病理生理学第十章

第十章缺血－再灌注损伤

缺血－再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury)或称再灌注损伤，是指组织缺血一段时间，当血流重新恢复后，组织的损伤程度较缺血时进一步加重、器官功能进一步恶化的综合征。

缺血-再灌注损伤早已为临床观察和动物实验所证实。如有些休克病人经过早期复苏，在血流动力学和血氧供应恢复后，反见组织细胞损伤加重、脏器功能进一步降低；动物实验亦发现，缺血（血流量降至正常的20％）3小时后再灌注1小时所造成的组织损伤，比同样条件下单纯缺血4小时的结果严重得多。

缺血－再灌注损伤是当今医学研究中活跃的领域。自1960年Jennings 首次提出心肌再灌注损伤以来，临床医生陆续发现在休克治疗、心肺复苏、心脑血管栓塞再通、器官移植时均会发生缺血－再灌注损伤。防治缺血－再灌注损伤直接关系到疾病的治疗效果。因此，对缺血－再灌注损伤机制的阐明具有重要的理论

和实际意义。

第一节缺血-再灌注损伤的原因和影响因素

一、原因

凡能引起血流重新恢复而导致组织损伤的因素都有可能成为再灌注损伤的发生原因，常见的有：

1.组织器官缺血后恢复血液供应，如休克时微循环的再灌注、冠状动脉痉挛的解除等。

2.一些新的医疗技术的应用，如动脉搭桥术、心脑梗塞时的溶栓疗法等。

3.心脏外科体外循环后重新恢复血流供应。

4.其他，如断肢再植、器官移植等。

二、影响因素

缺血再灌注后是否发生再灌注损伤与下列因素有关

缺血时间缺血时间长短与再灌注损伤的发生与否有关，在组织器官所能耐受的缺血时间内予以再灌注，可使其功能恢复，一般不引起再灌注损伤；而缺血时间过长使组织细

胞坏死也没有再灌注损伤发生的基础。

侧枝循环缺血后容易形成侧枝循环的组织，不易发生再灌注损伤。

对氧的需求程度对氧需求高的组织器官，因氧易接受电子使氧自由基产生增多，故容易发生再灌注损伤。

电解质浓度实验证明：高钾、高镁对再灌注损伤有保护作用，而钠、钙增多可诱发再灌注损伤。

第二节缺血-再灌注损伤的发生机制缺血与再灌注损伤是两个不同的病理过程，同时二者又密切相关。缺血性损伤是再灌注损伤发生、发展的基础。在缺血期，缺血、缺氧导致①A T P合成减少；②分解代谢产物，尤其是嘌呤碱及细胞内酸性代谢产物增多。在此基础上，再灌注后由于恢复供氧产生自由基，并由于钙离子超载及炎症反应等原因引发再灌注损伤。

目前认为，缺血－再灌注损伤的发生机制主要与以下三个方面的因素有关。

一、自由基生成增多及其损害作用

㈠自由基的概念及分类

自由基(free radical, FR)是指外层轨道上有未配对电子的原子、原子团或分子的总称。因其含有未配对的电子，故化学性质非常活泼，极易与其生成部位的其他物质发生反应，而这种反应的最大特点是以连锁反应的形式进行。

1.氧自由基(oxygen free radical, OFR)在生理和病理情况下，机体内有多种自由基产生，其中最为重要的是由氧诱发产生的自由基，即氧自由基。氧自由基包括：超氧阴离子（O·2 ）、羟自由基(·O H)、单线态氧（1O2）。其中，O·2是其它氧自由基产生的基础。催化产生O·2 的酶系统，包括N A D P H氧化酶、黄嘌呤氧化酶和P450细胞色素单加氧酶等。生成的O·2 可自发歧化或在超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，S O D)的作用下生成非自由基的过氧化氢(H2O2)。O·2 和H2O2相互作用产生·O H，该反应被称为Haber-Weiss反应，能被铁离子所加速。由铁离子催化的Haber-Weiss反应称为Fenton反应，可产生·O H。H2O2

还能与C l-在髓过氧化物酶（myeloperoxidase, M P O）的催化下生成次氯酸（H O C L），后者能与O2反应生成·O H。H2O2可被过氧化氢酶(catalase，C A T)或谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，G S H-P X)所清除。

2.一氧化氮（N O）N O是精氨酸在一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,N O S)的催化下产生的。单核巨噬细胞、中性粒细胞中的N O S是诱导型的，缺血－再灌注损伤时，白细胞被激活后N O S的活性增强，可大量产生N O；N O有一个不配对电子，故实质上是一种气体自由基。它能与氧自由基反应，产生多种毒性代谢产物。如N O与O2反应产生一种氧化性更强的自由基：过氧亚硝酸根（peroxynitrite,O N O O-）,O N O O-很稳定，能扩散到邻近细胞造成强烈的细胞损伤。O N O O-在生理p H条件下易于质子化生成过氧亚硝酸（peroxynitrous acid ,O N O O H），它不稳定，能释放出·O H和N O2或经历分子内的重排产生

N O3。

3.脂性自由基是氧自由基与多聚不饱和脂肪酸作用后生成的中间代谢产物，如烷自由基（L.）、烷氧自由基（L O.）、烷过氧自由基（L O O.）等。

H2O2及H O C L虽不是自由基，但它们的化学性质与自由基相似，与氧自由基、一氧化氮(N O)和过氧亚硝酸根(O N O O-)等同属于活性氧（reactive oxygen species,R O S），即在化学反应性能方面比氧活泼的含氧化合物。图10-1显示了主要活性氧的生成和代谢。

图1

图10-1 主要活性氧的生成和代谢

㈡缺血－再灌注损伤时自由基生成增多的机制

1.通过黄嘌呤氧化酶途径产生自由基黄嘌呤脱氢酶（xanthine dehydrogenase,X D H）与黄嘌呤

氧化酶（xanthine oxidase,X O）均可催化黄嘌呤和次黄嘌呤的分解代谢，但由于X D H和X O的化学修饰不同，因而反应的结果也不相同。X D H含－S H，以N A D+作为电子受体；而X O含－S S －，催化反应是以O2作为电子受体，因而可以产生氧自由基。这两种酶主要存在于毛细血管内皮细胞内，正常时以X D H为主，缺血、缺氧可促使X D H转变为X O。增多的机制目前认为有两种：①A T P生成减少使C a2+泵功能障碍，C a2+进入细胞内激活C a2+依赖性蛋白水解酶，通过有限水解使X D H构象改变，转变为X O。

②X D H内部的－S H被氧化为－S S－，使X D H 转变为X O。由于黄嘌呤氧化酶形成增多，加之缺血、缺氧时能量消耗，A T P降解为A D P、A M P和次黄嘌呤，造成缺血组织内次黄嘌呤大量堆积。一旦再灌注恢复O2供给时，活性增高的X O就能催化次黄嘌呤代谢产生大量的O?2 （图10-2）。X O抑制剂别嘌呤醇(allopurinol)能减少O·2 的生成，使缺血－再灌注损伤的发生率降低。

ATP

缺AMP

腺嘌呤核苷黄嘌呤脱氢酶（XDH）

血

次黄嘌呤核苷黄嘌呤氧化酶（XO）

次黄嘌呤黄嘌呤+O2+H2O

O2 XO

O2

尿酸+O2+H2O2

O2+·OH

+H2O2

缺血-再灌注

图10-2 黄嘌呤氧化酶在氧自由基生成增多中的作用

2.激活的白细胞产生自由基缺血组织细胞释放的蛋白水解酶分解蛋白质产生的蛋白片段，膜磷脂分解生成的花生四烯酸及其代谢产物，如羟基廿碳四烯酸（hydroxy-eicosatetraenoic acid,H E T E）和白三烯B4(L T B4)等均为强有力的白细胞激活和趋化物质，可使白细胞激活并聚集于缺血组织及其周围。激活的白细胞又能合

成和释放多种炎症介质，包括促炎细胞因子、脂质炎症介质和炎症趋化因子等，导致白细胞的进一步激活和炎症介质的释放。激活的白细胞通过呼吸爆发(respiratory burst)或氧爆发(oxygen burst)，大量摄取和消耗氧，摄取的氧经过细胞的N A D P H氧化酶和N A D H氧化酶的作用，产生包括氧自由基在内的毒性活性氧。

3.线粒体有研究表明线粒体是心肌再灌注损伤后氧自由基的主要来源。缺血时间越长，产生的氧自由基越多，最终引起线粒体抗氧化产物耗竭。氧自由基增多的机制在于钙超载使线粒体功能受损，细胞色素氧化酶系统功能失调，致氧经单电子还原成的氧自由基增多，经4价还原形成水减少。

4.体内清除自由基能力下降

正常机体清除自由基的机制主要有:

⑴抗氧化酶类如超氧化物岐化酶（S O D）、过氧化氢酶（C A T）、谷胱甘肽过氧化物酶（G S H-P X）等。

⑵抗氧化剂如维生素E、维生素C、辅酶Q等。

正常体内不断有自由基产生，又不断地被上述正常机制所清除，因而不致于对机体造成损害。但在缺血－再灌注损伤时，体内抗自由基的酶类及抗氧化剂被大量消耗，使自由基的清除不足，最终造成自由基增多。

㈢自由基在缺血－再灌注损伤中的作用

由于自由基具有极为活泼的反应性，所以它们能和各种细胞成分(膜磷脂、蛋白质、核酸)发生反应，使细胞产生致命性的损伤。

1、多价不饱和脂肪酸的过氧化，损伤生物膜·O H的化学性质非常活泼，可引发体内多价不饱和脂肪酸的均裂，形成脂性自由基和脂质过氧化物。生物膜内含有多价不饱和脂肪酸，上述连锁反应改变了膜的结构、膜的流动性和膜的通透性，结果导致质膜上的蛋白（酶、离子通道、转运子、受体等）功能障碍；线粒体的生物氧化功能障碍以及溶酶体酶的释放等。细胞膜的通透性改变可使膜对C a2+

的通透性增高，线粒体功能障碍使能量生成减少导致钙泵功能障碍，这些都可造成钙超载。

2.蛋白质和D N A分子结构的变化氧自由基和脂质过氧化物可攻击蛋白质形成蛋白质自由基，后者进一步引起蛋白质分子的聚合及肽链的断裂，也可使蛋白质与脂质结合形成聚合物，从而造成蛋白质的变性和功能丧失；氧自由基可使酶分子发生聚合交联，或修饰酶分子活性中心的氨基酸，或与酶分子中金属离子反应而影响酶的活性；氧自由基可使透明质酸降解，胶原蛋白发生交联，从而使细胞外基质变得疏松、弹性降低。氧自由基还可作用于D N A，与碱基发生加成反应而造成对碱基的修饰，并可引起D N A链的断裂；氧自由基还可以引起染色体的畸变和断裂。

二、钙超载

钙超载（calcium overload ）是指C a2+在细胞内大量积聚。细胞内C a2+浓度与细胞受损程度成正相关，钙超载可引起组织器官严重的结构及功能障碍。

（一）细胞内C a2+的稳态调节（homeostasis ）正常情况下细胞内外C a2+的浓度相差悬殊：细胞内钙浓度（[C a2+]i）为100n m o l/l （10-8~10-7m o l/l），而细胞外钙浓度（[C a2+]e）为2m m o l/l（10-3~10-2m o l/l），两者相差20 000倍；同时细胞内钙分布也是不平均的：约有44％存在于胞内钙库（线粒体及内质网），而胞液中起主要生物活性的游离钙（离子钙）仅为0.005％。如此大的钙电化学梯度的维持，有赖于细胞膜或细胞器膜对钙的不自由通透性及钙转运系统的调节（图10-3）。

图3

图10-3 细胞内钙转运过程

1.C a2+进入胞液的途径C a2+进入胞液是顺浓度梯度的过程。

⑴质膜钙通道质膜钙通道普遍存在各种组织中，是控制胞外钙跨膜内流的主要途径。目前认为有五大类，其中比较重要的为：

①电压依赖性C a2+通道（Voltage operated calcium channel，V O C）。此型C a2+通道的开放与膜电位有关，在膜去极化到一定程度时通道开放，导致胞外的C a2+跨膜内流;②受体操纵性C a2+通道（receptor operated calcium channel,R O C）又称配体门控离子通道(ligand gated calcium channel )。此类受体由多条亚基组成，它们往返穿过细胞膜4～6次（多为4次），这些亚基共同组成离子通道。当其与激动剂结合后，通道便开放，造成离子的跨膜流动。

⑵胞内钙库释放通道C a2+由胞内钙库释放出来是由钙库C a2+释放通道(c a l c i u m r e l e a s e c h a n n e l)介导的。钙库C a2+释放通道属于受体操纵性C a2+通道，包括三磷酸肌醇（I P3）操纵的钙通道(I P3受体通道)、ryanodine敏感的钙通道。

2.C a2+离开胞液的途径C a2+离开胞液是逆浓度梯度、耗能的过程,它依赖于：

⑴C a2+泵的作用C a2+泵即C a2+-A T P 酶，由于该酶的活性不仅依赖于C a2+，还依赖

于M g2+，故又称C a2+-M g2+-A T P酶。它存在于细胞膜、内质网及线粒体膜上。当[C a2+]i升至一定浓度时，C a2+-M g2+-A T P酶被激活，水解A T P供能，并将C a2+泵出细胞或由内质网、线粒体摄取，从而使胞液的C a2+浓度降低。

⑵N a+-C a2+交换是一种非耗能的转运方式，转运方向为双向性。通常是N a+顺着电化学梯度进入细胞，同时C a2+逆着电化学梯度移出细胞。在枪乌贼轴突N a+-C a2+交换动力学的研究中发现，3个N a+交换1个C a2+，此即所谓3N a+-C a2+交换系统或3N a+-C a2+反转运子（antiposter）。

⑶C a2+-H+交换主要见于线粒体。

[C a2+]i升高时，通过C a2+-H+交换使C a2+被线粒体摄取，H+则排至胞液，从而发挥线粒体缓冲[C a2+]i的作用。

（二）缺血-再灌注损伤时钙超载的机制

细胞内C a2+稳态调节的破坏是造成缺血－再灌注损伤时钙超载的根本原因。

1.A T P合成减少由于缺血时A T P生成减少，使各类离子泵的功能不能维持正常，可导致[C a2+]i增加。具体表现在：细胞膜及内质网膜上的C a2+泵不能将胞液内的C a2+主动转运到细胞外和内质网内；细胞膜上的N a+-K+泵功能障碍，导致细胞内N a+增加，此时N a+既可通过线粒体膜上的N a+-C a2+交换，使C a2+从线粒体转运到胞液，又可以通过细胞膜上的N a+-C a2+交换，使细胞外的C a2+进入细胞内，导致[C a2+]i增加，形成钙超载。

细胞中过多的C a2+最终可形成磷酸盐沉积于线粒体，使线粒体的结构和功能进一步被破坏，加重钙超载。

2.p H反常缺血、缺氧造成细胞内酸中毒，再灌或复氧后，细胞外液p H被迅速纠正，而细胞内仍为酸中毒，细胞内外形成显著的p H 梯度，缺血再灌注时迅速纠正缺血组织的酸中毒，能加快缺血再灌注损伤，称为p H反常。p H梯度的形成启动了N a+-H+交换以恢复细胞内p H，但同时造成细胞内N a+浓度升高。细胞

内N a+浓度升高继发激活N a+-C a2+交换，导致

C a2+超载。

3.细胞膜通透性增加缺血、缺氧导致

[C a2+]i增加，C a2+与钙调蛋白(calmodulin )结合形成的复合物可激活磷脂酶和蛋白水解酶，从而造成细胞膜和其他脂质膜的破坏，使膜通透性增加。在此基础上，一旦用含C a2+液体再灌注，使[C a2+]i进一步增高，或者因再灌注时自由基的大量产生，使得缺血引起的细胞膜通透性增加愈加严重，造成胞外C a2+顺浓度梯度大量进入细胞内形成钙超载。

4.儿茶酚胺增多缺血时儿茶酚胺释放增多，通过α和β受体引起C a2+内流增加，其机制为：①儿茶酚胺与β受体结合后，能激活腺苷酸环化酶(A C)，产生c A M P，后者可激活蛋白激酶A(P K A)；P K A能使膜上的L型C a2+通道磷酸化，结果促进细胞外C a2+通过L-型C a2+通道内流；②儿茶酚胺还能通过α受体激活磷脂酶C，产生三磷酸肌醇(I P3)，后者通过与内质网/肌浆网上I P3受体结合，打开C a2+通道，造

成细胞内钙库释放C a2+，导致细胞内C a2+浓度增高。

（三）钙超载引起再灌注损伤的机制

如上所述，缺血－再灌注损伤造成的细胞损害可导致C a2+超载，而C a2+超载又可进一步加重细胞损害，此种恶性循环的形成最终导致细胞坏死。关于钙超载引起细胞损伤的机制主要与以下因素有关：

1.线粒体功能障碍结果造成细胞能量供应的严重不足，其原因在于：一方面，缺血－再灌注损伤使[C a2+]i升高，线粒体对C a2+的摄取也随之增加，而线粒体的摄C a2+过程是依赖A T P的，故大量的A T P在此过程中被消耗；另一方面，C a2+在线粒体中形成的磷酸盐沉积抑制A T P的产生，使A T P不断减少以至耗竭。

2.钙依赖性的降解酶的激活[C a2+]i升高使C a2+和钙调蛋白（C a M）结合增多，由此可激活多种钙依赖性的降解酶，如磷脂酶、蛋白水解酶、核酸内切酶等。这些降解酶的活化

引起细胞膜、细胞器膜、细胞骨架和核酸的分解，导致细胞坏死。

3.促进活性氧的生成C a2+超载可使活性氧的产生增多，从而加重细胞损害。机制在于：①钙依赖性蛋白水解酶的激活：使X D H 转化为X O，产生大量的氧自由基；②钙依赖的磷脂酶A2的激活：引发花生四烯酸（A A）代谢。A A通过环加氧酶和脂加氧酶的作用产生大量的·O H和H2O2，后两者作用于细胞膜，形成脂质过氧化物。

钙超载可以引起细胞损伤，体外已有实验表明，用钙离子的拮抗剂可以防止动物缺血后神经元内钙的过度增高，减少神经元的死亡和降低动物的死亡率。

三、炎症反应的作用

缺血－再灌注损伤的局部变化是炎症反应，其原因在于：①缺血、缺氧诱导炎症介质的产生（包括活性氧、促炎细胞因子、炎症趋化因子等）②组织坏死产物的刺激。炎症是机体的防御反应，但对机体又造成损害。缺血－

再灌注损伤时，由于不存在病原体，因而炎症反应对机体的不利一面就显得愈加突出。

(一)缺血－再灌注导致炎症反应

缺血－再灌注损伤时有炎症介质的释放，炎症介质包括促炎的细胞因子如T N F 、I L-1、I L-8；脂质炎症介质如白三烯(L T s)、血栓素A2(T X A2)、血小板活化因子(P A F)以及补体和激肽等。它们一般都具有以下作用：①激活炎细胞（主要包括单核巨噬细胞、中性粒细胞）、内皮细胞和血小板。炎细胞被激活后又能合成和释放多种炎症介质，导致炎症反应的进一步扩大；②使血管内皮细胞收缩，血管壁通透性升高；③使血管和其它部位的平滑肌收缩；④诱导细胞粘附分子的表达。此外，多种炎症介质还能促进内皮细胞、血小板分泌促凝物质，而有些炎症介质，如P A F、T X A2本身还有促凝作用。

白细胞与内皮细胞的粘附反应以及白细胞穿过血管壁趋化游走、进入炎症灶内是炎症

反应的主要环节，细胞粘附分子在其中发挥了重要作用。参与白细胞与血管内皮细胞粘附的粘附分子主要有：选择素家族(如L-选择素、E-选择素、P-选择素等)、整合素家族(如M a c-1、L F A-l和V L A-4等)和免疫球蛋白超家族(如I C A M-1和V C A M-1等)的粘附分子。在静息状态下，微血管内皮细胞仅表达少量与白细胞特异结合的粘附分子，如I C A M-2。白细胞虽表达与内皮细胞粘附的粘附分子，但表达量亦低。在缺血－再灌注损伤时，炎症介质可促进白细胞和内皮细胞表达粘附分子。不同的粘附分子表达具有不同的时相性。两种细胞上的粘附分子分别作为配体和受体介导白细胞和内皮细胞之间的粘附反应。白细胞向炎症部位的浸润经历了以下几个阶段(图10-4)：

1.滚动阶段此阶段中性粒细胞和内皮细胞被激活，内皮细胞胞浆小体(weible-palade小体)膜内侧的P-选择素迅速转移到质膜上来，与白细胞表面的寡糖配体S L e x和S L e a结合，起捕获白细胞的作用；同时，白细胞也可借其表面