RNA干扰综述
RNAi研究及其进展
公光业M110107259
前言
RNAi是真核生物中普遍存在的一种自然现象，是由双链RNA 启动的序列特异的转录后基因沉默过程，是生物体在进化中形成的一种内在基因表达的调控机制。1998年，Andrew Fire等首次在线虫中发现RNAi现象，后来大量的研究表明，RNAi广泛存在于真菌、植物和动物中。由此人们认识到RNAi技术作为研究基因功能的一种有力的革命性工具，在功能基因组、转基因动物研究、基因治疗、药物开发等方面有着巨大的潜力。RNAi被《Science》杂志评为2010年十大科学成就之一，2002年又名列《Science》杂志十大科学成就之首，成为分子生物学研究的热点。本文综述了该研究的最新进展。正文
RNAi的发现：
上世纪90年代，科学家们在进行生物遗传改良的研究中，发现靶生物体内产生了一种非期望的表型。最早报道的是在1990年美国科学家Jorgensen等,他们在增强矮牵牛花紫色的转基因研究中，得到的结果是转基因植株部分或完全开白花，表明色素合成途径被关闭而不是被加强。他们将这一现象称为共抑制(cosuppresion)，后来的研究者称之为转录后基因沉默。此后不久，科学家们开展了真菌中的RNAi 的研究。1994年，意大利的Cogoni在野生型粗糙链抱霉(Neurospora crassa)的转基因研究中，把抑自身和相应内源基因表达的基因沉默现
象称为消除作用(quelling或基因压制)。
1995年，Guo等利用反义RNA技术阻断线虫的par-1基因表达，发现无论是给线虫注射正义RN A还是反义RN A，都可以抑制特异基因（par-1）的表达，结果与反义RNA技术的传统机制正好相反。这种出乎意料的发现引起了各国科学家的注意，从此展开了RNAi在动物体内的研究。1998年，Frei在研究秀丽隐杆线虫基因沉默时，首次揭开了Guo遇到的悬疑：Guo遇到的正义RNA抑制基因表达现象，是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起的，并且还发现双链RNA能够比反义RN A或正义RNA更有效地关闭基因的表达，抑制基因表达的效率比单链RNA至少高2个数量级，他们称这种现象为RNAi。从此，一个新的基因功能研究领域诞生了，人们已在不同种属的生物中进行了广泛而深人的研究，结果不仅证实R- NAi现象存在于秀丽小杆线虫、植物、真菌、果蝇、锥虫、涡虫、水媳、斑马鱼、小鼠乃至人类等多种生物中，而且对RNAi的分子机制逐渐有了比较清晰的认识，植物中的“共抑制”和真菌中的“压制”，与动物中双链RNA诱导的RNAi具有高度保守的相似机制。
RNAi作用机制:
病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA （大约21～23 bp），即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作
用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。RNAi 发生于除原核生物以外的所有真核生物细胞内。需要说明的是，由于dsRNA抑制基因表达具有潜在高效性，任何导致正常机体dsRNA形成的情况都会引起不需要的相应基因沉寂。所以正常机体内各种基因有效表达有一套严密防止dsRNA形成的机制。
怀特黑德生物医学研究所的本杰明·刘易斯等研究人员发现小RNA能通过阻断蛋白质合成的方式调控基因表达。他们借助一个计算模型来确定小RNA和对应的基因，发现了miRNA控制很大一部分生命功能的证据。
研究人员比较了人类和狗、鸡、鼠的基因组，对这几个物种共有的蛋白质合成基因与miRNA寻求对应关系。结果发现，尽管这几个物种在3.1亿年前就开始“分家”各自进化，但它们基因
组中受miRNA调控的基因都占三分之一左右，而且这些基因在进化过程中都得以保存而未发生变化。刘易斯说，随着更多的基因组数据发布以及实验技术的进步，还可能发现更多的基因是由小RNA调控的。
3 RNAi作用的特点
3.1 高序列特异性
RNAi是转录后水平的基因沉默机制，有高度的序列特异性，19nt 的dsNRA几乎可以完全抑制基因的表达,而将其中的1nt突变掉后，它对基因的抑制作用就消失了，这种高度的序列特异性能够使dsRNA 能够非常特异地诱导与之序列同源的mRNA降解，避免降解与目的mRNA同家族的其他mRNA，从而实现对目的基因的精确沉默。因此，RNAi具有重大的医学价值。
3.2高效性
RNAi存在级联放大效应,由于Dicer酶切产生的siRNA与同源mRNA的结合并降解后者，产生新的siRNA，新产生的siRNA可再次与Dicer酶形成RISC复合体，介导新一轮的同源mRNA降解的多次利用，如此循环，使相对很少量的dsRNA分子(数量远远少于内源mRNA的数量)就能产生强烈的NRAi效应(每个细胞仅需几分子siRNA就可产生RNAi效应)，并可达到缺失突变体表型的程度。相比普通的siRNA，具有短发卡结构的双链RNA(short hairpin RNA,shRNA)产生的NRAi 效应更强。
3.3 RNAi抑制作用迅速
RNAi基因的表达发生在转录后，通过细胞质中同源mRNA的快速降解，最终使该基因缺少mRNA而无法产生蛋白质产物。
3．4 RNAi作用的靶基因位点有选择性
外源性dsRNA的转入只对成熟mRNA产生作用，对mRNA前体没有或很少具有影响，以内含子或启动子序列构成的外源dsRNA无法引起RNAi效应.
3.5具有高稳定性
与反义寡核昔酸不同,siRNA是3’端悬挂TT碱基的双链RNA,所以化学性质很稳定,无须像反义核昔酸那样进行广泛的化学修饰以提高半衰期。
3.6可传播性和可遗传性
RNAi抑制基因表达的效应可以越过细胞界限，在不同的细胞间长距离传递和维持。在线虫中干涉效应可以传递到子代，但这种遗传只限于子一代，子二代往往又恢复到野生型
3.7 RNAi效应的依赖性
只有连续输dsRNA，沉默效应才能持续下去，否则将产生短暂的沉默反应，而且这种效应的强度与初始dsRNA的浓度有关。
4 siRNA的设计与合成
RNAi技术在基因功能研究，以至于基因治疗方面显示出巨大的前景。双链siRNA的设计、合成是进行RNAi研究的关键。根据目前发表的文献和一些实验经验，siRNA的设计可遵循以下几点进行: (1)选择以碱基A或G开始的91-12碱基大小的目的mRNA。因为
RNA polyMeraseⅢ启动子只有在第一个转录碱基是嘌呤时才能起作用。（2）针对目的mRNA一般选择2-4个不同序列，CG含量为30%-50%，避免4个碱基T或A的连续序列，避免选择起始密码下游50-100碱基、终止密码上游100碱基以及5和3端的非编码区域，BLAST检查设计序列的特异性。(3)设计适当的实验对照，比如设计有1-2个碱基错配的序列，或者是随机变更siRNA的碱基排列顺序。
siRNA的制备方法有体外制备和体内表达，前者是在体外制备siRNA，然后导入细胞，而后者则导入DNA使之在细胞内表达siRNA。根据具体方法可进一步划分，下面分别予以介绍。
体外制备法包括：（1）化学合成这是最简单、快速的体外制备方法。目前有许多基因公司能提供多种siRNA的合成，但其价格昂贵，不适合筛选siRNA等长时间的研究。（2）体外转录通过合成得到DNA Oligo模版,应用试剂盒体外转录合成siRNA。相对化学合成法而言,这是一种性价比高的筛选siRNA的好方法.
体外合成法效率低,表达短暂,因此又发展了体内表达法。（1）RNaseⅢ消化长片断双链RNA制备siRNA
与其他制备方法相比,它不需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个最有效的siNRA。它选择200-1000Pb的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片段的dsNRA，然后应用RNaseⅢ(或Dicer)在体外消化,得到一个siRNA的混合体,除去未消化的dsRNA后,将siRNA 直接转染细胞,它能保证目的基因被有效抑制。
（2）siRNA表达载体
多数的siRNA表达载体依赖3种RNA聚合酶Ⅲ启动子（polⅢ）中的一种(目前常用的是人源和鼠源U6启动子或者人源H1启动子),操纵一段小的发夹siRNA在哺乳动物细胞中的表达。这种方法是合成2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火后，克隆到相应载体的pol Ⅲ启动子下游。siRN表达载体的优点在于可以进行长期研究。
（3）siRNA表达框架
siRNA表达框架(SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版,能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。这个方法包括一个NRA polⅢ启动子,一段发夹结构siRNA,一个RNA polⅢ终止位点。和siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、测序等的步骤,可以直接由PCR得到。因此，SECs成为筛选siRNA的最有效工具，甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的最适搭配。如果在PCR两端添加酶切位点，那么通过SECs筛选出的最有效的siRNA后,可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRN A和长效抑制的研究。
RNAi的应用
RNAi在探索基因功能中的应用：
人类基因组计划的完成标志着后基因组时代的来临。阐明人类基因组中功能基因表达产物的生物学作用对医学发展有着深远意义。在RNAi技术出现以前，基因敲除（gene knockout）是主要的反向遗传学（reverse genetics）研究手段，但其技术难度较高、操作复杂、周期长。由于RNAi技术可以利用siRNA或siRNA
表达载体快速、经济、简便的以序列特异方式剔除目的基因表达，所以现在已经成为探索基因功能的重要研究手段。同时siRNA表达文库构建方法的建立，使得利用RNAi技术进行高通量筛选成为可能，对阐明信号转导通路、发现新的药物作用靶点有重要意义。RNAi在基因治疗领域中的应用：
RNAi作为一种高效的序列特异性基因剔除技术在传染性疾
病和恶性肿瘤基因治疗领域发展极为迅速。在利用RNAi技术对HIV-1、乙型肝炎、丙型肝炎等进行基因治疗研究中发现，选择病毒基因组中与人类基因组无同源性的序列作为抑制序列可在抑制病毒复制的同时避免对正常组织的毒副作用。同时将抑制序列选择在特定的位点，可对部分有明确基因突变的恶性肿瘤细胞如含有BCL/ABL或AML1/MTG8融合基因的白血病细胞产生凋亡诱导作用。此外尚可通过使用肿瘤特异性启动子如hTERT启动子、survivin启动子或组织特异性启动子如酪氨酸酶启动子、骨钙素启动子引导针对某些癌基因或抗凋亡分子的siRNA或shRNA表达，从而达到特异性杀伤肿瘤细胞的目的。
RNAi在整形外科领域的应用前景：
已证实N-Ras或BRAF的激活型突变是引发黑素瘤的主要病因，其中66%的病例为BRAF激酶作用域突变。而约80%的BRAF
突变病例是因胸腺嘧啶突变为腺嘌呤造成第599位的缬氨酸突变为谷氨酸所致。使用RNAi技术剔除黑素瘤细胞的BRAF表达，不
仅抑制了肿瘤细胞生长，而且减弱了其侵袭能力，为黑素瘤基因治疗奠定了基础。
最近研究表明趋化因子受体CXCR4是乳腺癌转移的重要调节因素，其配体CXCL12可趋化肿瘤细胞并调节其增生和侵袭特性。使用RNAi干扰技术剔除CXCR4证实该分子为原位移植肿瘤生长和转移所必需。此外，剔除BCRP表达可以逆转其介导的肿瘤耐药。
瘢痕疙瘩是一种较为难治的疾病，目前尚无有确切疗效的治疗方法。使用特异性siRNA剔除TGF-βII型受体表达可以抑制角膜成纤维细胞表达纤维粘连蛋白并降低其迁移能力。剔除CTGF
表达可使皮肤成纤维细胞内I型和III型前胶原蛋白、碱性成纤维细胞因子、组织金属蛋白酶抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）-1，TIMP-2和TIMP-3等基因表达水平降低。这些结果提示TGF-β信号转导通路和CTGF均可能是瘢痕疙瘩治疗的潜在靶点。
病毒性疾病的治疗：
加州大学洛杉矶分校和加州理工学院的研究人员开发出使用RNAi技术来阻止艾滋病病毒进入人体细胞。这个研究小组设计合成的lenti病毒载体引入siRNA，激发RNAi使其抑制了HIV-1的coreceptor-CCR5进入人体外周T淋巴细胞，而不影响另一种HIV-1主要的coreceptor-CCR4，从而使以lenti病毒载体为媒介引导siRNA进入细胞内产生了免疫应答，由此治疗HIV-1和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加。RNAi还可应用于其它病毒感
染如脊髓灰质炎病毒等，siRNA已证实介导人类细胞的细胞间抗病毒免疫，用siRNA对Magi细胞进行预处理可使其对病毒的抵抗能力增强。在最近全世界约30个国家和地区散发或流行的严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)的防治研究中，RNAi也受到了重视。siRNA在感染的早期阶段能有效地抑制病毒的复制，病毒感染能被针对病毒基因和相关宿主基因的siRNA所阻断，这些结果提示RNAi能胜任许多病毒的基因治疗，RNAi将成为一种有效的抗病毒治疗手段。这对于许多严重的动物传染病的防治具有十分重大的意义。
遗传性疾病的治疗：
美国西北大学的Carthew R W和日本基因研究所的Ishizuka A等人发现RNAi同脆性X染色体综合征（与FMR-1基因异常有关的导致智力低下的染色体病）之间的关系密切，揭示了与RNAi
相关机制的缺陷可能导致人类疾病的病理机制。遗传性疾病的RNAi治疗成为当今研究RNAi的又一大热点。
肿瘤病的治疗：
肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结果，传统技术诱发的单一癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长，而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的
保守序列这一特性，设计针对这一区段序列的dsRNA分子，只注射一种dsRNA即可以产生多个基因同时剔除的表现，也可以同时注射多种dsRNA而将多个序列不相关的基因同时剔除。Maen等应
用RNAi技术成功地阻断了MCF7乳腺癌细胞中一种异常表达的与细胞增殖分化相关的核转录因子基因Sp1的功能。尽管化疗能有效消灭肿瘤细胞，却不能有效的靶向肿瘤细胞，因此，在治疗过程中导致很多正常细胞的死亡，实现靶向肿瘤细胞同样也是以RNA 干扰为基础的肿瘤治疗的重要发展方向。目前已有很多针对不同基因的RNA干扰在体内和体外有效的抑制了肿瘤细胞的生长，这些目的基因包括：B c l-2 、survivin、EGFR、VEGF 等。RNA 干扰代替传统反义核酸进行转录后基因沉默，能高效地特异性抑制目的基因。与传统的方法相比，R NA 干扰技术设计更简便、作用迅速、效果明显，其技术优势还在于能根据不同病情，设计个体化治疗方案。
在植物学中的应用：
Napoli等将1个查尔酮合成酶基因(chs)置于1个强启动子后导人矮牵牛(Petunia hybrida)，试图加深花朵的紫颜色。结果部分花的颜色并非期待中的深紫色，而是形成了花斑状甚至白色，而且这种性状可以遗传。因为导入的基因和其同源的内源基因同时都被抑制，他们将这种现象命名为共抑制(co-suppression)。类似的结果同样在真菌脉胞菌(Neurospora crassa)中和其它转基因植物中存在。对于部分转基因植物来说，基因沉默可能是因为特异基因的甲基化而导致，这被称为转录水平基因沉默。但确实部分植物中的基因沉默是在转录后发生的，这被称为转录后基因沉默。实验表明在发生PTGS的个体中同源转录确实存在，但是
很快在胞浆中被降解，没有积聚。Palauqui等进一步证实，在植物中将出现转基因沉默的植株嫁接到另一没有基因沉默的转基因植株中同样可以导致PTGS，但对非转基因植株却无效。 Cogoni 等证实PTGS由一种可扩散的反式作用分子所介导。
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RNA干扰作用原理及其应用
RNA干扰作用原理及其应用 【摘要】 RNA干扰是基因转录后沉默的一种方式，是生物界古老而且进化的高度保守的现象之一。RNAi是通过siRNA介导的特异性高效抑制基因表达途径，由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA。RNAi具有生物催化反应特征，反应中需要多种蛋白因子以及ATP参与。RNAi在基因功能研究和基因药物应用具有广泛的前景。 【关键词】 RNA干扰 siRNA dsRNA RNA诱导的沉默复合体 Argonaute RNA聚合酶III 启动子 【Abstract】 RNA interference(RNAi) in diverse organisms reveals the same highly conserved mechanism with an ancient is the mode of sequence-specific post-transcriptional gene silencing in animals and plants initiated by homologous double-stranded
RNA(dsRNA).The discovery of RNAi and the molecular mechanism will help us apply it to study the gene function and exploit the gene drug. 【Key words】 RNA interference(RNAi) small interfering RNA(siRNA) double-stranded RNA(dsRNA) RNA-induced silencing complex(RISC) Argonaute pol III 1 背景 20 多年前，在对矮牵牛进行的研究中有个发现：Rich Jorgensen和同事将一个能产生色素的基因置于一个强启动子后，导入矮牵牛中，试图加深花朵的紫颜色，结果没看到期待的深紫色花朵，多数花成了花斑的甚至白的。因为导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制，Jorgensen将这种现象命名为协同抑制。在真菌中也有类似的现象，1996年就在脉孢菌属(Neurospora)发现这
RNA干扰实验
RNA干扰实验 一、磷酸钙转染法 【实验原理】 磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙-DNA复合物的一种将DNA导入真核细胞的转染方法。磷酸钙有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞，被转染的DNA可以在细胞内进行瞬时表达，也可整合到靶细胞的染色体上从而产生不同基因型和表型的稳定克隆。该方法可广泛用于转染许多不同类型的细胞。【仪器、材料和试剂】 （一）仪器、用具 CO2培养箱、10cm细胞培养平板、巴斯德吸管、微量移液器、15ml锥形管、烧杯、量筒等。 （二）材料 呈指数生长的真核细胞BALB/c 3T3 CsCl纯化的表达质粒DNA （三）试剂 1．完全培养液 DMEM 90ml FCS 10ml 2．2M CaCl2，过滤除菌，-20℃保存备用 3．2×HEBS (g/500ml) NaCl 8.0 KCl 0.38
Na2HPO4.7H2O 0.19 HEPES 5.0 葡萄糖1.0 用NaOH调pH至6.95，过滤除菌后，-20℃保存备用。 【方法与步骤】 1．在10cm的培养板上接种1×106个BALB/c 3T3细胞 第二天进行转染 2．准备CaPO4沉淀 2.1 准备两组试管 在A管中加入：15μg质粒DNA 69μl 2M CaCl2 460μl重蒸水 在B管中加入：550μl 2×HEBS 2.2 用巴斯德吸管将A管中的溶液缓慢地逐滴加入在B管中，同时用另一吸管吹打B管溶液，整个过程需缓慢进行，至少需持续1～2min。 2.3室温静置30min，出现细小颗粒沉淀。 3. 小心地将沉淀逐滴均匀地加入培养细胞的10cm平板中，轻轻晃动（此过程需尽快完成）。 4. 在5%CO2的加湿培养箱中培养细胞2-6 hr。 5. 除去培养液，加入10ml完全培养液培养细胞1-6天（依具体情况而定）。 6. 收集细胞进行基因活性的检测，或分散接种到其他培养皿中进行选择培养。 【注意事项】 1．在整个转染过程中要保持无菌操作。
RNA干扰(Entranster)
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是近年来生命科学领域最为重大的发现之一。它是指小分子双链RNA可以特异性地降解或抑制同源mRNA表达,从而抑制或关闭特定基因表达的现象。人们只要知道了某种疾病的致病基因，就可以设计出针对该基因mRNA的小分子干扰RNA（Small interfering RNA，siRNA），抑制或封闭该致病基因的表达，从而达到治疗疾病的目的。显然，在理论上，通过siRNA几乎可以治疗所有的疾病，包括肿瘤、传染病、遗传性疾病等等，因而RNAi受到学术界普遍的关注，是目前最为热门的生命科学研究领域，也是未来最有发展前途的新药开发领域。除此之外，RNAi技术还可以广泛应用于农业、林业、畜牧业和渔业等多种领域，进行良种培育、良种筛选和疾病治疗等。可见，RNAi的应用非常广泛，具有巨大的市场发展空间。但是，由于RNAi现象刚被发现不久，仅仅才14年的时间，无论国外还是国内，目前都缺乏有效的siRNA载体，这大大制约了RNAi的应用，包括实验研究和药物开发。目前市场上主流的siRNA转染试剂是脂质体类的转染试剂，它能将siRNA转染入多种体外培养的细胞株，但原代细胞、悬浮细胞的转染效果不是很好。由于它是脂质体类的转染试剂，因而对培养细胞有一定毒性。而英格恩生物独辟蹊径，转染载体的材料不是用传统的脂质体，而是纳米聚合物材料。这种材料对细胞几乎没有毒性，转染效率在多数细胞株都可达到90%以上，在很多原代细胞中，转染效果也比较好。更为难得的是，该公司的体内RNA转染试剂Entranster-in vivo，和核酸混合后，便可注射进动物体内，完成动物体内RNA干扰实验，十分便捷，是动物体内RNA干扰实验的新创举。
关于RNA干扰的综述
关于RNA 干扰的综述 一、相关概念 基因沉默：通过人工手段使基因的最终产物无法表达。分为转录前水平的基因沉默和转录后水平的基因沉默（TGS 和PTGS ）。 TGS 是指转基因在细胞核内RNA 合成受到了阻止而导致基因沉默，例如转基因植物体内特定基因的甲基化，导致 无法转录。 PTGS 则是指转基因能够在细胞核里被稳定地转录，但在细胞质里却无相应的mRNA 存在这一现象。 反义RNA ：反义RNA 是指与mRNA 互补的RNA 分子，也包括与其它RNA 互补的RNA 分子。由于核糖体不能翻 译双链的RNA ，所以反义RNA 与mRNA 特异性的互补结合, 即抑制了该mRNA 的翻译。该技术属于 上述的PTGS 。 二、发现简史 上个世纪末，反义RNA 作为一项基因治疗 的新技术引起不少研究人员的兴趣，然而在一 些实验中发生了一些有趣的现象：向细胞中导 入与目的mRNA 序列相同的正义RNA 和与之 互补的反义RNA 一样，可以产生阻断mRNA 翻译的效果。这与传统的反义RNA 技术相悖。 之后人们发现，将双链RNA （dsRNA ，由 正义RNA 和反义RNA 结合而成）注入，诱发了 比单独注入二者之一都要强得多的基因沉默。之 后也证实纯化的正义RNA 没有诱导作用，而反义 RNA 的诱导作用也很小，而之前正义RNA 引发 基因沉默的实验结果也被证实是由于其中受到了 微量dsRNA 的污染。（如右图T1、T2所示） T1（上）T2（下）
三、原理与应用 概述：细胞由于进化的机理，有一套降解双链RNA的酶系统（抗病毒感染）。RNAi就是利用这一系统，人工引入一段和目标RNA互补的序列，这样，在细胞内形成双链RNA，诱发降解机制。使目标RNA降解，无法被进一步翻译了。 具体过程： 第一步（起始阶段）：是较长ds RNA在ATP参与下被 RNaseⅢ样的特异核酸酶切割加工成21~23nt的由正义和反义 链组成的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）。siRNA 的两条单链末端为5’－磷酸和3’－羟基，且3’端均有２~3 个突出的核苷酸。果蝇中的RNaseⅢ样核酸酶称为Dicer。 第二步（效应阶段）是siRNA 在ATP参与下被RNA解旋 酶解旋成单链，并由其中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合 体(RNA-induced silencing complex，RISC)。在ATP酶的作用 下，活化的RISC以单链siRNA为向导识别同源性的单链靶mRNA，并在距离RISC的3’端11个碱基位置切割靶mRNA，导致靶基因的沉默。（RISC由siRNA、解旋酶、ATP、核酸内切酶、核酸外切酶等多种成分组成。） 此外，siRNA不仅可引导RISC切割靶mRNA，而且可以以siRNA 作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶mRNA为模板合 成新的dsRNA ，它在Dicer酶的作用下也被裂解，生成大量的次级siRNA。 形成一种链式反应，使特定的基因表达被阻止。这解释了上述实验中表现 出的dsRNA的微量性和高效性。 RNAi 作用的高度特异性有可能特异地抑制致病的突变等位基因，但 又不影响正常的等位基因。同时，肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调 控异常的结果，传统技术诱发的单个癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转
(整理)rna干扰.
RNA干扰（RNAi）实验原理与方法 近年来的研究表明，将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RN A(dsRNA)导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被称为R NA干扰（RNAi）。一、RNAi的分子机制 通过生化和遗传学研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶段，加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。证据表明；一个称为Dicer的酶，是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP 依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。 在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活RISC需要一个A TP依赖的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer 的RNA酶。 另外，还有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt 长的片段,这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化,从而使启动子失去功能,使其下游基因沉默. 二、如何进行RNAi试验 (一)siRNA的设计 1. 在设计RNAi实验时，可以先在以下网站进行目标序列的筛选： https://www.360docs.net/doc/539135045.html,/business/products/order2.htm https://www.360docs.net/doc/539135045.html,/techlib/misc/siRNA_finder.html https://www.360docs.net/doc/539135045.html,/Stu/shilin/rnai.html https://www.360docs.net/doc/539135045.html,/rnadesign/default.aspx?SID=45358710 2.RNAi目标序列的选取原则： (1)从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3
RNA干扰设计
什么是siRNA和RNAi 双链RNA经酶切后会形成很多小片段，称为siRNA,这些小片段一旦与信使RNA(mRNA)中的同源序列互补结合，会导致mRNA失去功能，即不能翻译产生蛋白质，也就是使基因“沉默”了。 RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是由双链RNA引发的转录后基因静默机制，它通过生物体内siRNA介导识别，特定RNA水解酶参与，并靶向切割同源性靶mRNA。实现RNA干扰现象是真核生物中普遍存在的抵抗病毒等外来入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制。目前RNA干扰技术已成功用于基因功能和信号转导系统上下游分子相互关系的研究。随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，大量的论文被发表，成百上千的专利被授权或递交申请，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具以及新药开发的诱人前景，RNAi也越来越为人们所重视。 RNAi技术发展历程 1998：植物基因中基因沉默现象的发现 2000：哺乳动物细胞中基因沉默的实现 2001：被《科学》评为当年十大科技突破之一 2003：动物体内观察到RNA干扰作用 2004：在恒河猴上的SARS病毒研究取得进展 2004：Acuity Pharmaceutical 第一个RNA干扰药物申请IND 2004：siRNA Therapeutics 第一个RNA干扰药物申请IND 2005：第一个RNA干扰药物进入一期临床，取得良好的效果 2005：化学修饰的siRNA oligo 体内系统给药取得突破 2006：诺贝尔医学奖授予两美国RNAi技术专家 2007：美国卫生研究院（NIH）组建首个RNAi委员会，旨在为NIH 的科学主管给出有关如何尽可能改善他们对RNAi 技术的评估 截止2008年：已有七项核酸干扰药物项目在美国进入临床试验，其中，有一项药物已经推入到第III期临床试验 RNAi 2006诺贝尔医学奖述评 ——年轻的获奖者—— 2006年10月2日，现年47岁的Andrew Z. Fire和45岁的Craig C. Mello由于在RNAi(RNA interference，RNAi)及基因沉默现象研究领域的杰出贡献而今年诺贝尔医学奖获得者，且获奖日期距其研究发表仅8年时间，获奖速度之快亦令人叹为观止。颁奖委员会评价：“他们发现了控制基因信息流通的基本机制，解释了困惑这一研究者们许久的难题。”“像在清晨突然打开窗帘，然后一切都一目了然了”。 —— RNAi的殊荣—— 2001年，随着人类基因组测序的完成，针对其它多种生物的基因组测序计划也相继开展起来。在未来的一段时间内，科学界将不会出现比人类基因组测序更瞩目的技术。有人将人类基因组测序称为“21世纪科学发展史上的里程碑”、“生物学领域最重要的成就之一”。然而时隔不久，同一年在哺乳动物中发现的RNAI掀起了一场风暴，而且愈演愈烈。《Science》杂志将RNAi称为“2002年的重大突破”(Couzin，2002)。然而，更加令人吃惊和兴奋的是，4年以后的今天，Andrew Fire和Craig Mello就因此获得2006年诺贝尔医学奖。一项全新的技术在提出后短短几年就得到诺贝尔奖的青睐和肯定，此前是绝无仅有的，这也足见RNAi在医学领域的开创性意义和极大的应用前景。 —— RNAi的机制——
RNA干扰步骤
一、磷酸钙转染法 【实验原理】 磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙-DNA复合物的一种将DNA导入真核细胞的转染方法。磷酸钙有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞，被转染的DNA可以在细胞内进行瞬时表达，也可整合到靶细胞的染色体上从而产生不同基因型和表型的稳定克隆。该方法可广泛用于转染许多不同类型的细胞。 【仪器、材料和试剂】 （一）仪器、用具 CO2培养箱、10cm细胞培养平板、巴斯德吸管、微量移液器、15ml锥形管、烧杯、量筒等。 （二）材料 呈指数生长的真核细胞BALB/c 3T3 CsCl纯化的表达质粒DNA （三）试剂 1．完全培养液 DMEM 90ml FCS 10ml 2．2M CaCl2，过滤除菌，-20℃保存备用 3．2×HEBS (g/500ml)
NaCl 8.0 KCl 0.38 Na2HPO4.7H2O 0.19 HEPES 5.0 葡萄糖 1.0 用NaOH调pH至6.95，过滤除菌后，-20℃保存备用。【方法与步骤】 1．在10cm的培养板上接种1×106个BALB/c 3T3细胞 第二天进行转染 2．准备CaPO4沉淀 2.1 准备两组试管 在A管中加入：15μg质粒DNA 69μl 2M CaCl2 460μl重蒸水 在B管中加入：550μl 2×HEBS 2.2 用巴斯德吸管将A管中的溶液缓慢地逐滴加入在B管中，同时用另一吸管吹打B管溶液，整个过程需缓慢进行，至少需持续1～2min。 2.3室温静置30min，出现细小颗粒沉淀。 3. 小心地将沉淀逐滴均匀地加入培养细胞的10cm平板中，轻轻晃动（此过程需尽快完成）。 4. 在5%CO2的加湿培养箱中培养细胞2-6 hr。
RNA干扰综述
RNAi研究及其进展 公光业M110107259 前言 RNAi是真核生物中普遍存在的一种自然现象，是由双链RNA 启动的序列特异的转录后基因沉默过程，是生物体在进化中形成的一种内在基因表达的调控机制。1998年，Andrew Fire等首次在线虫中发现RNAi现象，后来大量的研究表明，RNAi广泛存在于真菌、植物和动物中。由此人们认识到RNAi技术作为研究基因功能的一种有力的革命性工具，在功能基因组、转基因动物研究、基因治疗、药物开发等方面有着巨大的潜力。RNAi被《Science》杂志评为2010年十大科学成就之一，2002年又名列《Science》杂志十大科学成就之首，成为分子生物学研究的热点。本文综述了该研究的最新进展。正文 RNAi的发现： 上世纪90年代，科学家们在进行生物遗传改良的研究中，发现靶生物体内产生了一种非期望的表型。最早报道的是在1990年美国科学家Jorgensen等,他们在增强矮牵牛花紫色的转基因研究中，得到的结果是转基因植株部分或完全开白花，表明色素合成途径被关闭而不是被加强。他们将这一现象称为共抑制(cosuppresion)，后来的研究者称之为转录后基因沉默。此后不久，科学家们开展了真菌中的RNAi 的研究。1994年，意大利的Cogoni在野生型粗糙链抱霉(Neurospora crassa)的转基因研究中，把抑自身和相应内源基因表达的基因沉默现
象称为消除作用(quelling或基因压制)。 1995年，Guo等利用反义RNA技术阻断线虫的par-1基因表达，发现无论是给线虫注射正义RN A还是反义RN A，都可以抑制特异基因（par-1）的表达，结果与反义RNA技术的传统机制正好相反。这种出乎意料的发现引起了各国科学家的注意，从此展开了RNAi在动物体内的研究。1998年，Frei在研究秀丽隐杆线虫基因沉默时，首次揭开了Guo遇到的悬疑：Guo遇到的正义RNA抑制基因表达现象，是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起的，并且还发现双链RNA能够比反义RN A或正义RNA更有效地关闭基因的表达，抑制基因表达的效率比单链RNA至少高2个数量级，他们称这种现象为RNAi。从此，一个新的基因功能研究领域诞生了，人们已在不同种属的生物中进行了广泛而深人的研究，结果不仅证实R- NAi现象存在于秀丽小杆线虫、植物、真菌、果蝇、锥虫、涡虫、水媳、斑马鱼、小鼠乃至人类等多种生物中，而且对RNAi的分子机制逐渐有了比较清晰的认识，植物中的“共抑制”和真菌中的“压制”，与动物中双链RNA诱导的RNAi具有高度保守的相似机制。 RNAi作用机制: 病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA （大约21～23 bp），即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作
百度百科RNA干扰
RNA干扰 科技名词定义 中文名称：RNA干扰 英文名称：RNA interference;RNAi 定义1：与靶基因同源的双链RNA诱导的特异转录后基因沉默现象。其作用机制是双链RNA 被特异的核酸酶降解，产生干扰小RNA(siRNA)，这些siRNA与同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达。已经发展成为基因治疗、基因结构功能研究的快速而有效的方法。 所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；核酸与基因（二级学科） 定义2：引起基因沉默的一种技术，将根据基因序列制备的双链RNA注入体内，可引起该基因编码的mRNA降解，从而抑制了该基因的功能。 所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科） 定义3：双链RNA有效地阻断靶基因表达的现象。 所属学科：遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 百科名片 RNA干扰模式图 RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA （double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。 目录
简介 发现 作用机制 特点 制备方法 应用 相关知识 简介 发现 作用机制 特点 制备方法 应用 相关知识 展开 编辑本段简介 近几年来RNAi研究取得了突破性进展，被《Science》杂志评为2001年的十大科学进展之一，并名列2002年十大科学进展之首。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。 编辑本段发现 RNAi是在研究秀丽新小杆线虫（C. elegans）反义RNA（antisense RNA）的过程 RNAi实验图片 中发现的，由dsRNA介导的同源RNA降解过程。1995年，Guo等发现注射正义RNA（sense RNA）和反义RNA均能 有效并特异性地抑制秀丽新小杆线虫par-1基因的表达，该结果不能使用反义RNA技术的理论做出合理解释。直到1998年，Fire等证实Guo等发现的正义RNA抑制同源基因表达的现象是由于体外转录制备的RNA中污染了微量dsRNA而引发，并将这一现象命名为RNAi。
RNA干扰
RNA干扰 RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由双链RNA(doublestrandedRNAs，dsRNAs)引发的植物RNA沉默，主要有转录水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类:TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录;PTGS是启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制。有时转基因会同时导致TGS和PTGS。 由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，（长度超过三十的dsRNA会引起干扰素毒性）所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。 RNAi是在研究秀丽新小杆线虫（C. elegans）反义RNA（antisense RNA）的过程 1.作用机制 病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应， 其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21～23 bp），即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA 结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi 的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。 RNAi发生于除原核生物以外的所有真核生物细胞内。需要说明的是，由于dsRNA抑制基因表达具有潜在高效性，任何导致正常机体dsRNA形成的情况都会引起不需要的相应基因沉寂。所以正常机体内各种基因有效表达有一套严密防止dsRNA形成的机制。 怀特黑德生物医学研究所的本杰明·刘易斯等研究人员发现小RNA能通过阻断蛋白质合成的方式调控基因表达。他们借助一个计算模型来确定小RNA和对应的基因，发现了miRNA控制很大一部分生命功能的证据。 研究人员比较了人类和狗、鸡、鼠的基因组，对这几个物种共有的蛋白质合成基因与miRNA寻求对应关系。结果发现，尽管这几个物种在3.1亿年前就开始“分家”各自进化，但它们基因组中受miRNA调控的基因都占三分之一左右，而且这些基因在进化过程中都得以保存而未发生变化。刘易斯说，随着更多的基因组数据发布以及实验技术的进步，还可能发现更多的基因是由小RNA调控的。 RNA干扰现象的机理[8] RNA干扰作用是通过一类较稳定的中间介质实现的。对植物的研究证明，双链RNA 复合体先降解成为35nt左右的小RNA分子，然后他们通过序列互补与mRNA结合，从而导致mRNA降解[9][10]。对果蝇的研究证明，长度为21～23nt的小RNA分
RNA干扰实验技术相关探讨
文章编号： 06-（2004）063002101-10 中图分类号：Q344 中国生命科学论坛分子生物学版精华 RNA干扰(RNAi)实验技术相关探讨 马志杰 (maziwise) 编写小瘪修改 (中国生命科学论坛分子生物学版第1版主 ) [责任编辑：TILS007] 摘要：RNA干扰(RNAi)是一种由双链RNA所引起的序列特异性基因沉默。它是真核生物中基因转录后沉默作用的重要机制之一。RNAi技术作为新兴的基因阻抑方法，在功能基因组学、微生物学、基因表达调控机理研究等领域得到了广泛应用。本文就其作用机制、基本实验程序及注意事项作了较详细的综述，对其存在的相关问题和前景亦做了展望。 关键词：RNAi；siRNA；转染 小RNA作用与应用研究继2001，2002连续两年被美国Science杂志评为年度10大突破技术以来，近年来继续热度高涨，名列前矛。其核心技术RNA干扰（RNAi），即用20多个核苷酸组成的短的双链RNA（siRNA）代替传统反义核酸进行转录后基因沉默，已经迅速而广泛地应用到基因功能，基因表达调控机制研究等热门领域，不仅如此，它还为基因治疗开辟了新的途径。此外，RNAi沉默机制的探索也取得了相当的进展。目前，在大致勾画出生物体内源性小RNA的重要作用框架后，进一步阐述其作用细节、探索小RNA对细胞行为的调控、如何利用RNAi进行疾病防治等等都成为生物学家研究的一大热点。 1、RNAi的作用机制
通过生化和遗传学研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶段，加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA 片段(small interfering RNAs， siRNAs)。证据表明;一个称为Dicer的酶，是RNase III家族 中特 图1、RNAi的作用机制 异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex， RISC）。激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。另外，还有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt长的片段，这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化，从而使启动子失去功能，使其下游基因沉默。其基本原理见（图1）： 2、RNAi基本试验程序及注意事项 2.1、siRNA的设计 2.1.1、目标序列的筛选
反义技术 -RNA干扰
反义技术——RNA干扰（RNA interference，RNAi） 2010-04-18 22:20:17 来源：易生物实验浏览次数：210 网友评论0 条 最近由于RNA干扰（RNA interference，RNAi）的发现使反义领域的研究增多。这种自然发生的现象最早是在秀丽线虫中发现的（1），是序列特异性地使转录后的基因沉默的有力机制。由于最近两年在RNAi领域取得的进步，已经有许多这方面的综述发表（2-4）。 关键词：反义技术RNA干扰RNAinterferenceRNAisiRNAsRISCsnRNA 最近由于RNA干扰（RNA interference，RNAi）的发现使反义领域的研究增多。这种自然发生的现象最早是在秀丽线虫中发现的（1），是序列特异性地使转录后的基因沉默的有力机制。由于最近两年在RNAi领域取得的进步，已经有许多这方面的综述发表（2-4）。RNA干扰是由长的双链RNA分子发动的，该分子可以被Dicer e nzyme加工成长度为21-23个核苷酸的RNA（见图）。RNaseIII蛋白被认为是作为一个二聚体发挥作用，它对双链RNA的两个链都进行切割，酶切的产物3’末端互相重叠。然后这种小的干扰RNA分子（small interfering R NAs，siRNAs）掺入RNA诱导的沉默复合物（RNA- induced silencing complex，RISC），引导核酸酶降解靶RNA。 这种保守的生化机制可用于研究多种模式生物的基因功能，但是它在哺乳动物细胞中的应用受到阻碍，因为长的双链RNA分子会引起干扰素应答。因此Tuschi及其同事表明长度为21nt的siRNA可以特异性的抑制哺乳动物细胞基因表达是一个革命性的突破（5）。这个发现激发了大量利用RNAi技术对哺乳动物细胞的研究，因为与传统的反义技术比，RNAi的性能明显较高。