细胞培养传代冻存复苏操作规程(自编)
细胞培养程序
材料
A、仪器
1. 净化工作台，
2. 离心机，
3. 恒温水浴箱，
4. 冰箱（4℃）
5. 倒置相差显微镜，
6. CO2培养箱，
7. 振荡混合仪
8. 酶联免疫检测仪，9. 移液枪，10. 电磁力搅拌机，11. 微孔滤器
B、玻璃器皿
1. 吸管，
2. 小烧杯（100ml），
3. 废液缸，
C、塑料器皿
1. 吸头，
2. 枪头，
3. 96孔培养板，
4. 15ml离心管，
5. 50ml离心管，
6. 胶塞，
D、其他物品
1. 微量加样枪，
2. 红血球计数板，
F、试剂
1. D-Hanks液，
2. 小牛血清，
3. RPMI1640，
4. 双抗（青霉素、链霉素），
5. 0.25%胰酶，
6.0.025% EDTA
7. 二甲基亚砜（DMSO），
8. MTT溶液：称取250mgMTT，放入小烧杯中，加50ml培养液或平衡盐溶液在电磁力搅拌机上搅拌30min，用0.22um的微孔滤器除菌，分装，4℃保存备用，两周内有效。
一、原代细胞培养或细胞株（系）复苏培养：
（一）细胞原代培养
1.贴壁细胞培养法：
1）、组织块培养法
将所取得的组织用含青霉素、链霉素400U/ml和400ug/ml的生理盐水漂洗2此，5分钟/次。取出组织尽可能的取出液滴，置青霉素小瓶中，加两滴小牛血清，用剪刀尽可能将其剪碎，用吸管将其泥状的组织点种在培养瓶壁，倒置于37°、5%CO2条件下30分钟后将培养瓶正置，从培养瓶的一端缓缓加入完全培养液（小
牛血清15%、青霉素、链霉素各100U、100ug/ml），使组织块有培养液与其接触为准，轻轻放置于37°培养。待24小时候补液。
或小块放置后,轻轻翻转培养瓶,使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在37℃温箱内。培养2~4小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败，若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养24小时后再补液，培养3~5天时可换液，一方面补充营养，一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。
其他方法：消化分离法、器官培养略
2.悬浮细胞培养法
对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。
（二）细胞株(系)细胞复苏培养
细胞复苏的主要操作步骤
(1)佩戴眼镜和手套，从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。
(2)迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化。
(3) 然后在无菌下取出细胞。冻存管用75%酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，再滴加10ml培养液。
(4)在1000r/min速度下离心5～10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养12～24小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。加入的培养液的量依冻存的细胞数量，如果冻存数量为106，则稀释10倍使细胞达到105即可。
注意事项
在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段(-5～0℃)。这样复苏的冻存细胞存活率高，生
长及形态良好。然而，由于冻存的细胞还受其他因素的影响，有时也会有部分细胞死亡。此时，可将不贴壁、飘浮在培养液上(已死亡)的细胞轻轻倒掉，再补以适量的新培养液，也会获得较为满意的结果。
二、细胞维持培养（细胞换液培养）、培养选拔常规观察
(一)原代细胞的维持
1、贴壁细胞（包括半贴壁细胞的换液）
一般三天后组织块周围即可见梭形细胞长出。第三天换液一次，其换液方法比较简单，即弃去旧液，加入与原培养液相同的等量完全培养基。若希望细胞能在较长时间内能维持存活，但不需增殖，此时要换成含2%小牛血清的维持液。待不同组织块周围的细胞连接成片时即可传代。
2、悬浮细胞
凡经培养后只在细胞培养基中悬浮生长而不贴壁的细胞，需在倒置显微镜下方可观察到细胞的形态和生长现象，淋巴细胞的短期培养无需换液，但加入生长因子或有丝分裂源（PHA、PMA、COnA、PWM、LPS等）后，细胞不仅会发生转化而且会发生分裂繁殖，此时培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求，加之代谢产物增多，pH变酸，细胞不适宜生长，需进行换液。白血病细胞或淋巴瘤细胞体外长期培养时，都需换液培养，待达到饱和密度时才能传代。换液时，只能采用半量换液的方式，千万不能采取倒去旧液加入新液的方式进行换液。
半量换液的方法如下：
将原培养瓶竖起，在30分钟内，若细胞沉于瓶底，可用吸管轻轻吸去一半上清弃去，再加入等量的新鲜完全培养基。若细胞不能沉于瓶底，可吸出细胞悬液，采用低速离心（1000r/min10min）弃去一半上清加入等量的新鲜完全培养基，混匀后再转入原瓶继续培养。
（二）传代细胞维持培养：同上
（三）培养选拔常规观察：
1.培养液
2.细胞生长情况
3.细胞形态变化
4.污染情况
三、细胞的传代培养：
(1)弃旧培养液：吸除或倒掉原瓶中的旧培养基（以25mL培养瓶为例）。
(2)漂洗：每瓶加入2mL，无钙、镁PBS或HANKS液，漂洗贴壁细胞一次后倒掉。（此步可以省略）
(3)消化：每瓶加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.025EDTA混合液1:1），轻轻摇动培养瓶，经消化液铺满所有细胞表面，在倒置显微镜下待1/2细胞变园后加适量完全培养液终止。或细胞层略有松动，肉眼可观察到“薄膜”现象时，倒掉消化液，再继续作用2～3分钟，轻轻摇动，细胞层可随残留的消化液呈片状从瓶壁上脱落下来，在显微镜下可发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大，此时应立即终止消化）。在37°或25°以上环境进行消化。
(4)终止：加入完全培养基适量（通常10-20%胎牛血清培养基）5ml，用吸管反复吹打瓶壁上的细胞，吹打时要按顺序进行，以确保所有瓶壁均吹打到，吹打时动作要轻柔，不要用力过大，尽可能不要出现泡沫，以避免细胞的机械损伤。
(5)离心：离心（1100rpm）沉淀细胞（5-10分钟），去除培养基（含胰酶及EDTA）。
(6)计数：离心前先滴好计数板待计数，计算细胞的浓度。
(7)传代或冻存：离心后用完全培养基调整适当的细胞浓度后再分瓶培养（可1:3至1:5传代，在25cm2的培养瓶中长满细胞可达5*106/ml，经10倍稀释每瓶达105/ml即可，25cm2的培养瓶每瓶5ml培养液）。或用冻存液调整浓度（一般达1*107）冻存。（到此步时经证实未被细菌或真菌污染，则撤去抗生素，以免对细胞的生长长生不利影响，指原代培养细胞）
四．细胞冻存：
细胞冻存液：
20% 小牛血清
10% 二甲基亚砜DMSO
70% 培养液
操作步骤：
1.选对数增生期细胞（证明无支原体污染），在冻存前一天换液。
2.按常规方法把培养细胞制成悬液，计数，使细胞密度达5*107/ml左右，离心，
去上清液。（冻存细胞数量要充分，密度达5*107/ml，在溶后稀释20倍时，仍能保持5*105ml数量）。一般25cm2的培养瓶满瓶才达到105.
3.加入配置好的冻存液，与去上清液相同的量一滴一滴的加入离心管中，让侯
用吸管轻轻吹打令细胞重悬。冻存细胞室培养液中加入保护剂10%二甲亚砜(DMSO)或甘油，可使冰点降低，使细胞内水份在冻结前透出细胞外。（细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5-10%DMSP和90-95%原来的细胞生长用之新鲜培养基均匀混合。注意由于DMSO稀释时会释放出大量热能，故不可将DMSO直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成）
4.分装于无菌冻存管中，每管1.5ml悬液。
5.旋好冻存管并仔细检查，一定要盖紧，做好标志。
6.冻存：
1）冰箱4℃放2小时，-75℃过夜，转液氮保存，
2）4°，0°，-20°各30分钟（现代分子生物学实验技术P647），最后直接放入液氮中保存或-80°冰箱保存。
附件一、培养细胞的生长状况观察
（一）细胞计数操作规程
胎盘蓝法原理：（产品批号：T8154，T6146和Z35,962－9）
使用胎盘蓝染色决定血细胞总数和活细胞数目，胎盘蓝是用于染色的多种染料中能被活细胞排斥的一种染料，这种方法的成立是基于活细胞不能被染色：胎盘蓝对血清蛋白比细胞蛋白有一种更强的亲和力，如果背景太深，在计数之前细胞应成球状并重悬在无蛋白的培养基或盐液中。
方法：
1、预先在平衡盐液中悬浮细胞（例如：Hank’s平稳盐液HBSS，产品批号：H2513）
2、取0.5ml 0.4%胎盘蓝于一试管中，加0.3ml（HBSS和0.2ml细胞悬液（稀释倍数＝5）并且混匀，允许放置5－15分钟。
注意：如果细胞在胎盘蓝中暴露时间过长，活细胞也会像死细胞一样被染上色。
3、在血细胞计数板上盖上盖玻片，使用巴斯德毛细吸管或其它合适的器材取少量的胎盘蓝细胞悬液于血细胞计数板上的两个小室中。将巴斯德毛细吸管小心的靠在盖玻片边缘，利用毛细张力充满小室，不要过度或过少充盈。
1）从血细胞计数板的一个小室开始，计数中间和四角边长/mm的正方形中的所有细胞数（详见sigmaP1845的图样I）死细胞被染成蓝色，分别计数活细胞和死细胞数。
注意：压线细胞的计数原则，数上不数下，数左不数右（详见sigmaP1845的图II）
2）重复上述步骤计数第2个小室
注意：如果超过10%的细胞成串，应重复全部程序通过吹打务必使细胞在原液中和在胎盘蓝细胞悬液中一样分散，如果在10个正方形方格中细胞数少于200个或多于500个（20－50个细胞/正方形）应重复这个步骤，以调节细胞稀释倍数。3）准备第二份样品并重新计数以保证准确
4）细胞计数－血细胞计数板上盖好盖玻片的每个正方形（指中央大方格，其长度宽度均为1mm的正方形，与盖玻片的距离为0.1mm），总体积为0.1mm3或10-4cm3。若1cm3近仍等于1ml，那么每毫升中集中的细胞数（和细胞总数）则可以这样来计算。
每毫升细胞数＝每个正方形的平均细胞数?稀释倍数?104（10个正方形的细胞计数）
例：如果每个正方形的平均细胞数是45?5?104＝2.25?106个细胞/ml
总细胞数＝每毫升细胞数?最初的细胞样品的体积
例：2.25?106 (个细胞/ml) ?10ml（最初体积）＝2.25?107个细胞（总细胞）5）活细胞比例（%）＝总的活细胞数（没染上色的）÷总的细胞（染上色的和没染上色的）?100
例：如果每个正方形中没染上色的（活的）细胞平均数是37.5，总活细胞数＝(37.5?5?104)活细胞数/ml?10ml（最初体积）＝1.875?107个活细胞，活细胞比率（%）＝1.875?107（活细胞数）÷2.25?107(总细胞数) ?100＝83%.
血球计数板的使用
16×25型的计数板将计数室放大，可见它含16中格，一般取四角：1、4、
13、16四个中方格（100个小方格）计数（见图二）。将每一中格放大，可见25个小格。计数重复3次，取其平均值。计数完毕后，依下列公式计算：酵母细胞个数／1mL=100个小方格细胞总数/ 100 ×400×10000×稀释倍数或：4个中格的细胞数/4×16×10000×稀释倍数
有一种计数板的结构为25×16，计算如下：4个中格的细胞数/4×25×10000×稀释倍数
（二）.细胞生长曲线（细胞贴壁率、细胞分裂率：略）
概念：
细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过长短不同的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期。在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入平顶期，然后退化衰亡。为了准确描述整个过程中细胞数目的动态变化，典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期，斜率较大的指数生长期，呈平台状的平顶期及退化衰亡4个部分。以存活细胞数(万／mL)对培养时间(h或d)作图，即得生长曲线。
方法：
计数法：
1．取生长良好接近汇合的细胞，用胰酶消化，用新培养基制成细胞悬液后计数(见
四、细胞传代培养的实验步骤)。如是非粘壁细胞，则离心弃旧培养基后，换上一定量的新鲜培养基然后制成细胞悬液计数。
2．根据细胞计数结果按每个小方瓶5×104／mL作传代培养接种细胞，共接种21瓶细胞。
3．24 h后开始计数细胞，以后每隔24 h计数一次，每次取3瓶细胞，分别进行计数。计算平均值。连续计数7 d。
4．根据细胞计数结果，以单位细胞数(细胞数／mL)为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线。
MTT法：
1．制备1 mL细胞悬液。空白对照以1 mL培养基代替细胞悬液。加入0．1 mL MTT于37℃孵育4 h。使MTT还原为蓝紫色甲月赞结晶。
2．加1 mL DTW脱色液，37℃至少静置30 min(甚至过液)，使甲质颗粒充分溶解。
3．吸取200 μL该溶解液至96孔板孔中，在酶标仪上读取OD值，检测波长570 nm，参考波长630 nm。
4．每隔24 h测量一个点，每个点为3个平行样品的平均值。
CCK-8法：略
CCK-8法的优点：1、使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；2、CCK-8法能快速检测；3、CK-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度；4、CCK-8法的重复性优于MTT法；5、CCK-8法对细胞毒性小；6、CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。
CCK-8法的缺点:1、与MTT法相比，CCK-8和XTT的价格比较贵。2、CCK-8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多加。
（三）.活选细胞观察：相差倒置显微镜使用：略
附件二：
细胞裂解液：提取RNA用
0.5% SDS
0.1mmol/L EDTA(PH8.0)
10 mmol/L Tris.cl(PH8.0)
20 ug/ml RNase
TE:RNA、DNA溶解用
1mmol/L EDTA(PH8.0)
10 mmol/L Tris.cl(PH8.0)
附件三.IC50半抑制率实验：
MTT法：
MTT原理、步骤、结果分析方法及注意事项：MTT全称为3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。
MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。
MTT 溶液的配制方法
通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃ 避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。
MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成
5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.配制MTT时用用PBS溶解,也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶。
PBS配方：
Nacl 8g
Kcl 0.2g
Na2HPO4 1.44g
KH2PO4 0.24g
调pH 7.4
定容1L
MTT法实验步骤
贴壁细胞：
1、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。
2.、5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况
3.、5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
5、终止培养，小心吸去孔内培养液。
6、每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分
溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
7、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）
悬浮细胞：
1、收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 (储存液100μg/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100μl 1640）。
2、置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
3、每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm （630nm校准）测量各孔的吸光值）
4、离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm 校准）测量各孔的吸光值。
5、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。
注意事项：
（1）选择适当得细胞接种浓度。
（2）避免血清干扰：一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。
（3）设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。
（4）MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系，
IC50是半抑制率：
一定浓度的某种药物诱导肿瘤细胞凋亡50%，该浓度称为50%抑制浓度. IC50值可以用来衡量药物诱导凋亡的能力，即诱导能力越强，该数值越低,当然也可以反向说明某种细胞对药物的耐受程度。意思是抑制率50％的时候药物的浓度。
把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50％抑制率时候的药品浓度，就是IC50。要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可！
举个例子：各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入计算公式：Pm=0.95，Pn=0.06，P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1 Xm=lg0.1=-1，lgI=lg0.1/0.01=1，
lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025
IC50=0.00025
有一个公式可供参考;
lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)
Xm:lg 最大剂量
I:lg(最大剂量/相临剂量)
P:阳性反应率之和
Pm:最大阳性反应率
Pn:最小阳性反应率
抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值
公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率
例：
用96孔板培养SMMC-7721肝癌做MTT测细胞活力,应该加多少1640培养基,多少MTT和DMSO合适?根据书上说的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加DMSO之前要尽量去掉培养液，便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定
一般每孔4000个细胞为宜，既细胞浓度在20000个/ml，MTT加20ul，作用四小时后洗掉上清液，注意不要将甲瓉洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脱色摇床上振荡10分钟，然后测吸光值。
一般要低于IC50，避免非调亡性杀伤的细胞太多，造成流式细胞仪检测碎片太多。我一般用1/2-1/3的IC50，作用时间为36h。一般肿瘤细胞系空白处理的调亡率应低于1%，用药后一般为5-10%（Annexin V），细胞周期的亚G0峰比较明显。
细胞传代培养的原理及操作步骤,细胞冻存,细胞复苏
细胞传代培养的原理及操作步骤 （一）原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，须进行传代再培养。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 （二）细胞传代培养具体操作 1、细胞：贴壁细胞株 2、操作步骤 1）将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2)加入0.5-1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。 3)瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。 观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1-3分钟。 4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。 细胞冻存 1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水 浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的 细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。 5. 去上清液，加入与细胞悬液等量的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀 6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16～18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储 存。-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。 细胞复苏 1.室内紫外消毒；培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。 2.自液氮罐中取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，离心。 3.去上清，加入培养基，吹打，然后移入培养瓶中，用培养基清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。 4.于培养瓶中加入适量培养基，放入CO2培养箱中培养 5.记录复苏日期；次日换液。
民爆物品仓库安全操作规程(新版)
民爆物品仓库安全操作规程 (新版) The safety operation procedure is a very detailed operation description of the work content in the form of work flow, and each action is described in words. ( 安全管理 ) 单位：______________________ 姓名：______________________ 日期：______________________ 编号：AQ-SN-0103
民爆物品仓库安全操作规程(新版) 根据《民用爆破器材企业安全管理规程》（WJ9049-2005），制定本制度如下： 一、仓库管理人员必须熟悉和掌握民用爆破器材的性能及灭火方法，严格执行民用爆器材同库存放和单个民用爆破器材仓库允许最大存量的规定，分品种定量贮存，分类管理，责任到人，做到先进先出，账物相符。 二、严禁携带火种进入库区，严禁穿带铁订鞋和易产生静电的化纤衣服进入库房。 三、进入库区的车辆或人员必须进行严格登记，不符合安全规定的车辆严禁进入库区。 四、在收发产品时，库管员必须做到坚守岗位，人不离库钥匙不离身，并认真审核入库单、提货单，认真核实规格品种，清点数
目，及时上报下账，做到账账、账物相符，人走上锁。 五、入库产品必须有验收合格证。如遇有特殊情况需入库时，必须经公司领导批准，化学性质不稳定的废民用爆破器材或未进行相容性试验的新产品应单独存放，严禁和常规产品同库存放。 六、库管工作应做到“十二”无；即库内无尘土、无杂物、无水汽凝结、无漏雨、无渗水、无事故差错、无包装损坏、无锈蚀霉烂、无鼠咬虫蛀、库边无杂草、库房周围无易燃物、水沟无阻塞。 七、库内产品堆放应符合相应规定，利于行走，搬运方便，通风良好，堆放稳固。 八、入库的民用爆破器材封存标志应保持完好，任何人不得随意开封拆箱，开封检验或取样时，库管员应配合取样人员将产品移至指定地点。 九、产品应按生产批号成垛堆放，不同规格的民用爆破器材应分垛堆放。 十、仓库内装运的主要通道宽度不小于1.2m，人行检查、清点通道宽度不小于0.8m，通道上严禁堆放任何物品，堆垛边缘墙不应
细胞的冻存和复苏
背景知识： 细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。 细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜(DMSO)作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。 细胞冻存 操作步骤： 1. 配制含6-10%DMSO的10%小牛血清的冻存培养液，冰上预冷； 2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管； 3. 离心500rpm，5min； 4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，由慢至快，滴入配制好的冻存培养液，用吸管轻柔吹打使细胞均匀（在冰上进行）；一般一个小方瓶冻一支或者一个10cm培养皿冻2支。 5. 将细胞分装入冻存管中，每管1ml（若冻存多于1支，则每支要均匀分装）； 6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者； 7. 冻存：放入装有异丙醇的程序降温盒中，-70℃冰箱中放3天左右，取出冻存管，移入液氮容器内。 注意事项： 1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液； 2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；
RD细胞复苏、传代、冻存
RD人恶性胚胎横纹肌瘤细胞培养操作 1）复苏细胞：将含有1mL 细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL 培养基混合均匀。在1000RPM 条件下离心4 分钟，弃去上清液，加1-2mL 培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm 皿中，加入约8ml 培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。 2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。 1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS 润洗细胞1-2 次。 2. 加1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。 3. 按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM 条件下离心4 min，弃去上清液，补加1-2mL 培养液后吹匀。 4. 将细胞悬液按1：2 比例分到新的含8ml 培养基的新皿中或者瓶中。 3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25 瓶为类； 1. 细胞冻存时，弃去培养基后，PBS 清洗一遍后加入1ml 胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml 含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2. 4 min 1000rpm 离心去掉上清。加1ml 血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO 终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml 细胞悬液，注意冻存管做好标识。 3. 将冻存管置于程序降温盒中，放入-80℃冰箱，2h以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
细胞冻存方法
细胞冻存方法 一、概述 目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。 二、主要冷冻设备和材料 常用的细胞冷冻贮存器为液氮贮存器，规格有35L3和50L3两种。使用时要注意以下几点：（1）一般两周需充液氮一次，至少一个月充氮一次。液氮温度达-196℃，使用时注意勿让液氮溅到皮肤上，以免引起冻伤。 （2）液氮容器为双层结构，中间为真空层，瓶口有双层焊接处，应防止焊接部裂开。（3）在装入液氮时，要注意缓慢小心，并用厚纸卷筒或特制漏斗作引导，使液氮直达瓶底，如有专用液氮灌注装置则更好。若为初次使用，加液氮时更要缓慢，以免温度骤降而使容器损坏。 细胞冻存时常备的材料有：0.25%胰蛋白酶，含10%～20%的血清培养液，DMSO(分析纯)或无色新鲜甘油(121°C蒸气高压消毒)，2mL安瓿（或专用细胞冻存管）、吸管、离心管、喷灯、纱布袋（或冻存管架）等。 三、细胞冻存方法 主要操作步骤为： （1）选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min，10分钟)。 （2）去上清液，加入含20%小牛血清的完全培养基，于4℃预冷15分钟后，逐滴加入已无菌的DMSO或甘油，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，细胞浓度为3×106～1×107/mL之间。（3）将上述细胞分装于安瓿或专用冷冻塑料管中，安瓿装1～1.5mL在火焰喷灯上封口，封口处要完全封闭，圆滑无勾。冷冻管要将盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记（日期、细胞种类及代次、冻存支数）。 （4）将装好细胞的安瓿或冻存管装入沙布袋内；置于液氮容器颈口处存放过夜，次日转入液氮中。采用控制降温速度的方法也可采用下列步骤：先将安瓿置入4℃冰箱中2～3小时，再移至冰箱冷冻室内3～4小时（此步可省略），再吊入液氮容器颈气态部分存放2小时，最后沉入液氮中。 细胞冻存在液氮中可以长期保存，但为妥善起见，冻存半年后，最好取出一只安瓿细胞复苏培养，观察生长情况，然后再继续冻存。
细胞培养基础知识详解-细胞的复苏、传代和冻存
细胞培养基础知识详解 细胞的复苏、传代和冻存实验操作指导 整理：江耀伦李美娣 1 细胞复苏 细胞复苏的原则－快速融化：必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。 1.1实验前准备 （1）将水浴锅预热至37℃ （2）用75％酒精擦拭紫外线照射30min的生物安全柜内部台面。 （3）在生物安全柜中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。 1.2 细胞复苏培养 （1）根据细胞冻存记录取出需要复苏的细胞。 （2）迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。 （3）约1-2 min后冻存管内液体完全溶解，取出放入离心机中以1000 rpm/min速度离心3~5 min。 （4）用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入生物安全柜内。吸弃上清液，向离心管内加入1 mL培养液，吹打制成细胞悬液。 （5）将细胞悬液分装入培养瓶或者培养皿内，将培养瓶/培养皿放入37℃，5％ CO2的培养箱内过夜后换液继续培养，换液的时间由细胞情况而定。 1.3 初学者易犯错误 （1）水浴锅未预热或者未预热到37℃。 （2）水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。 （3）离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。 （4）一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。 1.4 细胞传代 1.4.1 传代前准备 （1）预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶
子放入37℃水浴锅内预热。 （2）用75％酒精擦拭经过紫外线照射的生物安全柜内台面和双手。 （3）正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。 1.4.2 细胞传代 （1）取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入生物安全柜内。 （2）从培养箱内取出细胞：注意培养瓶取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。 （3）将培养瓶放入生物安全柜后打开瓶口，同时用酒精棉擦拭瓶口消毒。 （4）加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。 （5）显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。 （6）弃去胰蛋白酶液，加入新鲜的培养液终止反应。小心吹打成细胞悬液。 （7）将细胞悬液吸入10 mL离心管中。平衡后将离心管放入离心机中，以1000 rpm/min离心5 min。 （8）弃去上清液，加入适当体积的培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 （9）将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。 （10）显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要时计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/mL。最后要做好标记。 （11）继续培养：用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养，传代细胞2-4 h后开始贴附在瓶壁上。 1.4.3 注意事项 （1）严格的无菌操作 （2）适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，
粮食仓库机械设备安全操作规程
用电设备操作规程市粮油综合服务公司
粮食输送机安全操作规程 一、使用前准备 1、设备使用前应认真阅读设备供应商提供的产品说明书、使用说明书、操作手册等资料，掌握设备的基本结构、工作原理及基本操作方法。 2、清扫输送带上残留的谷物和其它杂物，清扫输送机支架、托辊等位置上的稻草、麻绳、包装绳等杂物； 3、检查电源接头是否牢固，电机是否完好，有无漏电情况等； 4、检查输送机电机、传动带、接电等部位防护措施是否到位； 5、检查托辊及轴承等传动部位的滚动是否灵活，是否需要加油； 6、检查设备（含电机部分）润滑部位润滑是否良好； 7、检查升降装置是否能升降到位，准确可靠； 8、检查输送带的松紧程度，避免输送带过松或过紧； 9、空车开启输送带，检查运转是否平稳，有无跑边的现象。 二、操作程序 1、正常启动运行程序 （1）单机启动程序：将带式输送机移动到工作地点→掀开罩机的防护布→用专用木块（三角木楔）或其它方式固定移动轮→各部件检查无异常情况→接通电源→手动或机动调整输送机到需要的高度，并进行锁定→空载启动→运行正常后逐步均匀进料→达到额定输送量。 （2）多机联动启动程序：按照以上程序卸料终端的输送机先启动，然后依次向前启动各台输送机。停机时，从进料端开始，先停止进料，再停首台输送机，然后依次向后停止各台输送机。 2、停机程序： （1）正常停机程序：停止进料→将承载段上的粮食卸完→调整升降机，将输送机落至最低位置→停车→关闭电源→拔出电源插头→清扫干净备用→覆盖防护布→用专用木块固定移动轮→长期不用时，应将输送机移入机械棚或其他指定位置。
（2）多机联动停机程序：从进料端开始，先停止进料，再停首台输送机，然后依次向后停止各台输送机。 全部停机后就按“正常停机程序”操作。 （3）故障停机程序：如果数机联动时，中间一台发生故障，应该先停止进料，迅速停止进料处的输送机，然后停止发生故障的输送机，退出联机，进行检修。立即用备用输送机替代故障输送机。 全部停机后就按“正常停机程序”操作。 三、注意事项 1、操作设备注意事项 （1）输送机移动至工作区域后，注意将输送机用专用木块（三角木楔）或砖块、石块固定移动车轮，防止输送机在作业时发生移动或挪位； （2）带式输送机要求空载启动，以降低启动阻力。整台输送机空载运行5分钟后，方可进料重载运行； （3）带式输送机一般不得满载启动。如遇特殊情况需满载启动，应先清除输送带上部分物料，再点动开机； （4）带式输送机工作时，所有的托辊都应转动，不能出现个别托辊不转的现象。如果有托辊不转，应及时停机，维修或更换托辊。 （5）普通橡胶输送带严禁与汽油、柴油、机油等油脂或有机溶剂类物质接触，以免输送带被腐蚀变形，影响正常使用。应经常对输送带进行检查，及时清除输送带表面粘附的粮粒或杂物； （6）要防止进料斗的导料挡板与输送带表面接触，导致输送带表面磨损。输送机进料应均匀且与输送带对中，防止偏载，引起输送带跑偏。 （7）停止进料后，必须将承载段上的粮食卸完后才能停车。 （8）伸缩带式输送机停车后，应将伸缩部分调整到最短长度。 （9）当输送设备露天放置时，操作人员应对其设备的电机、配电箱做好防水、防雨、防潮工作。或覆盖机械专用的防雨罩布。 2、操作人员注意事项 （1）移动带式输送机应指定固定人员操作，非指定（固定）人员不得开启操作输送设备，确保操作安全。
细胞冻存的方法与步骤
细胞冻存的方法与步骤文件编码（GHTU-UITID-GGBKT-POIU-WUUI-8968）
细胞冻存、解冻方法与细胞计数 江苏大学附属医院风湿科李晶??????〖〗 一、细胞冷冻保存 1.材料： 生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(SigmaD-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4％（w/v）trypanblue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII) 2、冷冻保存方法： （1）传统方法:冷存管置于4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-80℃16～18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase长期储存。 -20℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 （2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。 3、步骤： （1）冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。 （2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMSO）至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。 （3）离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。 （4）取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5～10％），使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1～2ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。
仓库管理员安全操作规程
仓库管理员安全操作规程 一：目的： 为了保障仓库货品保管安全、提高仓库工作效率和物资安全规范，确保本公司的物资储运安全。=：范围： 仓库和理货区。 三：内容： 1、严格遵守公司和部门各项规章制度。非物控室和仓管室员工不得进入仓库，因工作需要的其它人员经请示上级同意后，在仓管员的陪同下方可进入仓库，任何进入仓库的人员必须遵守仓库管理制度。 2、非物流部员工不得进入理货区，因工作需要的其它人员经请示上级同意后，在理货员的陪同下方可进入理货区；物流部配送人员在进入理货区后，及时完成各配送线路的包装箱交接清点和单据签收工作，任何进入理货区的人员必须遵守仓库管理制度。 3、所有人员不得携带能够容装手机或配件的包装物品（如手提包、纸袋等）进入仓库和理货区，因工作需要携带，在出仓库时必须接受仓管员或理货员的检查。 4、任何人员不得在仓库和理货区内吸烟。 5、仓管员、理货员不得将水杯、饭盒、零食等东西带入到仓库或理货区，更不得在仓库或理货区内吃东西。 6、服从上级的工作安排，并按时保质保量完成上级交待的任务。 7、严格执行仓库的货物保管制度。
8、仓管员、理货员必须全面掌握仓库所有货物的贮存环境、堆层、搬运等注意事项，以及货品配置（包括礼品等）、性能和一些故障及排除方法。 3.2．3、理货员对所有入库货物的质量进行严格检查和控制。 3.2．4、贮存在仓库的货物，按照货物的品牌、型号、规格、颜色等分区归类整洁摆放，在货架上作相应的标识，并制作一个《仓库货物摆放平面图》，张贴仓库入口处。 3.2．5、同类型的货物，不同批次入库要分开摆放，发放货物时，要按照先进先出的顺序原则出库。 9、严格遵照货物对仓库的贮存环境要求（如：温、湿度等）进行贮存保管，定时对货物进行清洁和整理。 10、保证仓库环境卫生、过道畅通，并做好防火、防潮、防盗等安全防范的工作，并学会使用灭火器等工具，每天下班前必须检查各种电器电源等安全情况。 11、仓管员按照财务要求及时地记录好所有货物进出仓的账目情况，每天做好盘点对数工作，保证账目和实物一致。 12、仓管员、理货员不得挪用、转送仓库内的任何物品，其他人员需要到仓库借用货物，必须经过本部门负责人在借条上批准后才能让其借走。 13、仓库、理货区、包装箱及其它贵重物品的专柜锁匙由各组长保管，不得转借、转交他人保管和使用，更不得随意配制。 14、严格执行货物进出仓库规程。 15、严格执行仓库的货物进出仓的运作流程，确保仓库区域的货物的贮存安全。 16、理货员在收发时请参照《理货规程》。 17、仓管员在接到理货员入库通知时，按照入库单与理货员做好货物清点交接工作，并在入库单上签字确认。
细胞冻存和复苏实验
实验步骤一、材料准备 1. 仪器：净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培养箱、液氮冰箱。 2. 玻璃器皿：吸管（弯头、直头）、培养瓶、玻璃瓶（250ml、100ml）、废液缸。 3. 塑料器皿：吸头、枪头、胶塞、移液管（10ml）、15ml离心管、冻存管（1～2ml）。 4. 其他物品：微量加样枪、红血球计数板、记号笔、医用橡皮膏、移液枪。 5. 试剂：D-Hanks液、小牛血清、培养液、双抗（青霉素、链霉素）、胰蛋白酶（0.08%）、1NHCl、7.4%NaHCO3、DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油。 二、细胞冻存 1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液。 2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中。 3. 离心1 000 rpm，5 min。 4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml。 5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml。 6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者。 7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2 h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。 三、细胞复苏 1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。 2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀。 3. 离心，1 000 rpm，5 min。
细胞复苏、传代、冻存过程
一、细胞培养（复苏、换液、传代、冻存）（已正） 进行细胞培养前，将所用物品放入超净台中，打开紫外开关，照射20-30分钟。紫外结束后，打开鼓风，使超净台自净5-10分钟左右后开始操作。 1.细胞培养液的配制： 配制50ml培养液(45ml基础培养液+5ml的胎牛血清+500ul的青霉素/链霉素)（如果基础培养基中自带青/链霉素就无需添加） 2.细胞复苏： 将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴，不停地晃动使其迅速溶解，大约1min。将溶解好的细胞冻存管喷上75%的乙醇消毒后拿到超净台中，用1ml的无菌大枪头将其混匀后转移至无菌的15ml离心管中，这时向其中缓慢滴加配好的培养液2ml，混匀，1000rpm, 3分钟。然后弃掉上清，加入1ml配制好的培基使沉淀的细胞重悬。在T25的培养瓶中加入4ml配好的培养基，然后用1ml无菌的大枪头将重悬好的细胞转移至T25瓶内，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将T25取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。（将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴，不停地晃动使其迅速溶解。1000rpm, 离心3分钟。弃掉上清，然后加入1ml配置好的培养基使沉淀的细胞重悬。此时将其转移到T25瓶内，再加入4ml配好的培养基，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将T25取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。） 3.细胞换液： 复苏的细胞在37℃ 5%CO2的孵箱内孵育4-6个小时后就应该给细胞换液，去除未贴壁的死细胞（贴壁生长的细胞）。贴壁生长的细胞具体过程如下：将原培养基弃去，然后用高压无菌的PBS冲洗1-2次，每次3-5ml，最后一次洗完后倒掉瓶内残余的PBS，小心的用1ml无菌的大枪头加入5ml新鲜培养基，喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。悬浮生长的细胞具体过程如下:将培养瓶内的培养液混匀，用1ml无菌的大枪头将培养液小心的转移至15ml 无菌的离心管中，1000rpm,3分钟去上清，加入1ml配制好的培基使沉淀的细胞重悬。在T25的培养瓶中加入4ml配好的培养基，然后用1ml无菌的大枪头将重悬好的细胞转移至T25瓶内，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将T25取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。 4.细胞传代： 当细胞生长到80%-90%时，其的生长状态和细胞形态都比较好时，即只要判断细胞处于生长对数期，这时就可以进行细胞传代了。贴壁生长的细胞具体过程如下：将原培养基弃去，然后用高压无菌的PBS冲洗1-2次，每次3-5ml，最后一次洗完后倒掉瓶内残余的PBS，小心的用1ml无菌的大枪头加入1ml 0.25%胰酶消化，放入孵箱，1-2分钟后取出，在倒置显微镜下观察细胞形态变化，如果观察到细胞开始由长梭形变成圆球形时，喷上75%的乙醇，拿到超净台里，加入2ml培养基终止消化，用1ml无菌的大枪头或无菌的塑料吸管反复吹打，尽
仓库装卸搬运工安全操作规程
仓库装卸搬运工安全操 作规程 Company Document number：WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998
装卸搬运工安全操作规程 1、严格遵守易燃、易爆及化学危险物品装卸运输的有关规定。装卸粉散材料及有毒气散发的物品，应配戴必要的防护用品。 2、工作前应认真检查所用工具是否完好可靠。不准超负荷使用。 3、装卸时应做到轻装轻放，重不压轻，大不压小，堆放平稳，捆扎牢固。 4、人工搬运、装卸物件应视物件轻重配备人员。杠棒、跳板、绳索等工具必须完好可靠。多人搬运同一物件时，要有专人指挥，并保持一定间隔，一律顺肩，步调一致。 5、堆放物件不可歪斜，高度要适当。对易滑动件要用木块垫塞。不准将物件堆放在安全道内。 6、用机动车辆搬货物时，不得超载、超高、超长、超宽。如遇必须超高、宽、长装运时，应按交通安全管理规定。要有可靠措施和明显标志。 7、装车时，随车人员要注意站立位置。车辆行驶时，不准站在物件和前栏板之间。车未停妥不准上下。 8、装卸货物应挂规定吊点。起吊装箱件时应先检查箱体底脚是否牢固完好，按吊线标志吊挂，并经试吊确认稳妥后方能起吊。 9、使用卷扬机、钢管滚动滑移货物时，要有专人指挥。路面要坚实平整，绳索套结要找准重心，保持直线行进，有棱角快口部位应设垫衬，卸车成下坡应加保险绳，货物前后和牵引钢丝绳边不准站人。
10、装运易燃易爆化学危险物品严禁与其他货物混装。要轻搬轻放，搬运场地不准吸烟。车厢内不准坐人。 11、装卸时，应根据吊位变化，注意站立位置。严禁站在吊物下面。 12、铁路车辆装运物件，不得超过车厢允许高度和宽度。铁路两侧一米五以内。不得堆放装卸物件，不准在车厢底下或顶上休息。 13、在高栏板车厢装卸货物起重驾驶员无法看清车厢内的指挥信号时，应设中间指挥，正确传递信号。 1．工作场地和库房严禁烟火。操作者应熟悉灭火器材的位置和使用方法。 2．要保持工作环境的卫生与通风。浸漆、喷漆量较大的连续作业线，必须安设抽风罩和废漆处理装置。操作时必须戴防毒口罩或通风面具。 3．高处作业应扎好安全带，防止滑跌。工具、漆桶要稳妥放好。在容器内作业，必须采取有效通风措施或戴通风面具。 4．在油漆作业场所10米以内，不准进行电焊、切割等明火作业。 5．需油漆、喷漆的工件，应放置稳固，摆放整齐。 6．带电设备和配电箱周围一米以内，不准喷漆作业。在装配试车地点进行工作，要间隔一定距离。严禁在运转的设备上刷漆或喷漆。装配输送线上的产品或悬链上的工件喷漆时，应在喷漆室内进行。操作时，必须戴好口罩或面具。
仓储作业安全操作规程
山东蓬莱国家粮食储备库 仓储作业安全操作规程 一、一般要求 1、严禁酒后作业。 2、进行高处作业（坠落高度基准面≥2米）时，保证不少于3人同时进行，系好安全带，确保作业安全和人身安全 3、作业人员进入作业现场后必须遵守储备库的各项规定，进入作业区内的人员必须注意安全防火，不准携带火种、易燃易爆品进入作业点，禁止吸烟；禁止穿着带铁掌或铁钉的鞋子进入作业点。各类人员在作业现场接打手机、使用对讲机时，必须在粉尘无法达到的位置使用。 4、严格遵守粮库的各项制度管理，杜绝在库区和作业现场吸烟和使用明火，加强用电管理，防止火灾事故发生。 5、维护消防设施，熟练使用消防器材，自觉履行报告火警义务。 6、维护社会稳定和社会治安秩序，自觉遵纪守法。 7、正确操作使用机器、设备、工具、安全装置、防护用品用具及材料等，注意设施设备等是否处于良好状态，并消除一切可能引起的伤亡因素。 8、保持工作地点的安全卫生，并保持成品、半成品材料、原材料、工具及废料的合理摆放。 9、有权杜绝执行“三违”，即“违章指挥、违章操作、违反劳动纪律”的指令。有权劝阻、纠正他人的不安全行为，有权拒绝不符合安全要求或违反规章制度的指挥、调试及安排。
10、遵守安全生产管理制度、操作规程和设备维护保养制度，不违章作业，冒险蛮干。 11、装粮作业应按设计要求不得超越设计的允许的装粮高度。如果装粮时超过了安全装粮线继续堆粮，会使平房仓墙体产生超载容易导致平房仓墙体开裂发生安全事故。 12、正确穿戴和使用劳动保护用品用具。 13、正确分析、判断和处理各种事故隐患，把事故消灭在萌芽状态。如发生事故，要正确处理，及时、如实地向上级报告，并保护现场，作好详细记录。 14、积极参加各项安全生产活动，关心安全生产情况，向领导或有关部门提出合理化建议或意见。 15、积极参加事故预防和抢险工作。 二、平房仓储粮操作过程中主要事故预防 1、操作人员进入仓进行出仓检查时，要远离正在出粮门上的出粮孔，否则一旦误操作，有可能将正好在粮门附近的操作人员埋入粮堆内，造成人员伤亡事故。即使在停止出粮作业的情况下，经长时间储存的粮食能局部结拱、结块，当部分粮食从档粮门已出仓情况下可使下部形成空洞，操作人员入仓进行粮情检测时，即使在停止装卸作业的情况下，也可能将操作人员不慎埋入粮堆内，造成人员伤亡事故。 人员从仓顶进仓作业时，必须遵循以下规定: a) 应备有扶梯、站人护栏、软梯、安全带、吊篮等安全防护设施; b) 应先打开仓顶通风口，启动轴流风机，确认仓内不处于缺氧状态，熏蒸后药剂残留量已达到安全要求后，人员方可进仓;
细胞冻存和复苏标准操作规程(SOP)
细胞冻存和复苏标准操作规程(SOP) 背景知识： 细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特*都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。 原理： 细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透*，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。 主体内容（操作步骤）： 一、材料 （一）仪器 1. 净化工作台 2. 离心机 3. 恒温水浴箱 4. 冰箱（4℃、-20℃、-70℃） 5. 倒置相差显微镜 6. 培养箱 7. 液氮冰箱 （二）玻璃器皿 1. 吸管（弯头、直头） 2. 培养瓶 3. 玻璃瓶（250ml、100ml） 4. 废液缸 （三）塑料器皿 1. 吸头 2. 枪头 3. 胶塞 4. 移液管（10ml） 5. 15ml离心管 6. 冻存管（1～2ml） （四）其他物品 1. 微量加样枪 2. 红血球计数板 3. 记号笔 4. 医用橡皮膏 5. 移液枪 （五）试剂 1. D-Hanks液
2. 小牛血清 3. 培养液 4. 双抗（青霉素、链霉素） 5. 胰蛋白酶（0.08%） 6. 1NHCl 7. 7.4%NaHCO3 8. DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油 四、操作步骤 （一）细胞冻存 1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液； 2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、； 3. 离心1000rpm，5min； 4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml； 5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml； 6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者； 7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/ min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。（二）细胞复苏 1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。 2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀； 3. 离心，1000rpm，5min； 4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养； 5. 次日更换一次培养液，继续培养。 五、注意事项 1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液； 2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤； 3．冻存和复苏最好用新配制的培养液。
细胞冻存的方法与步骤
细胞冻存、解冻方法与细胞计数 江苏大学附属医院风湿科李晶〖返回主页〗 一、细胞冷冻保存 1、材料： 生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(Sｉｇma D-2６５0）、无菌塑料冷冻保存管(Naｌgene 5０0０—00２0)、0、４％（w／ｖ)tryｐan blue(GibcoBＲL1５250-061）、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KＲYＯ10Sｅri ｅsIＩ) 2、冷冻保存方法： （１)传统方法：冷存管置于4℃１0分钟－--＞-20℃3０分钟--－>-80℃１6~18小时（或隔夜)——->液氮槽ｖaｐorphａsｅ长期储存. -20℃不可超过１小时,以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入—80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。 (２）程序降温:利用已设定程序得等速降温机以—１～-3℃／分钟之速度由室温降至（－8０℃以下）-12０℃，再放在液氮槽vａｐｏrphａｓｅ长期储存。适用于悬浮型细胞与hybｒidoｍａ之保存。 ３、步骤： （1）冷冻前2４－4８小时更换半量或全量培养基,使细胞处于指数生长期。 （2)配制冷冻保存溶液（使用前配制）：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMＳO）至20％浓度,即制成双倍得冻存液，置于室温下待用。 (3）离心收集培养之细胞，用加血清得培养基重悬起细胞,取少量细胞悬浮液(约０、1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。 （4）取与细胞悬液等量得冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管,制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5～10％），使细胞浓度为1～5×１0６cｅlls/ｍl，混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中，1~2mｌ/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测.严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。 4、注意事项: （１）欲冷冻保存之细胞应在生长良好（lｏgphase）且存活率高之状态，约为80~90%致密度。冷冻前检测细胞就是否仍保有其特有性质,例如hｙbrｉdoｍa应在冷冻保存前一至二日测试就是否有抗体之产生。
仓库管理操作规程
仓库管理安全操作规程 1、仓库内必须有明显的安全标志与标识。 2、仓库管理人员必须保证库存物资及仓库安全。无特定仓库管理人员，该仓库使用单位的第一负责人对其负责。 3、仓库管理人员必须通晓本库房存储物资的性能、特征、保管知识以及不能与之同库存放的其他物资的品名、性质、分类、保管等业务知识。必须熟悉安全防火制度，掌握消防器材的操作、使用及维护保养方法和报火警。 4、装卸物资的人员应对所装卸的物资有所了解，杜绝野蛮装卸，防止在搬运中发生物体伤人事故。使用机械装卸时，必须执行《起重机械作业》的有关规定。 5、装卸易燃易爆、化学危险物品时，必须轻拿轻放，严防震动、撞击、重压、摩擦、倒置、倾倒，以及因装卸器具摩擦碰撞产生火花造成危害。 6、装卸作业结束后，仓库管理人员必须对库区、库房进行检查，确认安全后，方可离人。 7、容易相互发生化学反应或灭火方法不同的物品。必须分间、分库储存，并在醒目处标明储存物品的名称、性能和灭火方法。 8、易自燃或遇水分解的物品；必须在温度较低、通风良好和空气干燥的场所储存，应定时检测，严格控制湿度与温度。 9、库存物品应分类，分垛、分货架储存，必须码放整齐牢靠。每垛占地面积不得大于100m；垛与垛间距不得小于1m；货架
与货架间距不得小于0.5m；垛、货架与墙、梁、柱间距不得小于0.5m；面对仓库门的主要通道宽度不得小于2m；严禁堵塞仓库门、主要通道和消防设施。 10、凡物品入库前，仓库管理人员必须认真检查有无火种等隐患，易燃易爆、化学危险物品的包装容器是否牢固、密封。如发现品名不符．包装容器破损、残缺、变形和物品变质、分解等情况时，必须及时进行安全处理。 11、仓库进出货物后，对遗留和散落在操作现场的危险品，要及时进行检查、清扫和处理。对使用过的油棉纱、油手套等沾油纤维物品以及拆除下来的可燃包装物，应当存放在安全地点，定期处理，不得在仓库内存放。 12、仓库内因物品防冻必须采暖时．应当采用水暖，其散热器、供暖管道与储存物品的距离不得小于0．3m。 13、仓库内的电器设备必须由持操作证的电工进行安装、检查和维护保养。电工必须严格执行各项电气操作规程和煎工安装标准。 14、仓库内的动力设备线路、照明线路必须按有关规定设计、安装和使用。严禁在仓库顶棚内敷设线路，严禁在仓库内乱拉临时线；禁止使用不合格的保险装置；电气设备和线路不得超过安全负载。 15、仓库内不得使用明火，碘钨灯、日光灯以及移动式灯具照明．只能使用不超过60W的白炽灯照明。照明灯具下方不准堆放物品。其垂直下方与储存物品间距不得小于0.5m。严禁将照
细胞培养传代冻存复苏操作规程自编
细胞培养程序 材料 A、仪器 1. 净化工作台， 2. 离心机， 3. 恒温水浴箱， 4. 冰箱（4℃） 5. 倒置相差显微镜， 6. CO2培养箱， 7. 振荡混合仪 8. 酶联免疫检测仪，9. 移液枪，10. 电磁力搅拌机，11. 微孔滤器 B、玻璃器皿 1. 吸管， 2. 小烧杯（100ml）， 3. 废液缸， C、塑料器皿 1. 吸头， 2. 枪头， 3. 96孔培养板， 4. 15ml离心管， 5. 50ml离心管， 6. 胶塞， D、其他物品 1. 微量加样枪， 2. 红血球计数板， F、试剂 1. D-Hanks液， 2. 小牛血清， 3. RPMI1640， 4. 双抗（青霉素、链霉素）， 5. 0.25%胰酶， 6.0.025% EDTA 7. 二甲基亚砜（DMSO）， 8. MTT溶液：称取250mgMTT，放入小烧杯中，加50ml培养液或平衡盐溶液在电磁力搅拌机上搅拌30min，用0.22um的微孔滤器除菌，分装，4℃保存备用，两周内有效。 一、原代细胞培养或细胞株（系）复苏培养： （一）细胞原代培养 1.贴壁细胞培养法： 1）、组织块培养法 将所取得的组织用含青霉素、链霉素400U/ml和400ug/ml的生理盐水漂洗2此，5分钟/次。取出组织尽可能的取出液滴，置青霉素小瓶中，加两滴小牛血清，用剪刀尽可能将其剪碎，用吸管将其泥状的组织点种在培养瓶壁，倒置于37°、5%CO2条件下30分钟后将培养瓶正置，从培养瓶的一端缓缓加入完全培养液（小
牛血清15%、青霉素、链霉素各100U、100ug/ml），使组织块有培养液与其接触为准，轻轻放置于37°培养。待24小时候补液。 或小块放置后,轻轻翻转培养瓶,使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在37℃温箱内。培养2~4小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败，若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养24小时后再补液，培养3~5天时可换液，一方面补充营养，一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。 其他方法：消化分离法、器官培养略 2.悬浮细胞培养法 对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。 （二）细胞株(系)细胞复苏培养 细胞复苏的主要操作步骤 (1)佩戴眼镜和手套，从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。 (2)迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化。 (3) 然后在无菌下取出细胞。冻存管用75%酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，再滴加10ml培养液。 (4)在1000r/min速度下离心5～10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养12～24小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。加入的培养液的量依冻存的细胞数量，如果冻存数量为106，则稀释10倍使细胞达到105即可。 注意事项 在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段(-5～0℃)。这样复苏的冻存细胞存活率高，生