胶体金标记技术

胶体金标记技术

胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物或显色剂，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。由于它不存在内源酶干扰及放射性同位素污染等问题，且利用不同颗粒大小的胶体金还可以作双重甚至多重标记，使定位更加精确。因此已成为继荧光素、酶、同位素及乳胶标记技术之后的一种新型标记技术。现已广泛应用于电镜、流式细胞仪、免疫印迹、蛋白染色、体外诊断试剂的制造等领域。

用胶体金作为特殊标记物的研究始于60年代初，1962年Feldberr等报道了用胶体金标记细胞进行电子显微镜的研究。1971年，Taylor又将胶体金引入电镜免疫标记技术中。近年来的研究表明，胶体金也可作为体外免疫加层试验的指示物。由于胶体金作为标记物具有很多优点，因此自其问世以来，在国内外的许多研究领域中得到了迅速的发展。

近年来，它更多的被应用于免疫学和细胞学相关分子水平的检测中。尤其随着人们物质生活的改善，有关人类健康的问题在现实生活中已显得非常突出。从90年代至今的多篇报道都是关于动物体或人体相关抗体和病原体检测的。

制备方法

在溶液中金颗粒呈圆形，边缘平整，界线十分清楚。金颗粒表面带有大量负电荷，由于静电的排斥力，使其在水中保持稳定状态，形成稳定的胶体，所以称其为胶体金。胶体金的制作方法有白磷还原法，抗坏血酸还原法，柠檬酸三钠还原法和鞣酸—柠檬酸三钠还原法。通过改变反应体系中氯金酸与还原剂的比例（即增加或减少还原剂的量）可得到所需不同直径的金颗粒。

但前两种方法制备得到的金颗粒直径大小不均一，所以目前常用后两种方法，以柠檬酸三钠还原法为例，有两种方法。

1．Frens标准方法：

1)取0.01%HAuCl4溶液50mL,加热煮沸，随即快速加入1%柠檬酸三钠溶液0.5mL。

2)约过25s沸腾的溶液变为淡蓝色，大约再过70s，蓝色突然转变为亮红色，

3)继续煮沸约5分钟后结束反应。

4)冷却后用0.1M K2CO3溶液调至所需PH值。

5)此后再延长反应时间或另加入额外的柠檬酸三钠都不影响实验结果。

该法制备得到的金颗粒直径约为41nm，如前所述要想得到更大或更小的金颗粒，该方法依然可行，唯一不同的是需要改变加入还原剂的量。另外，采用此标准方法所需反应时间最短。2．Slot标准方法：

1)取1mL1%HAuCl4溶液溶于100mL水中，2)再加入2mL1%二水柠檬酸钠溶液。

3)将该混合溶液加热煮沸约15~30min，直至溶液颜色变为亮红色，

4)冷却后，用0.1M K2CO3溶液调整PH值，该法制备的金颗粒直径约为15nm。

胶体金标记蛋白的原理是：在碱性条件下，胶体金颗粒表面带负电荷，可与蛋白质所带正电荷基团之间产生静电吸引而牢固结合，这种结合对所标记蛋白的生物学活性无明显影响。

胶体金免疫技术可大致分为液相胶体金标记技术和固相胶体金标记技术，其分类依据同酶免疫技术。最早的液相胶体金标记技术叫免疫金染色法（IGS），它仅以胶体金作为标记物和显色剂。最初的免疫金染色都采用单标记。即采用大小均一的金颗粒进行标记。后来发展到可利用不同颗粒大小的胶体金作双重标记甚至多重标记。但该方法均仅以胶体金显色，需要较高浓度的标记物，耗费抗体或抗原的量较多，而且需要较大直径的金颗粒（40-50nm），才能获得较高的灵敏度，而且当金颗粒过大时，标记物不稳定，长期贮存容易发生自动聚集。

为克服以上缺点，免疫金银染色法（IGSS）应运而生。该方法的原理是，先用胶体金标记物作免疫金染色，再加入含银的物理显影液，则银离子靠电荷吸引，大量吸附于金颗粒周围，使显色结果呈现金属银的蓝灰色，同时将显色信号进一步放大。应用时，由于本法最终显色是靠金属银的吸附沉积，因此不需要高浓度的胶体金标记物，将胶体金标记物稀释几十倍，仍可获得同免疫金染色一样的最佳效果。这样不仅可以节省大量的抗体或抗原标记物，而且可以节省大量的胶体金。本方法灵敏度的关键在于胶体金吸附银颗粒的数量。小直径的

胶体金比大颗粒胶体金能吸附更多的银离子，而且小颗粒胶体金比大颗粒胶体金更为稳定。所以，在同样的能见度下，免疫金银染色法所需的胶体金颗粒更为稳定。所以在同样的能见度下，免疫金银染色法所需的胶体金颗粒也较小。据Holgate称，免疫金银染色法的灵敏度甚至比Sternberger的PAP法还要高出很多。该方法一度存在的主要问题在于背景染色过高，但1984年，Springgall等通过修改物理显影操作程序，已基本解决这个问题。固相免疫胶体金标记技术出现较晚，其原理与液相标记一样。所不同的只是通过不同的方法最终将胶体金标记物吸附于固相支持物表面，近而进行检测。

常用的固相免疫胶体金标记技术有胶体金免疫层析法和胶体金免疫渗滤法。胶体金免疫层析法是根据层析原理，将胶体金标记的抗原或抗体固定在层析用固相支持物上，通过层析作用，使抗原与抗体专一性结合。胶体金免疫渗滤法是让抗原与胶体金标记过的抗体分别滤过有一定孔径的膜（常用NC膜），在此过程中抗原与抗体专一性结合，未专一性结合的抗体滤过膜。两种方法都最终通过胶体金聚集产生的颜色变化作为结果判断的依据。为了减少胶体金用量，常常通过银染加强显色。

应用

免疫胶体金技术可以快速，灵敏检测特定蛋白，这种技术避免了复杂的操作，无需特殊检测仪器，可以适应多种检测环境，以及多种检测需要。并且，检测结果可以长期保存，便于对照分析。使检测更具有普遍性。

免疫胶体金标记技术作为一种日臻完善的检测技术，已被广泛的应用于众多的科研领域中。本实验采用斑点免疫金—银染色法（Dot-Immuno-Gold-Silver Straining Method，Dot-IGSS），利用NC膜可以与带负电荷的蛋白质产生较强的疏水作用，从而使目标蛋白与NC膜产生较强亲和力的特性，以及NC膜易于被封闭的特点，使用NC膜作为固相载体。先使被FMDV免疫过的牛血清（含FMDV抗体蛋白）与NC膜结合，然后使用合适的封闭液将NC 膜未结合蛋白的位点封闭，再用胶体金标记过的抗FMDV抗体蛋白的二抗与FMDV免疫过的牛血清作用（利用抗原抗体的特异性结合反应），将未特异性结合的蛋白用PBN溶液和DDW洗脱。最后，利用胶体金可以与银离子产生电荷吸引，通过银染加强显色效果（胶体金本身呈淡红色，银染后呈蓝黑色），使得可以通过肉眼直接观察结果。本方法具有简便快速，灵敏度高，可直接用肉眼判断结果，无须特殊的设备的优点。

胶体金的制备

胶体金是氯金酸在还原剂作用下，聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电荷的疏水胶溶液。根据实验需要，可以利用不同的还原剂制备成直径大小不同的胶体金颗粒。

（一）白磷还原法

【试剂及材料】

（1）HAuCl4水溶液（2）0.2mol/L K2CO3

（3）白磷乙醚饱和液：在水中将白磷切成小片，用镊子快速取出，在滤纸上吸干后，放入小瓶，迅速加入10ml纯乙醚，塞紧瓶口，轻轻摇动至少2h，使乙醚充分饱和，倒入玻璃离心管中离心，弃去沉淀物及未溶解的白磷。取上清贮存于密闭的棕色瓶内。

【操作方法一】

（1）取0.01%HAuCl4水溶液100ml，用0.2mol/L K2CO3调节至pH7.2，加热煮沸；

（2）在刚开始煮沸时，迅速加入0.5ml白磷乙醚饱和液，摇匀，至溶液呈橙红色为止。（3）此法制备的胶体金颗粒直径为3nm，大小较均一。

【操作方法二】

（1）取1.5ml 0.6%HAuCl4水溶液和1.4ml 0.2mol/L K2CO3加至120ml双蒸水中；

（2）再加1ml 白磷乙醚混合液，室稳搅拌15min；

（3）煮沸，回流至溶液由棕红色变为红色，约5min；

（4）此法制备的胶体金颗粒直径为6nm。

（二）抗坏血酸还原法

【试剂及材料】

（1）HAuCl4水溶液（2）0.2mol/L K2CO3（3）0.7%抗坏血酸水溶液

【操作方法】

（1）取1%HAuCl4水溶液1ml置烧杯内，用1.4ml 0.2mol/L K2CO3及25ml双蒸水；

（2）混匀，置冰浴中，搅拌下加入1ml0.7%抗坏血酸水溶液，溶液呈紫红色；

（3）随后加蒸馏水至100ml，加热至溶液变为红色为止。

（4）此法制备的胶体金颗粒直径为8-13nm。

（三）枸橼酸三钠还原法

【试剂及材料】

（1）HAuCl4水溶液（2）1%枸橼酸三钠水溶液（3）0.2mol/L K2CO3

【操作方法一】

（1）取0.01%HAuCl4水溶液100ml置于烧杯内；

（2）加入3ml 1%枸橼酸三钠水溶液，加热煮沸30min，冷却至4℃，溶液呈红色；

（3）此法制备的胶体金颗粒直径为10nm，大小均一。

【操作方法二】

（1）取0.01%HAuCl4水溶液100ml置于烧杯内；

（2）加入2ml 1%枸橼酸三钠水溶液，加热煮沸15-30min，直至溶液呈红色；

（3）冷却后，加入0.5ml 0.2mol/L K2CO3混匀。

（4）此法制备的胶体金颗粒直径为15nm，大小均一。

【操作方法二】

（1）取0.01%HAuCl4水溶液100ml置于烧杯内，加热煮沸；

（2）根据需要加入2.5ml、1ml或0.75ml 1%枸橼酸三钠水溶液，继续加热煮沸5min，直至溶液呈橙红色；

（3）此法制备的胶体金颗粒直径分别为18-20nm、30nm或50nm，大小均一。

【注意事项】

（1）玻璃器皿必须严格清洗，绝对洁净后干烤。最好经过硅化处理，或用第一次配制的胶体金稳定玻璃器皿表面后，再用双蒸水清洗后使用。否则影响生物大分子与金颗粒结合和活化后胶体金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的胶体金颗粒。

（2）所有试剂均需要使用双蒸水或三蒸水配制，最好用微孔滤膜（0.45um）过滤，以去除其中的聚合物和其他可能混入的杂质.

（3）配制胶体金溶液的pH值以中性为宜。将氯金酸配制成1%HAuCl4水溶液，在4℃可保存数月稳定。

胶体金标记蛋白的制备

【基本原理】

胶体金标记实质上是抗体蛋白等生物大分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附的机理可能是胶体金表面所带的负电荷与蛋白质分子所带的正电荷之间靠静电力相互吸引，达到范德华引力内即形成牢固的结合。另外，胶体金颗粒的粗糙也是有利于形成吸附的重要条件。由于这种标记过程主要是靠物理吸附作用，因而对蛋白质分子的生物学活性没有明显影响。

【试剂及材料】

（1）胶体金溶液（2）待标记蛋白（3）0.1mol/L K2CO3（4）1%聚乙二醇（PEG，分子量20KD）（5）0.05mol/L，pH9.0硼酸盐缓冲液（6）10% NaCl溶液（7）超速离心机

【操作方法】

（1）待标记蛋白质前处理将待标记蛋白溶液预先对0.05mol/L ，pH7.0 NaCl 4℃透析过夜，去除多余的盐离子，再经10000g 4℃离心1h，去除聚合物。

（2）胶体金溶液的前处理胶体金对蛋白质的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或略偏碱的pH条件下，二者容易形成牢固的结合物。如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。因此预先调节胶体金的pH值尤为重要（用0.1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl）

①标记IgG时，胶体金溶液的pH值调节至9.0；②标记McAb时，胶体金溶液的pH值调节至8.2；③标记亲和层析抗体时，胶体金溶液的pH值调节至7.6；④标记SPA时，胶体金溶液的pH值调节至5.9-6.2；⑤标记亲和素时，胶体金溶液的pH值调节至9.0-10.0；

⑥标记链霉亲和素时，胶体金溶液的pH值调节至7.4或6.6；

（3）待标记蛋白质与胶体金用量比例的确定①根据标记蛋白质的要求，调节胶体金溶液的pH值后，分装10管，每管1ml；②将待标记蛋白质(以IgG为例)用0.05mol/L，pH9.0硼酸盐缓冲液作系列稀释为5-50mg/ml，分别取1ml加入1管胶体金溶液中.对照组加1ml稀释液(不含蛋白质)，混匀；③放置5min后，在上述各管内加入0.1ml 10% NaCl溶液，混匀静置2h，观察结果；④未加蛋白质（对照管）和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管，呈现由红色变为兰色的聚集现象；而假如蛋白质的量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。其中含蛋白质最低的试管即为稳定1ml胶体金所需的蛋白质量，在此基础上再加10%-20%，即为待标记蛋白（IgG）的实际用量。

（4）胶体金与蛋白质的结合

下面分别介绍抗体、葡萄球菌A蛋白与胶体金结合的操作过程。

①抗体蛋白(IgG)的标记A）按上述方法确定两种试剂的最适用量后，分别取所需量的胶体金和相应的抗体蛋白（IgG），用用0.1mol/L K2CO3调节pH值至9.0；B）在搅拌下将胶体金溶液和抗体蛋白液混合；C）10min后，加入一定量的稳定剂，以防止抗体蛋白和胶体金的聚合和发生沉淀。常用5%BSA ，使其终浓度为1%，或加入1%聚乙二醇至标记总量的10%；

②葡萄球菌A蛋白(SPA)的标记A）取高纯度的SPA溶于0.1-0.2ml的蒸馏水中，B）将胶体金溶液的pH值调至6.0；C）按以下组合将SPA与胶体金混合：30mg SPA，加入10ml 15nm胶体金溶液；60mg SPA，加入10ml 3nm胶体金溶液；80mg SPA，加入10ml 8-13nm 胶体金溶液；D）混合3min后，没25ml SPA-胶体金结合物内加入1ml 1%PEG溶液。（5）胶体金标记蛋白的纯化（超速离心法）

根据胶体金颗粒的大小、标记蛋白的种类及稳定剂不同，选用不同的离心速度：

①以BSA作稳定剂的胶体金-羊抗鼠IgG结合物A）先低速离心，弃去聚集的胶体金颗粒，一般为5nm用9000r/min 离心20min；20nm用2000r/min 离心20min；B）再高速离心：5nm

胶体金结合物，60000g，4℃离心1h；20-40nm胶体金结合物，14000g，4℃离心1h；C）仔细吸去上清，沉淀物用含1%BSA的0.01mol/L，pH7.6 PB混悬至原量；D）平衡过夜后，同上重复离心2次，最后用1%BSA的0.01mol/L，pH7.6 PB(0.02%NaN3) 混悬至原量的1/10，分装，4℃保存。结合物内加50%的甘油可贮存于-18℃一年以上。

②以PEG为稳定剂的胶体金-SPA结合物A）高速离心：3-5 nm胶体金结合物，100，000g，4℃离心1.5-2h；8-13 nm胶体金结合物，80，000g，4℃离心1h；15 nm胶体金结合物，60，000g，4℃离心45min-1h；B）仔细吸去上清，沉淀物用0.01mol/L，pH7.6 PBS混悬至原量；C）同上重复离心2次，以保证除净未结合的SPA，最后用0.01mol/L，pH7.6 PBS(0.02%NaN3) 混悬至原量的1/20，分装，4℃保存。结合物可保存数年。

（6）胶体金-蛋白结合物的质量鉴定

①胶体金颗粒平均直径的测定②胶体金-蛋白质溶液的OD520nm值的测定：一般应用液的OD520nm值应为0.2-0.4。③金标蛋白的特异性与敏感性的测定：见胶体金标记技术的应用。

斑点免疫金银染色法（dot-IGS/IGSS）

1984年，Moeremans等将斑点酶联免疫吸附法（dot-ELISA）与免疫金银染色法相结合，建立了固相载体上的斑点免疫金银染色法（dot-IGS/IGSS）。

【基本原理】

蛋白质抗原通过直接点样或转移电泳吸附在硝酸纤维素膜（NC膜）上，与特异性抗体反应后，在滴加（或浸入）胶体金标记的第二抗体，结果在抗原抗体发生金颗粒聚集，形成肉眼可见的粉红色斑点，称为斑点免疫金染色（dot-IGS）。此反应可再提高银显色液增强，即斑点免疫金银染色法（dot-IGS/IGSS）。

【试剂及材料】

（1）NC膜（2）20mol/L，pH7.6 PBS（3）BSA（4）定影液：20%硫代硫酸钠。（5）电泳仪和电转仪（6）其它试剂同上

【操作方法】

（1）用微量加样器在NC膜上直接点样1-2ml（若抗原含量少，可重复点样），或经转移电泳将抗原吸附在NC膜上，自然干燥；

（2）将点样后的NC膜浸入含5%BSA和0.05% NaN3的20mol/L，pH7.6 PBS内，37℃，30min，以封闭未饱和的蛋白质结合位点；

（3）用含0.1%BSA的TBS洗三次，每次5min；滴加适当稀释的一抗(1-2mg/ml，用含0.1%BSA 和正常羊或兔血清的TBS稀释)，阴性对照用稀释液代替抗体，在室温下，反应2h；

（4）用含0.1%BSA的TBS洗三次，每次5min后，将NC膜浸入金标二抗溶液中（金标抗体用含0.4%明胶和0.1%BSA的TBS适当稀释）。反应时间视金标抗体的稀释度而定：一般1：25稀释（OD520nm值约为0.2），反应时间为2h；1：100-1：200稀释（OD520nm值约为0.005），反应时间为16h；

（5）TBS冲洗，即可观察结果。此过程为dot-IGS。

（6）需要是可继续进行银显色反应，行dot-IGSS：将金标抗体染色后的NC膜，用TBS洗三次，每次5min，再用蒸馏水洗涤两次以去除Cl—，浸入0.2mol/L，pH3.5枸橼酸缓冲液内2min；

（7）移入银显色液中，避光显色5-10min后，再移入定影液中，定影5min；

（8）自来水冲洗，自然干燥；

【结果观察】dot-IGS：在NC膜上呈粉红色；dot-IGSS：在NC膜上呈棕黑色。

彩色免疫金银染色法

【基本原理】彩色免疫金银染色法是抗原位点处生成的银颗粒经铁氰化钾与溴化钾的作用被氧化成溴化银，后者与彩色显影剂反应被还原成金属银，而彩色显影剂本身则被氧化，其氧化产物使彩色还原剂由无色变为有色的染料并沉积在银颗粒部位，金属银变成银离子。【试剂及材料】

（1）Lugol’s碘液（2）含5%硫代硫酸钠和1%亚硫酸钠溶液（3）2%铁氰化钾和1%溴化钾溶液（4）其余试剂同上

【操作方法】

（1）石蜡切片常规脱蜡水合（细胞甩片、爬片或冰冻切片固定后用TBS洗）；

（2）依次与0.1%胰蛋白酶，37℃，消化30min；Lugol’s碘液5min；5%硫代硫酸钠1min；TBS洗5min；

（1）加1%的卵蛋白，室温15min ，TBS洗5min；加适当稀释的一抗，置湿盒内，4℃过夜；

（2）TBS洗三次，每次5min，加1%的卵蛋白，室温15min；

（3）TBS洗5min，加适当稀释的胶体金标记的二抗，置湿盒内，4℃过夜；

（4）TBS洗三次，每次5min，再用蒸馏水洗后，将切片放入硝酸银显色液，避光显色

5-10min；

（5）用蒸馏水冲洗，2%铁氰化钾和1%溴化钾作用1min；

（6）用蒸馏水冲洗，彩色显色液显影；

（7）用蒸馏水冲洗，依次与2%铁氰化钾和1%溴化钾作用1min；5%硫代硫酸钠和1%亚硫酸钠作用5min，自来水冲洗，缓冲甘油封片；

【结果观察】镜检，抗原抗体反应处呈兰色（a-萘酚）或绿色（菲尼酮）。

免疫金银染色法（immunogold-silver taining，IGSS）

【基本原理】

免疫金银染色法是利用银显影液，胶体金颗粒起着液化作用，使显影液中的银离子在还原剂（对苯二酚）存在情况下被还原成银原子，在金颗粒周围形成一个“银壳”，由于金颗粒的液化作用，使更多的银离子被还原，“银壳”增大，最后使抗原位置得以放大。

【试剂及材料】

（1）0．5%胰蛋白酶或胃蛋白酶：用0.05mol/L ，pH7.4 配制TBS

（2）1%的卵蛋白：用0.05mol/L ，pH7.4 配制TBS

（3）0.05mol/L ，pH7.4TBS

（4）一抗和金标二抗

（5）pH3.5枸橼酸缓冲液；枸橼酸2.25g，枸橼酸三钠2.35g，加蒸馏水100ml溶解即成。（6）硝酸银显色液：1%明胶液60ml，pH3.5枸橼酸缓冲液10ml，对苯二酚溶液30ml（1.7g 对苯二酚溶于30ml蒸馏水中），磁力搅拌混匀，临用前加入含42.5mg硝酸银的水溶液2ml。【操作方法】

（1）石蜡切片常规脱蜡水合（细胞甩片、爬片或冰冻切片固定后用TBS洗）；

（2）于细胞、组织上铺满0.5%胰蛋白酶，37℃，消化30min，有些抗原较强的切片可不经这一步处理；

（3）TBS洗，加1%的卵蛋白，室温15min；

（4）TBS洗5min，加适当稀释的一抗（大约25ml），置湿盒内，4℃过夜；

（5）TBS洗三次，每次5min，加1%的卵蛋白，室温15min；

（6）TBS洗5min，，加适当稀释的胶体金标记的二抗，置湿盒内，4℃过夜；

（7）TBS洗三次，每次5min，再用蒸馏水洗；

（8）将切片放入硝酸银显色液，避光显色5-10min；

（9）用蒸馏水洗，常规脱水、透明、中性树胶封片；

【结果观察】镜检，抗原抗体反应处呈棕黑色。