纤维素分解微生物的分离与鉴定

环境微生物技术实验总结报告

一、国内外研究进展：

①纤维素资源

据不完全统计，全球每年通过光合作用产生的植物物质高达1.8×1011 t，这些植物物质所含的能量相当于全球人类每年能量消耗量的20倍，食物中所含能量的200倍。纤维素是构成植物细胞的基本成分，纤维素占全球植物总干重的30%一50%，是地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物，它存在于所有植物当中。在生物界中，结合于有机体中的碳达27×1010t，在自然界有机体中构成纤维素的碳约占40%，据此估算，在植物界中纤维素的总量约达26.0×1010t，而且自然界中的植物原料是年复一年地不断生长和更新的，可以说，纤维素在自然界中是一种最丰富的可再生的有机资源。纤维素是一种不能被大多数动植物直接利用的多糖物质。但对人类来说只要能将其降解成小分子物质，纤维素就会成为一种有广阔应用前景的资源。而且这种潜在的资源数量是惊人的，其中的大多数作为绿色植物的成分在维持生态平衡中起作用而不宜利用，但是仍有数量可观的纤维素由人类生活和生产产生，它们主要存在于农作物秸秆和城市垃圾之类的废弃物中。灾荒或战乱造成的粮食危机依然是正存在的和潜在的威胁;随着全球经济的飞速发展，地球上石油、煤炭的储量正以惊人的速度减少，能源危机成了世界大多数国家所面临的一个严峻问题;由于对资源的破坏性开采和利用，人类赖以生存的环境正在不断地恶化，对可再生资源利用的研究与开发的可持续发展战略己在世界各国逐步展开。如何处理和利用废弃纤维素将成为一个十分紧要的问题。

②农业废弃物资源的利用现状

植物纤维素资源的开发利用对解决粮食和能源短缺以及环境污染问题有极其深远的意义。我国的纤维素资源极为丰富，每年的农作物秸秆产量达5.7x107吨，约相当于北方草原年打草量的50倍。但是，农作物秸秆产生数量多且产生时间集中(每年到收获季节农村就会有大量的秸秆产生)，而我国的农作物秸秆主要用于燃料、畜禽饲料与自然堆肥，不仅利用效率低，而且随着农村生活水平的提高，农作物秸秆成为农村固体废弃物的主要来源。现阶段，农作物秸秆的最常用的处理和利用方法有:

1.加工成粗饲料，作为草食动物的食料。这是一种传统的方法，现在我国约有巧%的秸秆用于此用途。此法的主要缺点是秸秆营养价值低。

2.秸秆还田。即利用农田土壤中的微生物降解秸秆。这是我国处理秸秆的主要方法。虽然此法可暂时解决秸秆过剩问题，但是由于农田土壤中的微生物降解能力有限，秸秆会残留在土壤中不腐烂，从而使土壤肥力过低，并造成耕作困难。

3.造纸，编织，制燃料、沼气等。

4.自然界的许多微生物具有氧化、分解有机固体废弃物的能力。而我国的劳动人民在长期的生产实践中，早已懂得利用秸秆、落叶、野草和畜、禽粪便堆积发酵制作肥料。但都是采用传统的手工操作和自然堆积的方式，并依靠自发的生物转化作用，发酵周期长，处理量小。上个世纪20年代，出现了机械堆制技术，并逐渐发展为处理生活垃圾、污泥污水、人和畜禽粪便及农林废物的重要方法之一。

即使有以上方法，对于我国这样的一个农业大国，特别是在城市周边较富裕的农村地区，每年仍会产生大量的无法处理的秸秆，农民将其焚烧，产生大量的烟雾，不仅污染了环境，而且会造成交通事故，甚至机场、高速公路无法运行。由此可见，秸秆的处理与利用技术急需开发。现在已经取得成效和正开发的新技术有:生产食用菌、生产蛋白饲料[3]、制有机肥、生产纤维素酶等。与粗饲料及秸秆还田相比，蛋白饲料和有机肥料分别有营养价值较高和肥力较高的优势，而生产纤维素酶则具有更高的商业价值。以上四个方法除食用菌以生产高等

真菌为目的外，其他三个方法均需要快速高速降解纤维素的菌种参与发酵。

③城市垃圾的处理与利用现状

城市生活垃圾是指以家庭为主以及办公室、餐馆、饭店等场所所排放出的各种废物，成分主要有厨余、纸张、塑料、竹木、布类、玻璃及其他废物。世界的垃圾年产量约为10亿吨，其中纤维素的含量是十分可观的。纸张、织物、含纤维素食品及草木等均含有纤维素。我国城市生活垃圾产量在1995年已超过1亿吨，并且仍在以每年10%左右的速度增长，超过世界平均8.42%的年增长速度。据统计，大城市生活垃圾中有机成分约占总量的60%，无机物约占40%，其中废纸、塑料、玻璃、金属、织物等可回收物约占总量的30%。城市垃圾处理方法常见的有:焚烧法、填埋法、堆肥法等。其中堆肥法适用于有机垃圾，它是利用自然界的微生物降解有机垃圾为腐殖质的垃圾处理法。堆肥(composting)是指在控制条件下(在一定的水分、C/N比和通风条件下)，使来源于生物的有机废物，发生生物稳定作用(Biostabilization)的过程。这一定义强调，堆肥原料来自生物界;堆制过程需在人工控制下进行，不同于卫生填埋、废物的自然腐烂和腐化;堆制的实质是生物化学过程。木质素、纤维素在堆肥中的主要结构形式是木质纤维素，约占40%;半纤维素约占20%一30%;木质素约占20%~30%。现代化的堆肥生产一般采用好气堆肥工艺，它通常由前处理、一次发酵、后发酵、后处理及贮藏等工序组成。前处理指破碎和分选前处理工艺，通过破碎和分选，去除非堆肥物质，调整垃圾的粒径;一次发酵即好氧高温发酵;后发酵即简易堆放;后处理就是对完全腐熟的堆肥进行再分选，去除无机物，可再根据需要调整粒径。在堆肥堆制过程中，进行微生物接种，可以加速堆肥材料的腐熟作用。关于堆肥微生物生物接种的工艺，普遍认为城市垃圾中微生物种类繁多，接种好热性纤维素分解菌不能起到积极作用。在堆肥腐熟过程中，纤维素分解作用是关键问题，因此各种加速纤维素分解的技术都是有积极意义的。研究者利用筛选出的一株自生固氮菌和一株纤维素分解菌进行混合培养，初步探索了两种菌混合作用下对生活垃圾的降解作用及增肥效应。结果表明，两种菌在一定情况下能相互利用、相互依存，在两种菌混合作用下可以加速有机垃圾的降解，同时可提高其含氮量[5]。在堆肥过程中，有机质生化降解会产生热量，如果这部分热量大于堆肥向环境的散热，堆肥物料的温度则会上升。此时，热敏感的微生物就会死亡，耐高温的细菌就会快速地生长、大量地繁殖[7]。还有学者对城市生活垃圾堆肥过程中的微生物类群进行了分离鉴定，在此研究基础上，提出在原生垃圾含有的自然微生物群体基础上，添加高效菌种或酶制剂，将增强对垃圾的分解和利用，对于缩短堆肥时间也具有重要意义。

④纤维素分解菌

由于微生物治理环境或处理固体有机废弃物方法具有成本低、无二次污染、生态恢复好等特点，进入80年代以来，发达国家更是对有益环境的微生物开发、应用研究领域投入了大量人力物力，取得了巨大的经济、环境和社会效益。国内的研究者也在分离可转化有机化合物的微生物，探索有机物生物降解途径的多样性，研究微生物引发生物降解的生化和遗传机制等领域做了大量工作。纤维素酶的来源非常广泛，昆虫、软体动物、原生动物、细菌、放线菌和真菌等都能产生纤维素酶。目前研究较多的是霉菌，其中酶活力较强的菌种为木霉、曲霉、根霉和青霉，特别是里斯木霉、绿色木酶、康氏木霉等较为典型，是目前公认的较好的纤维素酶生产菌。细菌中酶活力较强的菌种有纤维粘菌属、生抱纤维粘菌属和纤维杆菌属，放线菌中有黑红旋丝放线菌、玫瑰色放线菌、纤维放线菌和白玫瑰放线菌等。微生物中的真菌能降解各种木质纤维原料。白色致腐真菌能够降解纤维素、半纤维素和木质素等主要成分。在对侧抱菌、绿色木霉等菌种的研究中，科学家对它们的酶作用机理进行了阐述。有关白色致腐真菌和放线菌对木质素和木质纤维的降解能力已有些报道。研究者已成功进行了菌株杂交，通过杂交提高了真菌利用木质纤维的能力。很有可能应用基因工程技术对于这些能降解木质纤维的菌株进行改良，这些技术还包括原生质体融合技术和DNA转化技术等。在长期

的实验和生产实践中，人们发现很多生物过程是微生物单独作用不能完成或只能微弱进行的，必须依靠两种或两种以上的微生物共同作用才能完成。城市垃圾处理方法一一堆肥过程中，由于各种好热性微生物的最适温度互不相同，因此随着堆温的变化，好热性微生物的种类、数量也逐渐发生着变化。堆肥发热阶段主要由中温好氧的细菌和真菌利用容易分解的有机物，释放出热量，使堆肥温度升高。在50℃左右，主要是嗜热性真菌和放线菌，如嗜热真菌属(Thermomyees)、嗜热褐色放线菌(Aetinomyceshermofoscus)、普通小单胞菌(Mieromonosporavulgaris)等。温度升至700C时，大多数嗜热性微生物已不适应，相继大量死亡或进入休眠状态。微生物混合培养中各种微生物之间的相互关系是既多样又复杂的，可以有互生、共生、寄生、拮抗和捕食关系。研究不同纤维素降解菌降解效果的差异以及混合菌中各菌株的相互作用，可以为工程中优选菌种、发挥菌株间协同作用、防止拮抗作用的发生提供实验依据。

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二、研究目的：

①了解生物技术在环境污染治理中的应用，掌握环境生物技术研究的基本方法，提高实践能力、团队合作能力与综合运用知识的能力。

②学习和巩固选择性培养基及鉴别培养基的制备原理和方法，了解和掌握从环境中分离筛选纤维素酶产生菌的原理和方法。

三、任务：从土壤中分离筛选纤维素分解微生物及初步的菌种鉴定。

四、流程：采样→复筛→分离纯化→鉴别→革兰氏染色。

五、器材：试管（10支），培养皿（21个），移液管（1mL一个，10mL一个），涂布器

（1个），烧杯（2个），锥形瓶（4 个），玻璃棒，接种环，酒精灯，显微镜，载玻片，天平及其它基本器材

六、药品：土样，革兰氏染液（结晶紫，碘液，95%乙醇，番红），无菌水

①羧甲基纤维素钠培养基（CMC培养基）：NaCl 6g，MgS O4·7H2O，0.1g，KH2PO4

0.5g, CaCl20.1g，K2HPO4 2.0g，CMC-Na 15g，（NH4）2SO4 2.0g，PH值7.0-7.4,蒸馏水500mL，琼脂10g。

②刚果红鉴别培养基：CMC-Na 1.88g , Na2HPO42.5g, KH2PO4 0.5g, MgSO4·7H2O

0.3g, 刚果红 0.2g，蛋白胨2.5g，酵母膏15g，蒸馏水300mL, 琼脂6g。

七、步骤：

1.土样采集土样的采集要选择富含纤维素的环境，例如落叶堆积丛，这是因为在纤维素含量丰富的环境，通常会聚集较多的分解纤维素的微生物。如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，过一个月右也会有能分解纤维素的微生物生长。

2.灭菌取所需实验仪器，对移液管、培养基、试管、锥形瓶进行包扎，然后放入高压锅进行灭菌。

3.培养基配置配置足量复筛培养基，倒入锥形瓶，包扎灭菌。

4．接种将灭完菌的培养基在酒精灯旁分别倒入7个培养皿中，标号10-3、10-4、10-3、10-3、10-4、10-3、空白，记上小组号。称取0.5g采集土样装入试管，加入10mL无菌水，用力振荡至土壤颗粒击碎成沫并混合均匀，再用1mL移液管移取上清液一毫升，装入另一试

管，用10mL无菌水稀释混匀制成10-1稀释液，如此进行梯度稀释依次制成10-2、10-3、10-4、10-3、10-6稀释液.取用10-3、10-4、10-3三种悬液进行接种，在酒精灯附近倒入冷却的平板培养基，并用涂布器涂布均匀，再制作三个平行样，一个空白对照，共七个平板培养基。放入培养箱，30℃恒温下培养约两天，及时观察菌落生长状况。

5.分离纯化将长出的菌落用接种环无菌操作下挑起，在三个复筛培养基上进行划线分离，培养基上注明小组号，注意划线的操作方法，划完线后放入培养箱中培养约两天。在划线分离的同时将刚果红培养基熬制出来，并包扎进行高压蒸汽灭菌。

6.鉴别将刚果红培养基在无菌操作下倒入三个培养基中，制成平板培养基。移取10mL无菌水至一个试管中，再将分离纯化长出的菌落用灼烧冷却后的接种环挑取接入该试管中，注意挑取不同形态的菌落，挑取量不宜过多，再将试管用力振荡，使接入的菌落打碎分离。待充分打碎后用一毫升移液管移取0.3mL菌液倒入刚果红培养基中并用涂布器涂布均匀。放入恒温箱进行30℃恒温培养两天。注意观察刚果红培养基的变化，看是否有透明圈产生及大小，记录实验结果。

7.革兰氏染色挑取产生明显透明圈的菌落涂片，固定，经过初染、媒染、脱色和复染后进行镜检，观察其是革兰氏阳氏菌还是阴氏菌，记录。

八、实验现象及结果：第一步复筛两天后培养基上未长出菌落，借第一组初筛菌落

接着做刚果红培养基鉴别实验，两天后鉴别培养基上产生透明圈，很明显，有较大的，也有较小的，说明筛选出的纤维素分解菌确是能降解纤维素的微生物，产生的透明圈越大，降解功能越好。挑取产生大透明圈的菌落进行划线分离，两天后划线培养基上长出单个菌落，但由于划线操作进行的不是很好，分离的不是很好，未产生一个一个的单菌落，而是仅有一两个单菌落。挑取单菌落进行革兰氏染色，用显微镜观察，发现菌体被染成红色，说明被检测的菌体是革兰氏阴氏菌。29日，在染色之前观察第一步复筛接种的培养基发现培养基上长出了很多的单菌落，有的菌落小而密，易被挑起，是细菌菌落；有的菌落大而湿润，易被挑取，是真菌菌落；有的菌落成蜘蛛网状，是放线菌菌落；还有的菌落呈黄色，是酵母菌菌落；还有绿色的，可能是无菌操作进行得不太好，空气里的霉菌进入培养基。此观察结果说明能分分解纤维素的微生物不止是细菌，还有真菌等。可视分解能力的大小进行菌种的保存，复壮。由于时间因素，经第一步复筛选出的菌落没来得及应用到第二步分理纯化。

九、个人体会：

在本实验中，我们组没有经过初筛设一步，而是设想直接进行复筛及分离纯化，再同时用马丁培养基进行初步鉴定及用刚果红培养基进行鉴别，由于没有考虑时间的影响，也没有做好两手准备，结果证明确实是一个小小的失误。不过总体来说还是比较成功的。所以在以后的实验设计中，应该将各种因素考虑在内，做好全面的准备。作为一个组长，我觉得自己还是做得不够好，没有将组员的实验热情调动起来，有些时候就是三两个组员跟我一起做。所以在以后的实践中应该让每个人完全了解实验的意图，在心里熟悉各步操作，让每个人都积极参与其中，让每个人都学有所获。