基因治疗

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基因治疗

摘要:基因治疗是利用分子生物学方法将目的基因导入患者体内,使之表达目的基因产物,从而使疾病得到治疗,为现代医学和分子生物学相结合而诞生的新技术。基因治疗作为疾病治疗的新手段,它已有一些成功的应用,并且科学突破将继续推动基因治疗向主流医疗发展。科学家们采取了合乎逻辑的步骤,试图直接将基因植入人体细胞中,其中具体关注一些由单基因缺陷引起的疾病,如囊肿性纤维化,血友病,肌肉萎缩症和镰状细胞性贫血。

关键词:基因治疗;基因应用;治疗前景;治疗伦理

引言:基因治疗法兴起于上个世纪九十年代,基因疗法就是用健康的基因来填补和替代基因疾病中某些缺失和病变的基因,目前基因的疗法是先从患者身上取出一些细胞,然后利用对人体无害的逆转录病毒做载体,把正常的基因接到病毒上,再用这些病毒感染取出的人体细胞,让他们把正常的基因插入细胞的染色体中,使人体细胞获得正常的基因,其中也涉及到了许多技术,也有很大的发展前景。

一.基因治疗的原理

基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞,以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病,以达到治疗目的。也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中,使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。从广义说,基因治疗还可包括从DNA水平采取的治疗某些疾病的措施和新技术。

二.基因治疗的途径

基因治疗主要以两种途径达到治疗目的。其一是正常基因来纠正突变基因,也就是在原位修复缺陷基因的直接疗法,此乃理想的基因治疗策略,由于多种困难,目前尚未实现;其二是用正常基因不替代致病基因的间接疗法,此法较前者难度小,也是目前众多主张采用的策略,并已付诸临床实践。而就基因转移的受体细胞不同,基因治疗又有两种途径,即生殖细胞基因治疗和体细胞基因治疗。

(1)生殖细胞基因治疗:生殖细胞基因治疗是将正常基因转移到患者的生殖细胞(精细胞、卵细胞中早期胚胎)使其发育成正常个体,显然,这是理想的方法。实际上,这种靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性进展,基因的这种转移一般只能用显微注射,然而效率不高,并且只适用排卵周期短而次数多的动物,这难适用于人类。而在人类实行基因转移到生殖细胞,并世代遗传,又涉及伦理学问题。因此,就人类而言,多不考虑生殖细胞的基因治疗途径。

(2)体细胞基因治疗:体细胞基因治疗是指将正常基因转移到体细胞,使之表达基因产物,以达到治疗目的。这种方法的理想措施是将外源正常基因导入靶体细胞内染色体特定基因座位,用健康的基因确切地替换异常的基因,使其发挥治疗作用,同时还须减少随机插入引起新的基因突变的可能性,对特定座位基因转移,还有很大困难,体细胞基因治疗采用将基因转移到基因组上非特定座位,即随机整合。只要该基因能有效地表达出其产物,便可达到治疗的目的。这不是修复基因结构异常而是补偿异常基因的功能缺陷,这种策略易于获得成功。基因治疗中作为受体细胞的体细胞,多采取离体的体细胞,先在体外接受导入的外源基因,在有效表达后,再输回到体内,这也就是间接基因治疗法。

三.基因治疗的一些步骤

1.目的基因的转移

在基因治疗中迄今所应用的目的基因转移方法可分为两大类:病毒方法和非病毒方法。基因转移的病毒方法中,RNA和DNA病毒都可用为基因转移的载体。常用的有反转录病毒载体和腺病毒载体。转移的基本过程是将目的基因重组到病毒基因组中,然后把重组病毒感染宿主细胞,以使目的基因能整合到宿主基因组内。非病毒方法有磷酸钙沉淀法、脂质体转染法、显微注射法等。

2.目的基因的表达

目的基因的表达是基因治疗的关键之一。为此,可运用连锁基因扩增等方法适当提高外源基因在细胞中的拷贝数。在重组病毒上连接启动子或增强子等基因表达的控制信号,使整合在宿主基因组中的新基因高效表达,产生所需的某种蛋白质。

3.安全措施

为避免基因治疗的风险,在应用于临床之前,必须保证转移-表达系统绝对安全,使新基因在宿主细胞表达后不危害细胞和人体自身,不引起癌基因的激活和抗癌基因的失活等,尤其是在将反转录载体用于基因转移时,必须在应用到人体前预先在人骨髓细胞、小鼠体内和灵长类动物体内进行类似的研究,以确保治疗的安全性。

四.基因治疗的基本方法

1.基因转移方法

(1)特异正常基因的分离与克隆:应用重组DNA和分子克隆技术结合基因定位研究成果,已有不少基因并将会有更多人类基因被分离和克隆,这是基因治疗的前提,在当代分子生物技术条件下,一般来说,只要有基因探针和准确的基因定位,任何基因都可被克隆。除此,现在既可人工合成DNA探针,还可用DNA合成仪在体外人工合成基因,这些都是在基因治疗前,分离克隆特异基因的有利条件。

(2)外源基因的转移:基因转移是将外源基因导入细胞内,其转移方法较多,常用的要有下列几类:①化学法:将正常基因DNA与带电荷物质和磷酸钙、DEAE-葡萄糖或与若干脂类混合,形成沉淀的DNA微细颗粒,直接倾入培养基中与细胞接触,由于钙离子有促进DNA 透过细胞有作用,某些化合物可扰乱细胞膜,故可将DNA输入细胞内,并整合于受体细胞的基因组中,在适当的条件下,整合基因得以表达,细胞亦可传代,这种方法简单,但效率极低。②物理法:包括电穿孔法和直接显微注射法。③同源重组法:同源重组是将外源基因定位导入受体细胞的染色体上,在该座位因有同源序列,通过单一或双交换,新基因片段替换有缺陷的片段,达到修正缺陷基因的目的,对于体细胞基因治疗,体外培养细胞的时间不能过长,筛选量大,故在临床上应用也受限制难以进行,今后如能改进技术,提高重组率,这种定点修正基因的方法仍是有前景的。④病毒介导基因转移:前述的化学和物理方法都是通过传染方式基因转移。病毒介导基因转移是通过转换方式完成基因转移,即以病毒为载体,将外源目的基因通过基因重组技术,将其组装于病毒上,让这种重组病毒去感染受体宿主细胞,这种病毒称为病毒运载体,目前应用的有两种病毒介导基因转移方法,一种为反转录病毒载体,另一种为DNA病毒介导载体。

2.靶细胞

这里所指的靶细胞是指接受转移基因的体细胞。选择靶细胞的原则是:①必须较坚固,足以耐受处理,并易于由人体分离又便于输回体内;②具有增殖优势,生命周期长,能存活几月至几年,最后可延续至病人的整个生命期;③易于受外源遗传物质的转化;④在选用反转录病毒载体时,目的基因表达最好具有组织特异性的细胞。目前使用得较多的是骨髓干细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞和肌细胞等。许多遗传病与造血细胞有关,故可用于如β-地中海贫血症、严重复合免疫缺陷病等的基因治疗。皮肤成纤维细胞易于移植和从

体内分离,又可在培养中生长,并易存活,故有人用之于乙型血友病的基因治疗。有不少遗传病表现了肝细胞功能缺陷,因此,在家族性高胆固醇血症的治疗中,有将低密度脂蛋白(LDL)受体基因转移至肝细胞的尝试。在动物实验中已证明:β-半乳糖苷酶基因、ADA 基因、小肌营养不良蛋白基因都已证明能在肌细胞中表达。

五.基因治疗现状与前景

进行基因治疗必须具备下列条件:①选择适当的疾病,并对其发病机理及相应基因的结构功能了解清楚;②纠正该病的基因已被克隆,并了解该基因表达与调控的机制与条件;③该基因具有适宜的受体细胞并能在体外有效表达;④具有安全有效的转移载体和方法,以及可供利用的动物模型。已对若干人类单基因遗传病和肿瘤开展了临床的基因治疗。如以下方面。

1.复合免疫缺陷综合征的基因治疗:1991年美国批准了人类第一个对遗传病进行体细胞基因治疗的方案,即将腺苷脱氨酶(ADA)导入一个4岁患有严重复合免疫缺陷综合征(SCID)的女孩。采用的是反转录病毒介导的间接法,即用含有正常人腺苷脱氨酶基因的反转录病毒载体培养患儿的白细胞,并用白细胞介素Ⅱ(IL-2)刺激其增殖,经10天左右再经静泳输入患儿。大约1-2月治疗一次,8个月后,患儿体内ADA水平达到正常值的25%,未见明显副作用。此后又进行第2例治疗获得类似的效果。

2.黑色素瘤的基因治疗对肿瘤进行基因治疗是人们早已期望的事,在进行了多方面探索的基础上,发现了肿瘤浸润淋巴细胞在肿瘤治疗中的作用。于1992年实施了TNF/肿瘤细胞和IL-2/肿瘤细胞方案,即分别将IL-2基因肿瘤坏死因子基因导入取自患者自身并经培养的肿瘤细胞,再将这些培养后的肿瘤细胞注射至病人臀部,3周后切除注射部位与其引流的淋巴结,在适合条件下培养T细胞,将扩增的T细胞与IL-2合并用于病人,结果5名黑色素瘤病人中1名肿瘤完全消退,2名90%的肿瘤消退,另2人在治疗后9个月死亡。由于携有TNF的TIL可积于肿瘤处,因而TIL的应用提高了对肿瘤的杀伤作用。

3.其它遗传病的基因治疗其它遗传病诸如白种人中常见的囊性纤维化的进展很快。对于DMD 的基因治疗,由于有小鼠动物模型,也取得一定进展。例如1993年法国将腺病毒-罗斯病毒小肌营养不良蛋白基因重组体注入小鼠肌内成功。即用腺细胞为载体,与小肌营养不良蛋白基因的cDNA重组,在RSV启动子启动下,作肌肉注射,证明可在mdy小鼠肌肉表达,此外,对一些遗传病如血友病,地中海贫血、高雪氏病等正在探索中。

4.反义技术又称反义寡核苷酸技术,是指利用人工合成的反义RNA和反义DNA来阻断基因的转录或复制,控制细胞生长在中间阶段,使编码蛋白质的基因能转录为mRNA,因而不能翻译成相应的蛋白质,以达治疗某一疾病的目的、用反义DNA已对某些癌症进行临床试验。这类反义技术只能认为是一种从基因水平进行治疗的技术,它们以不同方式,在DNA复制、转录和翻译水平发挥作用。由于它们的分子量低,故而有潜力进入靶细胞,但其临床稳定性、毒性、细胞通透性等各方面都需要进一步研究。

5.药物靶向治疗此法机理可概括为病毒导向酶的药物前体治疗,即用反转录病毒载体的外源基因转移到细胞内。该基因编码一种酶,此酶可将一种无害的药物前体转变为细胞毒素复合物。带有这一基因的病毒载体只在特殊组织或肿瘤细胞中而不在正常细胞中表达,这一基因治疗的新策略,可有可能使人对肿瘤等不同疾病进行基因治疗。已批准治疗的病例约120例,其中约110例为肿瘤,遗憾的是,除黑色素瘤有些苗头外,全都未能成功。治疗了10余例单基因病,除ADA缺乏症和乙型血友病有一定疗效外,其余都还在实验阶段。但人们再也不怀疑基因治疗不仅可能办到,而且指日可待。

虽然目前基因治疗有很多进展,但研究总体上不能令人满意,疗效不理想,有诸多技术瓶颈,关键的技术难题有待克服:1)临床上可用的治疗基因较少,对多数复杂疾病的致病

机制还不甚清楚;2)基因导入系统尚不成熟,载体结构不稳定,治疗基因难以到达靶细胞;3)治疗基因达到靶细胞的盲目性大、表达的可控性差,有激活致癌基因的潜在危害;4)在体细胞基因治疗时,存在不经意间改变了生殖细胞基因的可能性,从而对后代产生难以估量的伤害。实际中严重不良事件频频发生反映了基因治疗潜在的高技术风险。另外,基因治疗的非技术类风险也不可忽视,如部分科学家急功近利的心态、公众过高的企盼以及媒体炒作等诱发非技术类风险的因素。

六.我国基因治疗存在的伦理问题

1.知情同意中存在语义误解。“基因治疗”给人的印象是一种成熟的疗法,但实际上它仅仅是一种存在高风险且疗效不确定的研究,受试者的权益可能会因“语义误解”而受损。为避免“基因治疗”引发误解,美国NIH用“人类基因转移研究”代替“基因治疗”这个模糊提法,并反映在修订的NIH研究指南附录M-B“基因转移知情同意指南”部分。我国多数专业人士沿用“基因治疗”一词的原因有二:其一,它是一种约定俗成的用法,短期难以从专业行话中剔除;其二,多数专业人士认为它比“人类基因转移研究”更直观、易于被公众理解和接受。

2.知情同意中表达同意的主体模糊。在欧美国家开展的基因治疗临床试验中,同意的主体是个人。在中国,家庭在知情同意过程中担当着重要的角色。我国药监局(SFDA)1999年颁布的“人基因治疗申报临床试验指导原则”指出,“在病人家属充分理解并签字后才能开始治疗。”2003年药监局的“人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则”中改为:“在病人及家属充分理解并签字后才能开始治疗。”(作者注:上述两个指导原则中的“治疗”应改为“临床试验”为宜)两个指导原则中的同意方式都突出了家庭成员在决策中的重要性,但家庭同意有其弊端:其一,家庭成员的集体意见并不一定代表了受试者本人的心愿;其二,当出现家庭意见不一致时,难以决策。鉴于由此导致的在知情同意方面的混乱,我们建议采用“在家庭协助下的个人同意方式”。

3.对经济利益冲突的严重后果认识不够。庞大的病人队伍和昂贵的治疗费用使得大医药公司开始密切关注着基因治疗的临床应用,基因治疗被重重地烙上了商业印记。目前,在经济利益的驱使下,国内媒体已经有了“乙肝基因治疗”这样的医疗广告,诱骗患者上当。招募基因治疗临床试验对象的过程中也可能存在违反基本伦理原则的做法。借鉴美国和欧盟针对基因治疗中的利益冲突提出的相应预防措施(如严厉的处罚和公开的利益安排),中国开展基因治疗临床试验,应以“公开经济利益安排”为主,同时辅之以调停、节制、没收所得、禁止等措施。

4.伦理审查的体制和机制不健全。在审查基因治疗临床方案的伦理态度方面有两种不好的倾向:一是只要不违反科学原理和相关法规就可以了,没有必要进行伦理审查;二是既然西方已经充分讨论了相关的伦理问题,也有较成熟的伦理审查制度,直接“拿来”,或略加修改即可,没有必要再小题大做。应当承认:当前我国进入临床的基因治疗方案很少,在伦理审查方面不必过于死板,以免束缚自己的手脚,丧失赶超的机会。但国际同行对“重组Ad-p53腺病毒注射液”的伦理质疑凸显了严格监管的必要性。发表在2003年英国《自然》的一篇述评认为:一是中国没有经历美国和法国那样的失败案例,因而审查程序会松些;二是这项被中国药监局批准的新药仅仅建立在120名病人参与的临床试验之上。相关方面尽管辩称中国药监局的审批程序是严格的,但并没有提及伦理委员会的审查情况。我们认为,我国科学家在开展基因治疗临床试验时,应遵循基本的伦理规则,切实保障受试者的基本权益;而国家应建立健全伦理审查的体制和机制。

参考文献

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基因治疗

基因治疗 基因治疗的发展 基因治疗的设想始于1967年,1973年一名美国研究人员和几位医生在德国进行了世界上第一例基因治疗试验,接受治疗的患者为两姐妹,研究人员将一种名为肖普氏乳头瘤的病毒(这种病毒携带有一种酶基因可能会使人本身的酶分泌正常)注射到患者体内,结果是既没有产生任何疗效,也没有出现不良反应。1980年随着外源基因导入小鼠实验的成功,美国的另一名医生对两名地中海患者进行了第二例基因治疗,结果同样没有取得成功。 20世纪80年代初,美国科学家Anderson基因治疗的前景和发展方向。此后的几年之中,一大批科学家在动物身上进行了大量的基因转移实验和基因标记实验,为以后基因治疗的临床应用积累了许多经验,也奠定了临床应用的理论基础。1990年,美国国立卫生研究院的Blaste R.M.和Anderson W.F.用腺苷酸脱氨酶(ADA)基因导入一位由于ADA基因缺陷导致严重免疫缺损的4岁患者的淋巴细胞中,治疗取得了成功,转入这种可以产生腺苷酸脱氨酶能力的淋巴细胞后,患者症状得到明显缓解。第二例接收同样方法治疗的的SCID患者是一名九岁的小女孩,治疗也同样取得成功。1991年,美国科学家Rosenberg的研究小组对50名黑色素瘤晚期患者进行了基因治疗,将外源性肿瘤坏死因子转入肿瘤中的浸润淋巴细胞,结果这种转化的TIL能集中在肿瘤所在部位并杀伤肿瘤细胞,治疗也取得了一定效果。此后世界各国都掀起了基因治疗的研究热潮,1991年美国国立卫生研究院连续批准了包括肿瘤坏死因子基因导入肿瘤细胞在内的11项人类基因治疗的实验方案。2001年法国巴黎内克尔儿童医院利用基因治疗使数名有免疫缺陷的婴儿恢复了正常的免疫功能,成为基因治疗开展近十年来科学家取得的最大成功。目前基因治疗主要集中在美国,其次是欧洲。基因治疗的适用范围也越来越广,其中,癌症居基因治疗首位,其次是单基因疾病,心血管病,传染性疾病和其他疾病。 我国的基因治疗的研究工作开展的也相对较早,且获得了很好的疗效。1991年7月,中国复旦大学与第二军医大学长海医院合作,从一批自愿接受基因治疗的凝血因子IX基因缺陷血友病B患者中选择了两兄弟开始进行基因治疗临床研究。研究人员将凝血因子IX基因导入患者皮肤成纤维细胞,再将转化的皮肤成纤维细胞回输到患者体内。经过几次转化细

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基因诊断和治疗的医学应用 郭龙飞 (保山学院资源环境学院云南保山678000) 摘要:各种癌症和恶性肿瘤是目前危害人类健康最为严重的疾病之一,且死亡率很高,现在还没有一种有效的治疗方法。传统的手术、放疗和化疗等方法对中晚期的患者治疗疗效已经明显不足。因此。找到一种新的治疗癌症和恶性肿瘤的治疗方法对人类健康发展是意义重大的。而基因治疗则是用各种手段从基因水平上来治疗各种疾病。于是,基因治疗为众多患者提供了希望,成为了现在医学界的热门话题。本文就是依据前人的研究成果,以基因治疗癌症和恶性肿瘤为主来论述基因治疗在医学上的应用。 关键词:基因诊断基因治疗癌症恶性肿瘤 1基因治疗概述 基因治疗的基本含义是通过遗传或分子生物学技术在基因水平上治疗各种疾病[1]。它是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞,以纠正基因缺陷或者发挥治疗作用,从而达到治疗疾病的目的。广义的基因治疗是指利用基因药物的治疗,而通常所称狭义的基因治疗是指用完整的基因进行基因替代治疗,一般用DNA序列[2]。它是运用基因工程技术直接纠正肿肿瘤细胞基因的结构及(或)功能缺陷,或者间接通过增强宿主对肿瘤的杀伤力和机体的防御功能来治疗肿瘤。通过外源基因的导入,激活机体抗瘤免疫,增强对肿瘤细胞的识别能力、抑制或阻断肿瘤相关基因的异常表达或增加肿瘤细胞对药物的敏感性,这些基因主要包括细胞因子基因、抗肿瘤基因、肿瘤药物相关基因和病毒基因等[3]。 目前基因治疗的方式(type of gene therapy)主要有3种:①基因矫正或置换:即对缺陷基因的异常序列进行矫正,对缺陷基因精确地原位修复,或以正常基因原位置换异常基因,因此不涉及基因组的任何改变。②基因增补:不去除异常基因,而是通过外源基因的导人,使其表达正常产物,从而补偿缺陷基因的功能。③基因封闭:有些基因异常过度表达,如癌基因或病毒基因可导致疾病,可用反义核酸技术、核酶或诱饵转录因子来封闭或消除这些有害基因的表达[4]。 2基因诊断应用 2.1基因诊断新生儿脊髓性肌萎缩 目前报道有一些较严重的SMA I型患儿会出现关节挛缩、骨折、呼吸困难和感觉神经元受损的表现,但机制还不清楚,可能与5ql3缺失大小有关。SMA尚无特异的治疗方法,临床主要是对症治疗,如早期发现SMA患儿呼吸系统受累并干预性通气治疗可以延长疾病的病程、改善患儿生活质量、减少肺部继发性感染及呼吸衰竭发生。本例患儿经抗炎、吸氧、吸痰、补充维生素、给予丙种球蛋白等对症治疗和支持治疗,呼吸困难逐渐缓解,双肺痰鸣音减少,但最终家长考虑远期预后不良而放弃治疗[5]。 最近,在体外实验研究中发现丁酸纳、丙戊酸和Htra—ISl的调节因子可以增加SMN2基蛋白的作用,而且对细胞几乎没有毒性作用,但研究工作还处于动物实验阶段,没有正式应用于临床,该类药物可能为SMA的治疗开辟了新的途径[5]。 2.2早期胰腺藩的基因诊断 近年来,胰腺癌的发病率和死亡率呈逐渐上升趋势,每年有新发病例约20万人,占全部恶性肿瘤发病的2%。其发病匿,早期缺乏特异表现,恶性程度高,极易出现转移,80%-90%的胰腺癌病人就诊时,已经到了晚期,手术切除率只有15%,年生存率为1%-5%。而早期胰腺癌的手术切除率为90-100%,5年生存率可达70%- 100%。另有研究表明,肿瘤的大小是重要的生存率预测因子,如果直径

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基因治疗的现状与展望 朱双喜 在生命进化的漫长历程中,生物体通过基因突变以适应环境,基因突变是生物进化的基础。同时,不利的突变会造成细胞形态和功能的异常,导致疾病,甚至机体的死亡。人体某些疾病的发生与基因的核苷酸序列变化有关,那么从校正核苷酸序列着手来治疗疾病的设想也就顺理成章了。基因治疗是向靶细胞引入正常的或野生型基因,纠正和补偿致病基因产生的缺陷从而达到治疗疾病的目的。.Anderson于80年代初首先阐述了基因治疗的前景;1990年美国成功地进行了ADA(腺苷脱氨酶)缺陷患儿的人体基因治疗;1991年我国首例基因治疗B型血友病也获得了成功。目前,基因治疗已从遗传病扩展到肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病、传染病,包括AIDS病等领域。它依然存在例如缺少高效的传递系统、缺少持续稳定的表达和寄主产生免疫反应等一些问题。但随着人类基因组计划的实施、大批新基因的发现以及新技术的发展,治疗范围将大大拓宽,从而给人类健康事业带来深远的影响。一、基因治疗的前提 在基因治疗成为一种普通的医疗手段之前必须首先明确两个前提。 1.1 基因治疗需要有清晰定义的靶组织通常以疾病类型来选择进行基因治疗的细胞,例如在肺部系统纤维疾病的临床治疗中选择肺作为靶器官,使用呼吸道气雾剂法,可使含有补偿缺陷基因的DNA直接传递到肺中;治疗类似血友病的凝血因子疾病需要在血浆里含有达到治疗水平的凝血蛋白,这种蛋白可以由肌肉、活细胞、成纤维细胞或甚至血细胞提供,于是就可有多种接受基因治疗的靶组织。此外,靶组织的最终选择还必须考虑基因传递的效率、表达蛋白变性、机体免疫状态、可行性和治疗费用等因素。 1.2 究竞要往靶组织内传递多少治疗基因B型血友病的病因是缺乏一种称为第九因子的凝血蛋白,然而病人只需正常水平5%的这种蛋白,其生存机会就能提高,假设经治疗后的细胞能稳定表达这种蛋白,那么需要传递基因给人体全部1013个细胞中的5xlO11细胞;然而相对于大脑来说,只需几百个细胞被基因转染,神经性疾病的患者就可减轻痛苦;如果考虑对成血干细胞(或生殖细胞)进行基因转染,治疗几个细胞将会对其数以百万计的子代产生影响,所起的负作用也同样如此。 二、基因治疗的方法 基因治疗的应用有两种途径:(1)把一个健康基因拷贝插入靶细胞以补偿缺陷基因;(2)引进经过改造的基因以赋予细胞新的特性。最常用的技术有:(a)体外处理(ex vivo)疗法~将有基因缺陷的细胞取出,引入正常基因拷贝后再送回体内;(b)原位疗法,使用载体将目的基因直接导入靶组织。(c)体内疗法(in vivo),将基因载体注入血液,定向寻找靶细胞并将遗传信息安全有效地导入。 基因治疗载体可分为病毒型和非病毒型[4]两类。病毒型载体包括:逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒和疱疹病毒,目前最有效的方法是使用经过改造的、具有穿膜特性的病毒作为载体,定向地将目的基因导入细胞。然而由于人体自身具有抗病毒的免疫系统,使用病毒载体作为媒介来传递DNA时就不得不面对宿主的免疫反应。非病毒型载体包 括:脂质体、裸露DNA和DNA包装颗粒,范围从裸DNA显微注射,电激法、基因枪技术等各类物理学方法到聚阳离子赖氨酸或阳离子脂质体。 三、基因治疗面临的问题 缺乏某种单基因产物而患病的病人,一旦获得一个野生型的基因拷贝并能正常表达,就有被治愈的可能。基因治疗亟待解决的问题是目的基因的定向表达,目的基因导入靶细胞是定向表达的基本条件。目前,必须优先发展有更强适用性和灵活性的能准确调控转导基因表达的基因传递系统,即发展一种理想的“载体”(能帮助新的基因"潜入"),人体细胞的特殊

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2020年细胞和基因治疗CDMO行业研究报告 一、细胞和基因治疗:创新疗法的新方向 (一)细胞治疗:CAR-T 是目前商业化的主流方向 细胞疗法的原理是通过向患者移植正常或生物工程改造过的人体细胞以替代失去正常功能的细胞。人体中包含200多种不同的特殊细胞类型,例如肌肉,骨骼或脑细胞。这些细胞在体内执行特定功能,疾病或衰老可能导致人体细胞失去这些分化细胞。在许多情况下,这种缺失是不可逆的,也就意味着患病或丢失的细胞不再能被健康的细胞所补充。细胞疗法旨在将新的健康细胞人为地引入患者体内,以替代患病或缺失的细胞。 细胞治疗最早可以追溯到上个世纪30年代,而近代细胞治疗的快速兴起则是在2011年之后。2011年10月,法国科学家拉尔夫·斯坦曼因“发现树突状细胞和其在后天免疫中的作用”获得诺贝尔医学奖,标志着生物免疫治疗成为癌症治疗的新型疗法。此后,细胞治疗迅速兴起,在一些复杂的肿瘤疾病治疗中率先进行临床试验,被Science杂志评为2013 年10大科技突破之首。 细胞疗法按照引入的细胞种类可以分为干细胞治疗和免疫细胞治疗。干细胞治疗是利用人体干细胞的分化和修复原理,把健康的干细胞移植到病人体内,以达到

修复病变细胞或重建功能正常的细胞和组织的目的。干细胞是一类具有无限的或者永生的自我更新能力的细胞、能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞,具有多能性和全能性、自我更新能力和高度增殖能力等优点。患者自体干细胞较易获得,致癌风险也很低,同时也没有免疫排斥及伦理争议等问题,被更多地应用于临床。用于临床治疗的干细胞种类主要有骨髓干细胞、造血干细胞、神经干细胞等。干细胞治疗被广泛应用于临床各类疾病的治疗,主要包括血液类疾病、器官移植、心血管系统疾病、肝脏疾病、神经系统疾病、组织创伤等方面。 免疫细胞治疗的原理是采集人体自身的免疫细胞并进行体外培养扩增,同时加强其靶向性和杀伤力,最后再输入到病人体内以消灭病原体、癌细胞。免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞,包括NK细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞等。目前免疫细胞疗法主要被运用于癌症的治疗,根据所使用的的免疫细胞不同,分为细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)疗法、API生物免疫治疗、DC+CIK细胞疗法、自然杀伤细胞(NK)疗法、 DC-T 细胞疗法等。 免疫细胞疗法在癌症治疗上的应用主要是通过过继性免疫治疗实现的。过继性免疫治疗是指从肿瘤患者体内分离免疫活性细胞,在体外进行扩增和功能鉴定,然后

基因治疗就是利用分子生物学技术

基因治疗就是利用分子生物学技术,按照自然规律要求,纠正基因结构和功能异常,组织病变的进展,杀灭病变的细胞,或一致外源病原体遗传物质的复制,从而达到治疗疾病的一种方法或技术。 端粒:是真核生物染色体末端的一种特殊结构,由端粒DNA和端粒蛋白质构成,作用:稳定染色体结构防止染色体末端融合保护染色体结构基因避免遗传信息在复制过程中丢失。 端粒酶是一种自身携带模板RNA的逆转录酶,催化端粒DNA的合成,能够在缺少DNA模板的情况下延伸端粒内3’端的寡聚核苷酸片段。其活性取决于酶内RNA和蛋白质亚基。是端粒复制所必须的一种特殊的DNA聚合酶 DNA变性:在某些理化因素作用下,DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂,DNA双螺旋结构松散,变成单链。 Tm :加热变性过程中DNA双螺旋结构解开一半时的温度。 基因芯片:是通过缩微技术,根据分子间特异性地相互作用的原理,将生命科学领域中不连续的分析过程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化学分析系统,以实现对细胞、蛋白质、基因及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。 反义核酸是根据碱基互补原理,用人工合成或生命有机体合成的特定互补的DNA或RNA片段,与目的序列结合,通过空间位阻效应或诱导RNAase活性降解,在复制、转录、剪切、mRNA转运及翻译等水平上,抑制或封闭目的基因的表达。 肽核酸:能与其互补的DNA或RNA特异性结合的多肽链。 RNA干涉(RNA interference,RNAi):是指内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导的细胞内mRNA 发生特异性降解,从而导致靶基因的表达沉默,产生相应的功能表型缺失的现象。 DNA的一级结构:是指构成DNA的基本组成单位--四种脱氧核苷酸通过3’,5’-磷酸二酯键按照一定的排列顺序连接起来的线性多聚体,以及其组成单位的数量。 DNA的二级结构是指两条脱氧多核苷酸链以反向平行的方式,围绕同一个中心轴盘绕所形成的双螺旋结构. 双螺旋结构特点:1.主链脱氧核糖和磷酸基通过3′,5′磷酸二酯键交互连接,成为螺旋链的骨架。 2.碱基配对:G-C,A-T。 3.螺旋参数:直径2nm,螺距3.4nm,每圈10nt,相邻碱基对夹角36° 4.大沟和小沟:DNA行使功能时蛋白质的识别位点。 超螺旋(supercoiling)是DNA三级结构的一种结构模式,是双螺旋的螺旋。分为正超螺旋和负超螺旋两种形式。 mRNA的主要功能是携带蛋白质的序列信息,在翻译过程中作为模板,通过三联体密码子指导蛋白质的生物合成。 tRNA的功能:1. 搬运氨基酸;2. 活化氨基酸;3. 在密码子与对应氨基酸之间起接合体(adaptor) 的作用。 rRNA单独存在时不执行其功能,它与多种蛋白质结合成核糖体,作为蛋白质生物合成的“装配机”,是蛋白质生物合成的场所。 核酸的杂交(hybridization):指序列互补单链的RNA和DNA,或DNA和DNA,或RNA和RNA,根据碱基配对原则,借助氢键相连而形成双链杂交分子的过程。 原理:互补DNA单链在一定条件下通过碱基互补配对可形成双链DNA分子。 分类: 溶液杂交: 固相杂交:用膜作为固相支持物,将单链DNA或RNA吸附、固定到膜上,再进行杂交

基因治疗的发展及其应用

基因治疗的发展及其应用 【摘要】基因治疗一种很有发展前途的高新技术。基因治疗有望成为治疗遗传病、肿瘤、心血管病、病毒感染及其它难治性疾病的有效手段,本文通过国内外相关文献的分析,从基因治疗(基因治疗的现状、肿瘤的基因治疗)、基因预防、基因治疗技术、基因治疗存在的问题和未来发展等进行综述。 【关键词】基因治疗;基因预防;基因治疗技术;现状;问题和未来发展 人类的疾病是由于其本身的基因的核苷酸发生变化有关。近年来,基因治疗作为一种安全的、新的疾病治疗手段,在一定程度上取得了重大进展。 1 基因治疗 基因治疗(Genethrapy)是向靶细胞引入正常有功能的基因,以纠正或补偿致病基因所产生的缺陷,从而达到治疗疾病的目的,通常包括基因置换、基因修正、基因修饰、基因失活等。简而言之,基因治疗是指通过基因水平的操纵而达到治疗或预防疾病的疗法。 1.1 基因治疗的现状 生物医学的深入研究表明,人类的各种疾病都直接或间接与基因有关[1]。因此,可认为人类的一切疾病都是“基因病”。故人类疾病可分为三大类。一类是单基因病。这类疾病只需一个基因缺陷即可发生,如腺苷脱氨基酶(ADA)缺陷症。二是多基因病。此类疾病的病因大多比较复杂,不但涉及各个基因,往往还与环境因素(包括自然环境、社会环境、生活方式等)有关。基因缺陷和疾病表型都具有明显的多样性。Ⅰ型糖尿病、肿瘤、心血管疾病等皆属此类。三是获得性基因病。此乃病原微生物入侵所致,如艾滋病、乙型肝炎等。因此,理论上,人类所有的疾病都可采用基因治疗。 1.2 肿瘤的基因治疗 目前治疗癌症的基因疗法种类颇多,主要集中在免疫基因治疗、药物敏感性基因治疗、肿瘤抑制基因治疗治疗三个方面。 1.2.1 免疫基因治疗 常用方法有:①细胞因子基因治疗:将某些细胞因子基因如IL 2、IL 4、IL 6、B7 1,GM CSF等转染肿瘤细胞后,增强机体对肿瘤细胞的免疫反应。②肿瘤抗原基因免疫治疗:将某些肿瘤抗原基因如MHC基因等转染肿瘤细胞,增强肿瘤细胞免疫原性。②反义基因治疗:应用反义核酸在转录和翻译水平,通过碱基互补原则封闭某些异常基因的表达,反义核酸被称为信息药物[3]。④用抗体抑制癌基因的产物杀灭肿瘤细胞。

2020年细胞和基因治疗CDMO行业调查报告

2020年细胞和基因治疗CDMO行业调查报告 1 细胞和基因治疗:创新疗法的新方向 (一)细胞治疗:CAR-T 是目前商业化的主流方向 细胞疗法的原理是通过向患者移植正常或生物工程改造过的人体细胞以替代失去正常功能的细胞。人体中包含200多种不同的特殊细胞类型,例如肌肉,骨骼或脑细胞。这些细胞在体内执行特定功能,疾病或衰老可能导致人体细胞失去这些分化细胞。在许多情况下,这种缺失是不可逆的,也就意味着患病或丢失的细胞不再能被健康的细胞所补充。细胞疗法旨在将新的健康细胞人为地引入患者体内,以替代患病或缺失的细胞。 细胞治疗最早可以追溯到上个世纪30年代,而近代细胞治疗的快速兴起则是在2011年之后。2011年10月,法国科学家拉尔夫·斯坦曼因“发现树突状细胞和其在后天免疫中的作用”获得诺贝尔医学奖,标志着生物免疫治疗成为癌症治疗的新型疗法。此后,细胞治疗迅速兴起,在一些复杂的肿瘤疾病治疗中率先进行临床试验,被Science杂志评为2013年10大科技突破之首。 细胞疗法按照引入的细胞种类可以分为干细胞治疗和免疫细胞治疗。 干细胞治疗是利用人体干细胞的分化和修复原理,把健康的干细胞移植到病人体内,以达到修复病变细胞或重建功能正常的细胞和组织的目的。干细胞是一类具有无限的或者永生的自我更新能力的细胞、能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞,具有多能性和全能性、自我更新能力和高度增殖能力等优点。患者自体干细胞较易获得,致癌风险也很低,同时也没有免疫排斥及伦理争议等问题,被更多地应用于临床。用于临床治疗的干细胞种类主要有骨髓干细胞、造血干细胞、神经干细胞等。干细胞治疗被广泛应用于临床各类疾病的治疗,主要包括血液类疾病、器官移植、心血管系统疾病、肝脏疾病、神经系统疾病、组织创伤等方面。 干细胞的全能型可以被用于细胞治疗 免疫细胞治疗的原理是采集人体自身的免疫细胞并进行体外培养扩增,同时加强其靶向性和杀伤力,最后再输入到病人体内以消灭病原体、癌细胞。免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞,包括NK细胞、T细胞、B 细胞、巨噬细胞等。目前免疫细胞疗法主要被运用于癌症的治疗,根据所使用的的免疫细胞不同,分为细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)疗法、API生物免疫治疗、DC+CIK细胞疗法、自然杀伤细胞(NK)疗法、DC-T细胞疗法等。 免疫细胞疗法在癌症治疗上的应用主要是通过过继性免疫治疗实现的。过继性免疫治疗是指从肿瘤患者体内分离免疫活性细胞,在体外进行扩增和功能鉴定,然后向患者回输,从而达到直接杀伤肿瘤或激发机体的免疫应答杀伤肿瘤细胞的目的。过继性免疫治疗主要分为三大类:一种方法是利用从患者的肿瘤中分离出的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL),在实验室中扩大其数目,然后再注入患者体内;第二种方法是改造从患者身上收获的T细胞,使其表达肿瘤抗原特异性T细胞受体(TCR),以便T细胞可以识别和攻击表达这种抗原的肿瘤细胞;第三种方法与TCR类似,区别在于其在T 细胞上构建的是一个嵌合型抗体受体(CAR),从而让免疫T细胞不仅能够特异性地识别癌症细胞,同时可以激活T细胞杀死癌症细胞。 目前CAR-T是唯一被FDA批准的过继性免疫疗法。TIL和TCR治疗只能靶向和消除在特定情况下(当抗原与主要组织相容性复合物或MHC结合时)呈递其抗原的癌细胞。而CAR的主要优势在于,即使不通过MHC将抗原呈递到表面,

人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则

人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则 一、引言 基因治疗是指改变细胞遗传物质为基础的医学治疗。目前仅限于体细胞。 基因治疗的技术和方式日趋多样性。按基因导入的形式,分为体外基因导入(exvivo)及体内基因导入(invivo)两种形式。前者是在体外将基因导入人细胞,然后将该细胞注入人体。其制品形式是外源基因转化的细胞,适合在具有专门技术人才和GMP条件的医疗单位进行。后者则是将基因通过适当的导入系统直接导入人体,包括病毒的与非病毒的方法。其制品形式是基因工程技术改造的病毒或者是重组DNA、或者是DNA复(混)合物。基因治疗制剂种类较多,因此,本指导原则不可能用一个模式来概括,只能提出一个共同的原则,具体的方案应根据这些原则,确定研究技术路线。其基本原则:一是必须确保安全与有效,要充分估计可能遇到的风险,并提出相应的质控要求;二是要促进基因治疗的研究,并加强创新。对一些新的治疗技术路线的相应质控要求,可有一定的灵活性,应注意到基因治疗本身的特点以及它与经典的化学合成药物或基因工程药物的差别。目前,一些基因治疗研究相对比较成熟,而一些则不够完善,更加要求研究者在使用该技术指导原则时不可生搬硬套。为此,研究者应加强咨询和论证,提出一个科学可行的研究方案,最终获得确保安全有效的基因治疗制品。 在向国家药品监督管理局申报临床试验时,除须按本指导原则中"研究内容和制品质量控制"准备材料外,同时需提供下述材料: (1)国内外研究现状和进展(综述)。包括: 1.所用基因的研究现状和进展; 2.所用载体的研究现状和进展; 3.所用基因导入系统和方法的研究现状和进展; 4.该研究或制品相关的体外有效性实验资料; 5.该研究或制品相关的动物试验安全性和有效性资料; 6.该研究或制品相关的临床试验安全性和有效性资料; 7.该研究或制品的生产工艺现状; 8.该研究或制品的质量控制现状;

基因治疗在疾病防治中的应用

基因治疗在疾病防治中的应用 120311102 张宇鑫 [摘要] 传染病是目前人类所面临的一类重大疾病,在某些疾病状态下,人类还未寻找到理想的治疗方法,如病毒感染等。现代基因治疗是一种应用基因工程技术和分子遗传学原理,对人类疾病进行治疗的新疗法。主要是指对致病基因的修正和基因增强及采用外源性细胞因子基因、核酶、基因药物进行疾病治疗的方法。经过多年的发展,技术逐步走向成熟,在传染性疾病的防治中显示了重大的临床应用前景。传染性疾病的基因治疗包括:基因疫苗、RNA干扰、反义技术、药物靶向治疗等。 [关键词] 基因疫苗反义技术药物靶向治疗 一、现状 1.1我国传染病预防现状 21世纪人类依然面临着传染病的挑战,就全球而言,艾滋病是当前首恶,由于其病毒极易发生变异,所以到目前为止疫苗仍在试验阶段,缺乏理想的特效药物,免疫损伤治疗难度大。我国2003年比2002年发病率上升44.39%,人类免疫缺陷病毒检出率提高了55%。并且防治工作面临来自传统传染病和新发传染病的双重压力:传统传染病威胁持续存在,新发传染病不断出现。近10年来,我国几乎每一两年就有1种新发传染病出现,许多新发传染病起病急,早期发现及诊断较为困难,缺乏特异性防治手段,早期病死率较高。其次,人口大规模流动增加了防治难度,预防接种等防控措施难于落实。三是环境和生产生活方式的变化增加了传染病防治工作的复杂性。一些地区令人堪忧的城乡环境卫生状况,以及传统的生产生活方式,使一些人畜共患病持续发生。 1.2基因治疗研究的现状 (1) 复合免疫缺陷综合征的基因治疗 1991年美国批准了人类第一个对遗传病进行体细胞基因治疗的方案,即将腺苷脱氨酶(ADA)采用反转录病毒介导的间接法导入一个4岁患有严重复合免疫缺陷综合征(SCID)的女孩,大约1-2月治疗一次,8个月后,患儿体内ADA水平达到正常值的25%,未见明显副作用。此后又进行第2例治疗获得类似的效果。 (2)黑色素瘤的基因治疗 对肿瘤进行基因治疗是人们早已期望的事,在进行了多方面探索的基础上,发现了肿瘤浸润淋巴细胞(即能在肿瘤部位持续存在而无副作用的一种淋巴细胞)在肿瘤治疗中的作用。于1992年实施了TNF/肿瘤细胞和IL-2/肿瘤细胞方案,即分别将IL-2基因肿瘤坏死细胞(TNF)基因导入取自患者自身并经培养的肿瘤细胞,再将这些培养后的肿瘤细胞注射至病人臀部,3周后切除注射部位与其引流的淋巴结,在适合条件下培养T细胞,将扩增的T细胞与IL-2合并用于病人,结果5名黑色素瘤病人中1名肿瘤完全消退,2名90%的肿瘤消退,另2人在治疗后9个月死亡。由于携有TNF的TIL可积于肿瘤处,因而TIL的应用提高了对肿瘤的杀伤作用。

未来30年_基因治疗能否广泛应用_

科技日报/2008年/12月/24日/第004版 科技改变生活 未来30年,基因治疗能否广泛应用? 实习生梁鑫刘飞 未来,当一个婴儿刚刚出生,人们就能预知他的将来可能会得什么病,这要归功于基因诊断和治疗。这个新技术的实现需要等待多少年?有专家预测,2030年生物医疗与基因改良竞赛将出现。请关注——未来30年,基因治疗能否广泛应用? 编者按:就像我们30年前无法想象今天的生活一样,未来的30年,我们的生活又将变成什么样呢?最近美国《未来学家》杂志对未来世界的发展提出了预测:也许到了2030年,汽车时代将结束、每个人将拥有独一无二的IP地址、城市化程度将达到60%、生物医疗与基因改良竞赛将出现……未来30年的世界真是这样的吗?本版从今日起推出系列报道,与国内有关专家共话未来。 美国《未来学家》杂志近日对世界未来发展提出预测:像上个世纪的太空竞赛那样,2030年将出现生物医疗与基因改良竞赛。而IBM公司最新公布的“未来5年的5项创新”计划则指出:未来5年,你将拥有一张基于你的DNA基因图。医生为您预测健康风险、提出治疗建议,医药公司的“对人制药”都将成为可能。 医药研制真能实现个性化吗?未来30年,我们能否用基因去治病? 基因治疗:个人的“医药工厂” 随着生命科学与技术的发展、人们对疾病的认识不断加深,越来越多的证据表明许多疾病与人体遗传基因的结构或功能改变有关。因而,人类开始从基因方面治疗疾病。 “简单地说,基因治疗是指在人体内开一个‘医药工厂’,将特定基因作为‘药物’输送到患者体内,用以治疗疾病的一种分子治疗技术。”上海复旦大学生命科学学院遗传学研究所卢大儒教授说。中国科学院北京基因组研究所中心实验室主任胡松年解释说:“通俗地说,基因治疗跟人们吃药原理相似。例如,一个人可能由于遗传因素或者是基因突变等原因,患上某种疾病。而利用基因治疗就可以对致病基因进行替换或补充,使基因恢复正常,从而预防或治疗人类疾病。基因治疗的实现需要依靠大量的人类基因组数据研究,并对其进行信息解析。” 卢大儒认为,基因治疗与常规治疗的区别在于:“一般常规治疗方法针对的是因基因异常而导致的各种症状,而基因治疗针对的是疾病根源异常的基因本身。因此,基因治疗能从根本上治愈一些现有的常规疗法所不能解决的疾病,譬如:遗传病(如血友病、囊性纤维病、家庭性高胆固醇血症等)、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病(如艾滋病等)。” 基因治疗可以实现有效的个性化治疗吗?胡松年说:“利用基因技术可以找到个体致病的靶点,针对不同的靶点采用不同的药物,从而达到真正精准的治疗,使疾病治疗向个体方向发展。” 据了解,IBM的研究人员正在开发一种系统,可以为医生提供相关的工具,帮助其预测艾滋病患者对防逆转录酶病毒疗法的反应,从而帮助医生针对任何艾滋病病毒的基因突变选择最好的药物或药物组合。“这是一种预测防逆转录酶病毒疗法对某一种特殊的艾滋病病毒治疗效果的创新方法,这种方法利用了滤过性病毒基因的数据,并整合了欧洲最大的艾滋病数据库的一些治疗反应数据。”IBM中国研究院院长李实恭表示。 基因治疗:将会提高治愈率 复旦大学生命科学学院遗传学研究所副教授朱焕章博士指出:“若要使基因治疗技术成为临床的一个常规治疗手段,乐观估计可能需要20—30年时间。” “在未来,利用基因治疗,人类疾病的治愈率将会提高,人们的身体素质会越来越好,人类

肿瘤基因治疗技术

577 中国肿瘤2001年第10卷第10期 安瑞生,陈晓峰 (中国科学院北京动物研究所,北京100080) Gene Thera py Techni q ue AN Rui sheng,C HEN Xiao feng 摘要:肿瘤基因治疗就是将一段特定的遗传信息物质DNA 或RN A 通过人工方法导入肿瘤细胞以治疗肿瘤性疾病。目前的 研究主要包括三个方面:肿瘤免疫基因治疗、反义RNA 、三链D NA 。其中研究较多的是肿瘤免疫基因治疗。本文主要对肿瘤免疫基因治疗的构建、接种、应用等方面做了综述,并简要介绍了反义RNA 和三链DNA 技术。 关键词:基因治疗;基因疫苗;DNA 疫苗;反义RNA;三链DN A;肿瘤中图分类号:R730.54文献标识码:B 文章编号:1004-0242(2001)10-0577-03 收稿日期:2001-08-22肿瘤免疫基因治疗就是将具有一定功能的外源基因导入人体细胞,以补充机体所缺乏的基因或纠正机体异常表达的基因。人类基因治疗的探索始于20世纪80年代初,目前已由动物实验向临床试验过渡。本文就肿瘤的基因治疗技术的现状综述如下。 1 肿瘤免疫基因治疗 1 1 载体的构建 获得合适的抗肿瘤编码基因并将它插入到载体DNA 上,是发展肿瘤基因治疗的一个主要工作。不言而喻,目的基因的选择至关重要。抗肿瘤基因可以是单个基因或具有协同保护功能的一组基因,也可以是编码抗肿瘤基因决定簇的一段核苷酸序列。但是,这都是建立在充分了解病原体基因的基础上的。表达文库免疫技术,提供了一种在各种已知或未知病原体基因组中获得目的基因的系统而普遍有效的方法。该技术根据病原体的所有抗原都由其DNA 编码这一基本原理,将病原体基因文库中的病原体DNA 片段插入特定的质粒中,利用基因免疫的方法筛选病原体基因组中具有免疫保护功能的基因片段。目前,基因表达文库免疫技术是发现目的基因的一种最系统、客观的手段。 质粒载体必须是能在大肠杆菌中高拷贝地扩增,而在动物细胞内则能高效表达,但不复制,也不含有向宿主细胞基因组内整合的序列。用于基因治疗的载体主要有质粒和病毒,病毒载体曾经被用作抗原基因载体[1],现在主要用质粒构建载体,由于细菌质粒本身没有很强的免疫原性,这对保证质粒在体内长期稳定地表达有重要意义[2]。 载体一般以PBR322或PUC 质粒为基本骨架,它们能在 大肠杆菌内扩增,但不能在哺乳动物细胞内复制 [3] 。通常使 用的质粒载体有PBR322、PUC18、PUC19、PUC118、PUC119等。常用的质粒载体启动子多为来源于病毒基因组的巨细胞病毒(CMV)早期启动子,具有很强的转录激活作用,带有细菌复制子(ORI),真核生物的启动子和PolyA 加尾信号。启动子大多来源于病毒基因组,如CMV 、PSV 、LTR 等,其中以CMV 的转录活性最高,PolyA 序列具有保证mRNA 在体内的稳定性的作用,这种稳定性因PolyA 来源不同而异,目前认为较好的PolyA 来自牛生长激素基因或兔B 球蛋白基因。另外,还可包含一些合适的增强子、终止子、内含子、免疫激活序列及多聚腺苷酸信号等。筛选载体可以选用卡那霉素、氨苄青霉素或新霉素等抗性基因。1.2 目的基因的导入 主要途径包括间接体内法和直接体内法。间接体内法是指在体外用基因转染肿瘤细胞,然后将经转染的肿瘤细胞输入病体内,最终给予病体的疗效物质是基因修饰的细胞[4]。直接体内法是指基因片段或完整基因直接注入体内进行治疗的办法。就直接体内法而言,目前使用的方法有以下几种: 裸DNA 直接注射,将裸质粒DNA 直接注射到机体的肌肉、皮内、皮下、粘膜、静脉内。这种方法简单易行。脂质体包裹DNA 直接注射,包裹DNA 的脂质体能与组织细胞发生膜融合,而将DNA 摄入,减少了核酸酶对DNA 的破坏。注射途径类似裸DNA 直接注射[5] 。金包被DNA 基因枪轰击法,将质粒DNA 包被在金微粒子表面,用基因枪使包被DNA 的金微粒子高速穿入组织细胞。繁殖缺陷细菌携带质粒DNA 法,选择一种容易进入某组织器官的细菌,将其繁殖基因去掉,然后用质粒DNA 转化细菌,当这些细菌进入某组织器官后,由于能繁殖,则自身裂解而释放出质粒DNA [6]。经改造的mRNA 法,将目的基因的mRNA 结构进行重组后直接送入体内。 肿瘤基因治疗技术 专 题报道

基因治疗的研究现状以及应用前景分析

基因治疗的研究现状以及应用前景分析 摘要: 基因治疗是一种通过基因水平的操作而达到治疗或预防的高新技 术。可治疗包括遗传性疾病、癌症、感染性疾病、心血管疾病和自身 免疫性疾病在内的多种疾病。近几年来基因治疗在全球范围内虽然取 得了快速发展,但也遇到了很多技术、伦理以及法律问题。未来基因 治疗的主要目 标是在法律和伦理要求范围内,开发更加安全高效的基因导入系统, 更好的服务于人类。本文主要论述了基因治疗的研究现状,并在此基 础上分析了其应用前景。 关键词:基因治疗,研究现状,应用前景 Abstract: ?Gene therapy is a new technology by which people can cute and prevent many diseases at the level of genes, such as,genetic disease,infectional disease,cardiovascular disease and autoimmune disease.At the past years , gene therapy has been developed all around the world , however , it has also come across some probloms , including technology ,laws and ethics. At the future , the main aim of gene therapy is to develop more safe and efficient gene delivery system within the limits of laws and ethics .The research status and application prospect of gene therapy are discussed in this paper.

第二十三章 基因治疗——复习测试题

第二十三章基因治疗——复习测试题 (一)选择题 A型题 1. 全世界第一例基因治疗成功的疾病是 A. β地中海贫血 B. 血友病 C. 重症联合免疫缺陷症 D. 高胆固醇血症 E. 糖尿病 2. 理论上讲,基因治疗最理想的策略是 A. 基因置换 B. 基因替代 C. 基因失活 D. 免疫调节 E. 导入“自杀基因” 3. 目前基因治疗所采用的方法中,最常用的是 A. 基因置换 B. 基因替代 C. 基因失活 D. 免疫调节 E. 导入“自杀基因” 4. 利用反义核酸阻断基因异常表达的基因治疗方法是

A. 基因置换 B. 基因替代 C. 基因矫正 D. 基因失活 E. 免疫调节 5. 将白细胞介素-2基因导入肿瘤病人体内,提高病人IL-2的表达水平,进行抗 肿瘤辅助治疗。这种基因治疗方法是 A. 基因置换 B. 基因替代 C. 基因矫正 D. 基因失活 E. 免疫调节 6. 下列哪种方法不是目前基因治疗所采用的方法 A. 基因缺失 B. 基因置换 C. 基因替代 D. 基因失活 E. 免疫调节 7. 基因治疗的基本程序中不包括 A. 选择治疗基因 B. 选择载体 C. 选择靶细胞 D. 将载体直接注射体内 E. 将治疗基因导入靶细胞

8. 下列哪种方法不属于非病毒介导基因转移的物理方法 A. 电穿孔法 B. 脂质体法 C. DNA直接注射法 D. 显微注射法 E. 基因枪技术 9. 下列哪种方法属于非病毒介导基因转移的化学方法 A. 电穿孔法 B. 基因枪技术 C. DNA直接注射法 D. 显微注射 E. DEAE-葡聚糖法 10. 将外源治疗性基因导入哺乳动物细胞的方法不包括 A. 显微注射法 B. 电穿孔法 C. 脂质体法 D. CaCl2法 E. 病毒介导的基因转移 11. 目前在基因治疗的临床实施中,最常使用的载体是 A. 逆转录病毒载体 B. pBR322 C. λ噬菌体 D. pUC18 E. YAC

基因治疗

基因治疗 【摘要】研究发现,以基因为基础,从疾病和健康的角度考虑,人类疾病大多直接或间接地与基因相关,故有“基因病”概念产生。根据这一概念,人类疾病大致可分为三类:单基因病、多基因病和获得性基因病。随着现代生物科学的发展,基因工程已在多个领域得到广泛应用。基因治疗是利用基因工程技术向有功能缺陷的人体细胞补充相应功能基因,以纠正或补偿其疾病缺陷,从而达到治疗疾病的目的。基因治疗作为治疗疾病的一种新手段,已经在肿瘤、感染性疾病、心血管疾病和艾滋病等疾病的治疗方面取得进展。它在一定程度上改变了人类疾病治疗的历史进程,被称为人类医疗史上的第四次革命。本文就基因治疗的载体以及基因治疗在肿瘤、艾滋病治疗方面取得的成就作出介绍,并就基因治疗的现状和问题对基因治疗的未来作出展望。 【关键词】基因治疗、载体、肿瘤、p53、IAP、艾滋病、CCR5 【正文】 一、基因治疗背景及概念 1990年9月,美国政府批准实施世界上第一例基因治疗临床方案,对一名患有重度联合免疫缺陷症(SCID)的女童进行基因治疗并获得成功,从而开创了医学的新纪元。自此以来,基因治疗已从单基因疾病扩大到多基因疾病,从遗传性疾病扩大到获得性疾病,给人类的医疗事业带来革命性变革。 基因治疗(gene therapy)是指通过一定的方式,将正常的功能基因或有治疗作用的DNA 序列导入人体靶细胞去纠正基因突变或表达失误产生的基因功能缺陷,从而达到治疗或缓和人类遗传性疾病的目的,它是治疗分子疾病最有效的手段之一。 基因治疗包括体细胞基因治疗和生殖细胞基因治疗。但由于用生殖细胞进行治疗会产生伦理道德问题,因此通常采用体细胞作为靶细胞。其基本内容包括基因诊断、基因分离、载体构建和基因转移四项。根据功能及作用方式,用于基因治疗的基因可分为三大类:(1)正常基因:可通过同源重组方式置换病变基因或依靠其表达产物弥补病变基因的功能,常用于矫正各种基因缺陷型的遗传病;(2)反义基因:通过其与病毒激活因子编码基因互补,或与肿瘤mRNA互补,从而阻断其表达,常用于治疗病毒感染或肿瘤疾病;(3)自杀基因:能将无毒的细胞代谢产物转变为有毒的化合物,用于治疗癌症。 二、基因治疗载体

分子生物学总结

分子生物学总结 1.分子生物学的三大原则 根据“序列假说”、“中心法则”这两个基本原则,分子生物学作为所有生命物质的共性学科遵循“三大原则:其一,构成生物大分子的单体是相同的。在动物、植物、微生物3大系统的所有生物物种间都具有共同的核酸语言,即构成核酸大分子的单体均是A、T(U)、C、G。所有生物物种间都具有共同的蛋白质语言,即构成蛋白质大分子的单体均是20种基本氨基酸。 其二,生物大分子单体的排列决定了不同生物性状的差异和个性特征。 其三,所有遗传信息表达的中心法是相同的。 2.简述Morgan基因论 经典基因概念:即基因是孤立的排列在染色体上的实体,是具有特定功能的,能独立发生突变和遗传交换的,“三位一体”的、最小的遗传单位。 3.简述“顺反子假说”的主要内容 顺反子理论认为:基因(即顺反子)是染色体上的一个区段,在一个顺反子内有若干个交换单位,最小的交换单位被称为交换子。在一个顺反子中有若干个突变单位,最小的

突变单位被称为突变子。在一个顺反子结构区域内,若果发生突变就会导致功能丧失,所以顺反子即基因只是一个具有特定功能的、完整的、不可分割的最小的遗传单位。 4.名词解释:等位基因、全同等位基因、非全同等位基因等位基因(allele):同一座位存在的两个不同状态的基因 全同等位基因(homoallele):在同一基因座位(locus)中,同 一突变位点(site)向不同方向 发生突变所形成的等位基因非全同等位基因(heteroallele):在同一基因座位(locus) 中,不同突变位点(site)发 生突变所形成的等位基因 5.简述DNA作为遗传物质的优点(自然选择的优势) DNA作为主要的遗传物质的优点在于: 1)储存遗传信息量大,在1kb DNA序列中,就可能编码出41000种遗传信息 2)以A / T, C / G 互补配对形成的双螺旋,结构稳定,利于复制,便于转录,可以突变以求不断进化,方便修复以求遗传稳定; 3)核糖的2’ – OH 脱氧,使其在水中的稳定性高于RNA,DNA中有T无U,消除了C突变为U带来进化中的负担

基因治疗的困难与前景

基因治疗的困难与前景 基因治疗是利用遗传学的原理治疗人类疾病的新手段,传统意义上的基因治疗是指目的基因导入靶细胞后与宿主细胞的基因发生基因重组,成为宿主细胞的一部分,从而可以稳定地遗传下去,并达到疾病治疗的目的。 目前,基因治疗主要的策略有4种。基因置换是利用正常的基因整个地替换突变基因,使突变基因永久地得到更正。基因修正是将突变基因的突变碱基序列用正常的序列加以纠正,而其余未突变的正常部分予以保留。相比前面两种策略,基因修饰则是间接利用目的基因的表达产物来改变宿主细胞的功能。而基因失活是利用反义技术来封闭某些基因的表达,以达到抑制有害基因表达的目的。就技术方面而言,基因置换是最常用的策略之一。 基因治疗的发展和实施,要依赖于相关的技术和研究。其中最为重要的是人类基因组计划(HGP)和基因工程技术。美国国会于1990年批准了这一项目,并决定从1990年10月1日组织实施。计划耗资30亿美金,历时15年完成。这个浩大繁杂的计划成为了国际合作项目。美国,英国,日本,法国,德国和中国6个国家相继加入到计划中。HGP最终任务是要破译人体遗传物质DNA分子所携带的所有的遗传信息。HGP的实施,使人们对自身基因的认识达到一个质的飞跃。使人们进一步认识各种基因的生物学

功能以及与遗传病之间的关联,认识遗传病的分子缺陷的基础知识,为遗传病的基因治疗奠定基础。 HGP为基因治疗提供了基础知识,而真正的成功操作则要依赖基因工程技术。其中最重要的是基因治疗的载体构建。病毒载体是常用的载体之一。如:逆转录病毒载体,腺病毒载体等。而非病毒载体主要为显微注射法和电穿孔DNA转移法。 从1967年Nirenbery提出基因治疗实施。在1990年9月,美国FDA批准了人类首例基因治疗,针对于SCID的病例的基因治疗研究。同年9月14日第一位基因治疗的患者被成功回输带有矫正基因的T细胞。 基因治疗的基础研究虽然已经有近半个世纪,但基因治疗的成功案例并不多,所涉及的疾病领域也不广。其中的问题还存在很多。其中伦理问题和技术安全问题是最受关注的。 对生殖细胞的操作有不可预知性,有可能使后代产生缺陷。就目前的技术还不能做到避免外源基因的插入引起的生殖细胞的基因突变。这种改变是否符合我们后代的最佳利益。这就提出了一个新的伦理问题。我们是否有权这样做。我们对后代的责任是什么。基因治疗还面临着很大的社会风险,通过遗传筛查可以不让可能患遗传病的人出生,以此来预防遗传病。这会鼓励强迫性的优生规划和对

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