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60kb区内,人在距短臂末端的35kb处,而小鼠则在14kb内发现了一个单拷贝基因,将其称为SRY( sex determining region of the Y),在小鼠上称Sry。它是由一个250bp左右,编码主结构由80个氨基酸的单拷贝基因所组成，并具有高度的保守性和特异性。在其他哺乳动物亦含有此区域。虽然不同动物的片段位置、结构和长短各不相同, 但该基因的DNA 序列在哺乳动物中却具有极高的同源性。后经Koopman证实SRY基因为哺乳动物的性别决定基因,也证实了SRY(Sry)基因即为睾丸决定因子。

2.2 发育学机制

家畜胚胎发育的早期阶段为性别未分化期，仅有位于中肾内缘的性腺原基，这种未分化的性腺中胚层处于中性。家畜性别决定是通过性腺分化和性表型来实现的。胚胎生殖腺的发育类型是性别形成的决定物质。当生殖腺原基被某种信息诱导发育为卵巢，由卵巢产生的雌激素则使苗勒氏管（Mullerian duct, MD）发育为阴道、子宫和输卵管；如果性腺原基发育为睾丸，其间质细胞分泌睾酮，支持细胞分泌抗苗勒氏管因子（Anti-mullerian duct factors，AMDF），诱导中肾管发育成附睾、输精管和精泡等内生殖器。生殖道中生殖腺分布和发育的异常，将导致不同程度的雌雄同性。

3性别控制技术的发展情况

性别控制是一项历史悠久而又朝气蓬勃的生物技术，早在2500年前，古希腊的德谟克利特就提出通过控制一侧睾丸来控制后代性别比例的设想，反映了人类对这一技术的渴望。性别控制技术与性别决定理论的发展密不可分。在20世纪随着孟德尔遗传理论的重新建立，人们提出性别由染色体决定的理论。1923 年Painter 证实了人类X和Y染色体的存在，指出卵子与X精子结合，后代为雌性，与Y 精子结合，后代为雄性。1925 年Lush 试图根据携带X染色体和Y染色体精子

密度有差异的原理用离心法分离兔的X和Y精子。1989年Johnson等人首先报道根据X和Y精子DNA 含量的差异用流动细胞检索仪成功地分离兔子活的X和Y精子，并用分离的精子授精产下了后代，这时X和Y精子的分离研究取得了突破性和实质性的进展。同年Herr等首先成功应用PCR技术鉴定了牛羊胚胎性别。国内外的专家学者相继用此技术, 通过扩增胚胎的性别决定基因(SRY)鉴定胚胎性别, 产犊结果表明准确率达到95%—100%。伴随着人工授精和胚胎移植技术的发展和应用，性别控制的研究出现了高潮。

4 性别控制技术的方法

由于生物性别是个体发育性状,所以性别控制可以从三个方面入手:第一是控制雄性动物仅产生一种类型的精子或分离X、Y精子,然后用特定类型精子进入受精过程来实现对性别的控制。第二是对出生后的性别进行控制,但目前还没有这方面的报道,仅是从性反转的事例中设想而已。第三是控制胚胎的性别，怀孕之初可能是控制胚胎性别的最有利时机，因对晚期胚胎进行操作比较困难，而且对已经发生分化的胚胎进行操作可能会造成致命性的伤害[1]。

4.1 X、Y精子间的区别与分离研究

人们对X、Y精子之间的某些差异进行了大量研究,如检查Y精子上的F小体, 区别X、Y精子头部大小,X、Y精子的重量和比重上的差异，精子外膜电荷上的差异，运动速度的差异,抗原性的差异，耐酸碱性上的差异等等。精子分离法主要是依据X精子和Y精子的理化特性如密度、形态、大小、活力、表面电荷和免疫原性等进行分离。Ke Huiciu 证实X 精子在长度、头部面积、周径、颈部长度、尾长等形态上显著大于Y 精子，这为精子分离提供了理论依据。现就研究较多的一些精子分离方法简要介绍如下:

4.1.1 物理分离法

4.1.1.1 艾里克森法

艾里克森法是美国的德纳尔德?艾里克森医生研究出来的，方法是在精液中加入黏性较强的蛋白质液，再放入离心分离器。由于Y精子比X精子轻,因此游泳的速度较快, 可利用特殊的滤器加以分离。

4.1.1.2 过滤法

协特尔兹博士最初发现X精子与Y精子的不同，就是依据精子头部的形状和大

小不同判定的。过滤法就是以此为根据，使用头较大的X精子无法通过、只有较小的Y精子才能通过的滤网进行分离。方法是在精子与碱性颈管黏液相连接处搁置滤网, 只取出通过滤网的Y精子,结果发现颈管黏液中聚集了89%-97%外型上看来是Y的精子。但是由于电子显微镜的出现, 发现仅凭精子头的形状和大小进行单纯的分离是不够科学的, 因此中止了这个研究。

4.1.1.3 离心分离法

离心分离方法是根据X精子的DNA含量高于Y精子，导致X精子的密度及重量大于Y精子。在离心时X精子的沉降速度快于Y精子而实现分离的方法。此方法的优点是分离时间比一般沉淀分离短得多,并对精子的活力影响较小。但存在着X精子间沉淀速度的差异并不比X与Y精子间的差异要小的问题。Mestricb研究认为, X、Y 精子间只存在0.007g/cm3 的密度差异,因此,采用这项技术进行分离X、Y 精子时, 其条件和操作要求是需要极其精确的。近年来，采用Percoll 梯度离心的方法分离精子取得较高的分离纯度。Percoll是一种新的密度梯度介质，是由一种

所组成。由于它不渗入细胞膜，因而对精子无毒害作聚乙烯吡咯烷酮(PVP)SiO

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用。Kaneko 等( 1986)用此方法分离人的精子获得了较高的X精子群。Blotther 等(1991)采用10层不连续的Percoll梯度离心分离牛精子也获得成功。X、Y精子纯度都达到75%，两类精子作为体外受精后用PCR 对胚胎进行检测, 雌性胚胎为75%、雄性胚胎达92%。

4.1.1.4 沉积分离法

此法是利用X精子沉积速率比Y精子快的原理,Kaneko等报道把人的精液放在不同密度的12个Percoll梯度中,经过30min缓慢离心处理,可以收集到90%以上的X精子[2]。White等将活力四级以上的绵羊精液静置2h,取上层授精,母羊率达63.3%。但是这种方法缺乏重复性和其他动物实验的证实。

4.1.1.5 层状流动分离法

这是根据X和Y精子具有不同的运动方式或特点来进行分离的,有人曾观察到人的X精子在一种柱状流动液中的游动方式不同于Y精子,前者大部分集中在液柱的始端,而后者则多处于终端,这种方法虽经研究者用Y特异探针检查表明是成功的, 但仍有待重复试验或用其他动物的精子试验予以证实。

4.1.1.6 电泳分离法

此法主要是根据精子表面具有不同的电荷而设计的一种分离方法。原理是以中性缓冲液电泳时向阳离子移动的X精子比Y精子多来对精子进行分离。Bolttner 等用自由流电泳处理牛的精液, 发现在正极仅有少量的Y精子, 而在近负极处有80%的Y精子。随后George等运用quinacrine染色这一方法主要是根据精子不同的表面具有不同的电荷而设X精子染色而Y精子没染色, 但分离的精子在其他家畜的运用方面还没有报道。现已知精子所带电荷量会随精子的成熟或老化过程而变化, 随着精子的老化其膜电荷会变小, 除此以外, 还有哪些因素会影响膜电荷的变化尚未确定。另外膜电荷量的差异是否足以达到电泳法水平等都会影响其结论的准确性和重复性。

4.1.1.7 密度梯度离心法

X染色体的精子体积比Y染色体的精子大, 比重也不同。该方法正是以精子的比重差异为前提,利用密度梯度进行分离的方法。目前运用密度梯度沉降分离精子, 只能做到大部分分离,因此控制性别也只能达到70%—80%左右。经过此法处理的精液其受精率与一般未经处理的相似,但如再经液氮低温处理其活力会大为降低, 因此还需在其他动物进行试验才能证实。

4.1.1.8 帕克尔液比重分层法

检查精液时, 发现X精子比Y精子重7%。帕克尔液比重分层法就是利用这一点来分离X精子与Y精子,分离时使用帕克尔液,因此命名为帕克法。利用密度分层法, 将帕克尔液分为比重分别为1.06、1.07、1.08,1.09, 1.10, 1.11, 1.12, 1.13 的7层, 从底部往上,比重逐渐减少。试验中,将精子放在离心分离器中,精子会聚集在与自己比重相同处。结果, Y精子聚积在试管上方澄清液体和中间层处, 约占73%, X精子则聚集在试管的最下层。利用这个方法能够成功选择X精子, 因此对于奶牛生产有较高价值。

4.1.2流式细胞光度法

4.1.2.1 流式细胞仪工作原理

流式细胞仪由液流系统、光学系统、分选系统和数据处理系统等所组成，能够定量测定精子等多种单个细胞的细胞膜、胞浆以及核内的多种物质,而且具有测定快速、精确、多参数的特点。利用流式细胞仪进行精子分离前,先将可与DNA 结合的荧光素染料( Hoechst33342)与稀释的精液共同培养；分离时,精液首先以

极高的速度喷出,形成一个个极微小的液滴,存在于微滴中的单个精子因受到激光照射而产生出相应的光散射信号和某种颜色的荧光信号,前者的强弱反映精子细胞的大小、形态等,后者是由与DNA链定量结合的染料受到某种波长的光的激发而发射出来的, 光学系统通过分析测出该精子的DNA 含量, 从而识别出其类型并以图表的形式在计算机上直观地显示出来；接着,分选系统依精子的类型分别施加以正负不同的电荷,使它们在电场中继续向前运行时定向偏转于不同的电极, 这样,X精子和Y精子就可被分别收集到不同的容器中而予以分离,不含精子的微滴以及类型不能被识别的模糊精子会被仪器弃掉。

4.1.2.2优缺点

目前，流式细胞分离仪分离X精子和Y精子的速度已大大加快，分离85 %～90 %X精子时的速度可达到1100 万个/ h。如果采用小剂量子宫深部受精的方法，1 次输精200万～300 万个精子，可满足生产实践的需要。分离精子的性别控制技术已在奶牛和赛马等部分具有优良遗传品质的家畜上规模化推广，至少已产生了2 万头以上牛犊。这种方法分离准确率高达90% 以上, 每小时的分离速度为

3x106 —4x106 个精子,并且通过这种方法分离得到的精子并不影响胚胎的发育到囊胚[3], 所以该技术已成为目前最有重复性、科学性和有效性的分离精子的方法。但最主要的缺点就是分离速度太慢,按目前分离速度, 要获得一个输精剂量的精子, 需花费近20 小时。如此长的分离时间直接影响精子的活率, 导致受胎率下降,另外在预处理时还会使精子尾部和部分细胞器丢失, 使精子失去了受精能力。故此方法还有待改进。此外，精子核是被细胞质高度地包裹着, 而哺乳动物的精子又是不对称的, 故精子因激光照射而发荧光时, 如果精子的定位不正确, 从半透明的扁平面发出的真正反映X精子和Y精子DNA 差异的荧光与从精子边缘发射出的荧光相比则会显得更加微弱, 甚至于检测系统不能分辨, 这样定位不正确的绝大部分精子就会被认为不可辨别而弃掉, 这是影响流式细胞分类仪精度的一个重要原因。

4.1.3 FISH技术鉴定发

荧光原位杂交技术（是一种利用非放射性的荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术）。FISH由于其直观,快速,敏感性高和方便灵活越来越得到广泛的应用。基本原理是：将标记了荧光的单链DNA（探针）和与其互补的DNA退火杂交, 通过

观察荧光信号在染色体上的位置来反映相应基因的情况。即利用Y染色体特异核酸探针与精子上的特定的序列杂交, 而后标定荧光物质,在荧光显微镜下直接观察并区分X精子和Y精子[4,5]。该方法特别适用于X精子和Y精子DNA含量差别很微小, 重分析不能保证准确性的情况[4]。最初运用FISH在牛精子上的结果是可清楚鉴定79%的精子。另外FISH技术现在已经成功的应用在治疗男性病方面。但是该方法的缺陷是耗费时间长, 且试剂的价格较高。

4.1.4 以长臂Y染色体为标记分离法

其原理为根据Y精子具有长臂Y 染色体的特征, 利用盐酸奎纳克林荧光监测技术来分离精子。由于精液准备程度的变化性和连续观察与识别荧光信号的难度性, 许多人对此法的效率和重复性持怀疑的态度[6]。

4.1.5免疫法

该方法是利用H-Y抗体检测Y精子质膜上存在的H-Y抗原,以此来分离X精子和Y精子。Bryant等( 1980) 应用H-Y抗体免疫学亲和柱层析,首次成功地分离了人和小鼠的H-Y阳性和阴性精子。Zavos 等( 1982)用兔子生产抗血清进行实验,把H-Y抗血清注入母兔阴道15min后输精,产出的雌性兔为74.2%；1987年他又采用免疫过滤法对兔子和牛进行试验,结果后代中雌兔为78.9%、母犊为74.4%。王光亚等(1994)用兔H-Y抗血清进行试验, 将效价为1:32的兔H-Y抗血清输入发情母兔阴道内10-15min后自然交配,所生2只小兔均为雌兔。罗承浩等( 2004) 应用此法对奶牛进行实验, 结果表明比自然产母犊性比率理论值提高10.7个百分点(P<0.05)[7]。但由于H- Y 抗原是一种弱抗原, 所以其准确性比较低。因此要想利用此法分离精子需要制备高效价的抗体。

由上述可见, 精子分离的方法虽然较多, 但目前只有流式细胞光度法具有重复性、科学性和有效性的特点。

4.2胚胎性别的鉴定

4.2.1非分子生物学方法

4.2.1.1细胞遗传学方法（核型分析鉴定）

它通过分析部分胚胎细胞的染色体组成来判断胚胎性别, 有XX 染色体的为雌性, 有XY 染色体的为雄性。主要操作程序是: 先从胚胎中取出部分细胞, 用秋水仙素处理使其处于有丝分裂中期, 制备染色体标本, 用显微摄影分析染色

体组成, 确定性别。这种方法准确率可达100%, 由于获得染色体中期分裂很难, 且操作时间长, 对胚胎损伤大, 故难以在生产中推广。

4.2.1.2 免疫学法

从8-细胞期至早期胚泡期, 哺乳动物的雄性胚胎表达一种雌性胚胎所没有的细胞表面因子, 即H-Y 抗原, 利用H-Y抗原和抗体免疫反应的原理可以进行胚胎的性别鉴定。包括3种具体方法:

第一, 间接免疫荧光分析法。以H-Y 抗体为一抗, 用FTTC 标记的Y 球蛋白作为二抗, 将上述两种抗体依次与胚胎共同培养, 一抗先与雄性胚胎上的H-Y 抗原结合, 二抗再与一抗结合, 然后洗去未结合到胚胎上的二抗, 由于二抗用FTTC 标记, 故在荧光显微镜下显荧光者为雄性胚胎, 不显荧光者为雌性胚胎。这种方法不损伤胚胎, 鉴定过的胚胎都可以存活, 但准确率不高。

第二, 囊胚形成抑制法。将H - Y 抗血清与桑葚胚共培养, 一段时间后雄性胚胎由于具有H-Y 抗原被H-Y 抗体所抑制, 不能形成囊胚, 而无H-Y 抗原的雌性胚胎则不受影响继续发育成囊胚, 因此可以将雌、雄胚胎分开。然后可洗去H-Y 抗体, 雌性胚继续发育。这种方法鉴定的胚胎存活率与正常无异, 其正确率为80%左右。但只能检测桑葚期前的胚胎, 如果胚胎已发育至囊胚, 则无法鉴定。

第三，细胞毒性分析。补体存在时,H-Y 抗体可以与雄性胚胎结合, 并使一个或更多的卵裂球溶解, 或使其变得不规则, 发育受影响的胚胎为雄性胚胎, 发育正常的即为雌性胚胎, 这种方法以破坏雄性胚胎为代价且准确率不高。

4.2.1.3生物学微量分析法（X-相关酶法）

一般在哺乳动物中雌性带有两条X 染色体, 而雄性则带有一条X 染色体和一条Y 染色体。在胚胎发育早期, 为保持两性间的基因等量, 雌性的一条X 染色体失活。在胚胎基因组的激活和X 染色体失活这一短暂期, 雌性胚胎的两条X 染色体都可以被转录和翻译。这样雌性胚胎的X染色体连锁酶的活性和浓度是雄性胚胎的两倍[8]。这些相关酶有6- 磷酸葡萄糖脱氢酶、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶, 根据这些酶与底物的颜色反应可检测胚胎性别。Willams 等( 1986) 用葡萄糖- 6- 磷酸脱氢酶( G- 6- PD) 检查, 发现雌雄胚胎鉴别率为72%和46% 。Monk等用8细胞鼠胚的一个分裂球检查了X-染色体相连的次黄嘌吟磷酸核糖转移酶（HPRT）的活性, 雌性和雄性的鉴别准确率分别达到91%

和100%。但测定HPRT的方法对致密桑套胚或囊胚阶段的胚胎应用有困难。由于X 染色体失活的确切时间尚不明确, 可能把失活的雌胚误判为雄胚, 从而影响其鉴别的准确性, 为进一步提高鉴别的精确度, 首先要确定X 染色体失活的准确时间。另外, 这种方法的主要问题是潜在的细胞毒性。

4.2.2 分子生物学法

4.2.2.1雄性特提DNA探针检测法

其方法是将Y 染色体上一段特异DNA 片段, 用放射性或非放射性同位素标记成DNA 探针, 使其与胚胎细胞中DNA 的同源序列进行杂交, 并根据显示的斑点来判断是否有Y 染色体存在。结果如果是阳性则胚胎为雄性, 否则为雌性。探针的标记物现在主要有两种: 一种为放射性同位素, 一种为生物素。前者需要相当大量的胚胎细胞和较长的时间( 一般同位素低温曝光需7-8 天) 。后者设备简单, 技术难度低, 所需时间较短( 一般为24 小时) , 但可鉴定的胚胎较少。Leo nard 等首次报道用牛Y 染色体特异性DNA 多重复序列鉴定牛囊胚获得成功, 其性别鉴定准确率为95%( 81/85) 。

由于该项技术鉴定准确性高, 澳大利亚、美国、法国等已用于商业生产。但该方法仍存在一些不足之处, 如鉴定时需要用较多量细胞而对胚胎损伤较大, 尽管有人采用少量细胞也获得成功, 但需用较高和较强的同位素和在一定时间内完成。另外其鉴定时间较长以及每种动物必须采用该种动物的特异探针。因此, 该方法在广泛应用上仍受到一定限制。

4.2.2.2荧光原位杂交法（FISH）

FI SH 其主要有荧光素探针制备、探针和靶DNA 的变性与杂交、观察鉴定三部分组成。由于FISH 技术制备了特异性序列片段探针, 而且杂交在细胞内进行, 并能使用试剂而发光、显色, 既能在细胞分裂间期杂交, 也能在分裂中期杂交, 所以具有高效性和低错误率的优点[9]。Santi aqomunne 等( 1993) 用绿色荧光素标记Y 染色体特异序列探针, 红色荧光素标记X 染色体重复序列探针, 对处于前8 细胞期的人胚胎进行了共68 个分裂球双探针FISH 检测, 仅使用6 h 就完成了从显微操作到显微观察的整个过程, 准确检测了胚胎性别, 其有效率达95. 5% ( 65/ 68)。其不足之处是DNA 探针特异性不强、荧光素分辨率低且对胚胎毒性较大。

4.2.2.3PCR扩增法

哺乳动物Y 染色体上存在性别决定区( Sex determining region of Y) , 即SRY 基因, 它位于Y 染色体短臂, 从着丝粒到端粒与拟常染色体区相邻的35kp 的范围内。人们将携带SRY 基因的一段基因组片段导入XX 小鼠胚胎, 实现了由雌性向雄性的性反转, 证明了SRY 基因确为哺乳动物的性别主宰基因。人类的SRY 基因只有一个外显子, 长850 bp, 该基因有一个多聚腺苷酸位点和两个转录起始点, 其间是一个可读框, 可编码204 个氨基酸, 其中包含可编码79 个氨基酸的保守区— HMG盒。SRY 基因在哺乳动物间具有高度的同源性, 如牛和小鼠的SRY 基因有75%的同源性, 同人有95% 的同源性。而HMG 盒的保守性更大, 绵羊、牛、山羊和小鼠的HMG 盒中有一段完全相同的190 bp 的序列, 这是我们进行引物设计的重要依据。除SRY 基因外, Y 染色体上锌指结构基因( ZFY) 和其在X 染色体上的同源序列ZFX 基因对于哺乳动物的性别鉴定均具有重要意义。用PCR 鉴定家畜胚胎的性别其主要程序为（1）胚胎的获取: 冷冻胚胎、刚从供体牛回收的鲜胚或体外受精培养的胚胎都可以用来鉴定性别；（2）引物的设计；（3）用显微操作或徒手从胚胎中取出几个细胞, 处理后进行PCR 扩增（4）电泳检测。根据引物的对数、扩增的特异片段和EB 加入的时间不同, PCR 法又可分为双扩增、单扩增、联合扩增、直接观察法。

4.2.2.4LAMP法

LAMP 法是一种全新的基因扩增法。由于双链DNA 在65℃左右处于动态平衡状态, 任何一条引物对双链DNA 的互补部位进行碱基配对时, 一条链就会脱落变成单链。LAMP 法就是利用这一特点, 对目标基因的6个区段设定雄性特异性以及雌雄共同引物( 4 种) , 利用特殊的链置换型DNA 聚合酶, 在65℃的恒温条件下对胚细胞中的雄性特异性核酸序列和雌雄共有核酸序列进行扩增反应, 最后通过反应过程中获得的副产物焦磷酸镁形成的白色沉淀的浑浊度来进行早期胚胎性别的鉴定。从反应开始到性别判定完成约40 min。王海浪利用此法对牛早期胚胎进行检测, 其性别符合率达到100%, 与H. Hir ayama, S. 等鉴定113 头奶牛胚胎性别符合率58 枚雄性, 55 枚雌性结果相符。LAMP 反应是相当灵敏的反应, 只要混入极其少量的目标基因以外的基因DNA 或其他检品的扩增产物, 也可能造成误判。

比较胚胎性别鉴定的各种方法, 应用PCR 技术、LAMP法进行胚胎性别鉴定, 具有灵敏、快捷、简便、实用等特点, 但灵敏度高本身又是该技术的缺点, 由于操作过程极易遭到污染, 因此在操作过程中, 一定要严格遵守操作规则, 以防止外源污染。

4.3 其他方法控制性别

4.3.1 授精环境控制法

4.3.1.1 PH调节法

其理论依据异型精子在阴道内的移动速度受阴道酸碱度的影响, 当阴道液偏酸时,Y 精子移动的速度较慢,X 精子游动的速度较快,X 精子首先到达卵子所在地, 抢先入卵, 受精卵为雌性合子(X X ) , 相反, 当阴道液偏碱性时,Y 型精子游动速度比X 精子的快,Y 型精子可能入卵形成X Y 雄性合子。因此改变授精环境的pH 值可达到性别控制的目的。黑木常春( 1978) 将精氨酸用生理盐水稀释成高、中、低三种浓度( 分别为10% 、5%、3%) , 输精前20-30 min 注入某一浓度的精氨酸液1 ml, 结果以中浓度的产雌率为最高[10]。段恩奎等( 1991) 在兔子输精前经过阴道输入不同浓度( 5%、1 0%) 、不同构型( L、DL) 的精氨酸用来改变生殖道环境的pH 方法来控制性比率, 其结果为: 后代雌性比率与精氨酸构型无关, 而与所用精氨酸pH 有关[11]。有研究表明应用5%和8%的精氨酸在输精前15-30 min 处理发情母牛的子宫, 对提高母牛产雌率效果显著。此方法取得了一定的效果, 但效果很不稳定, 由于处理后不久阴道内的pH 值逐渐回升,其效果也不明显。

4.3.1.2 授精时间控制法

因为Y 精子小于X 精子,Y 精子在生殖道中比X 精子游速快, 如输精时间提得过早Y 精子先到达受精部位, 再等卵子到达Y 精子已失活没有受精能力。X 精子运动慢且寿命长, 活力也大于Y 精子, 这便有利于与卵子结合产生雌性胎儿, 该方法应用是如何准确的判断发情和确定何时排卵, 而且家畜个体存在差异, 操作困难。

4.3.2两月龄胎儿性别控制

在美国和加拿大等一些国家在牛受体群中有利用, 尤其是在胚胎移植后的受体群, 在移植两个月后, 应用超声波来判断胎儿的性别, 怀有雌性胎儿的受

体被卖到农场, 对该场没有什么可利用价值的雄性胎儿被堕胎。具体的判断方法主要通过超声波判断雄性胎儿的生殖器官朝向脐带, 雌性胎儿的生殖器官则朝向尾巴。这个过程雄性胎儿开始在47d , 雌性胎儿在55d。生殖器官的定位能够通过超声波准确观察, 在妊娠一定的时间内运用适当的仪器和经验操作, 最佳时间在妊娠5-70 d , 胎儿性别决定原理是容易学的, 但是决定雄性和雌性还需要操作经验。

4.3.3胚胎分割技术

通过胚胎分割技术将鉴定过性别的胚胎分割成2 个或多个部分，移植后，每一部分可发育成一个正常的个体[12]。1959 年,Tarkowski 发现一半卵裂球已被破坏的2- 细胞小鼠胚胎可以发育成囊胚，并出生了小鼠。该研究结果表明，早期胚胎的每个卵裂球具有发育全能性，都能发育成正常个体。1980 年，Willadsen 用琼脂包埋分割的绵羊2、4、8- 细胞期胚胎，使半胚在中间受体内发育时受到保护，并防止其内的卵裂球分散，取得了近似正常的妊娠率（66 %）。1984 年，对该方法进行了改进，分割较晚期的胚胎（桑椹胚或胚泡），分割后的胚胎立即移植，具有很大的实用价值。

4.3.4克隆技术与性别控制

自从克隆技术问世以来, 研究报道体细胞克隆技术和胚胎克隆技术也都可以控制性别。核移植是哺乳动物最有效的方法, 它可无限制的生产同祥性别的后代。

5动物性别控制技术在应用过程中存在的问题及其发展的前景

5.1动物性别控制技术在应用中存在的问题

家畜的性别控制技术已在商业上应用, 而且这种技术的应用已成为畜牧业发展中的主要技术之一。但是性别控制技术在生产中的普及还存在许多限制性的因素。

成本高在性别控制过程中往往需要特定的科研仪器, 价格十分昂贵。如流式细胞分离仪, 显微操作仪, 荧光显微镜,PCR仪等目前运用PCR试剂盒每枚胚胎的检测成本太高。

耗时长以传统的PCR性别鉴定为例, 采得胚胎后对胚胎取样, 提取胚胎细胞DNA ,PCR扩增提取的DNA ,最后将扩增DNA通过琼脂糖电泳鉴定胚胎性别整个

过程约需要数小时。而且鉴定后的胚胎冷冻解冻后性别鉴定胚胎移植会降低移植效果。

技术要求高目前性别鉴定的胚胎等往往只能在实验室进行。在实践中精子的分离速度还需改进；运用FISH和PCR法必须从胚胎上取样, 对胚胎或多或少都会造成损害。

5.2动物性别控制技术的发展前景

根据目前性别控制的技术来看, 运用流式细胞分离法和SRY一PCR扩增法是准确而发展前景比较广阔的性别控制方法, 但是分离速度还有待进一步的提高, 以便在生产中广泛的应用, 同时加强体外受精和显微受精技术结合, 从而提高精子的利用率, 运用SRY一PCR技术鉴定胚胎性别关键在于提高灵敏度减少细胞取样对胚胎的损伤, 取样胚胎冷冻后移植妊娠率等。另外, 需要研究家畜SRY一PCR试剂盒, 使这种方法的操作简单而实用, 同时广泛的进行研究运用胚胎工程(核移植技术和转基因技术等)等学科的前沿的技术来提高性别控制的准确率, 将在畜牧业上得到广泛的应用。

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