免疫胶体金标记手册

浙江大学电子显微镜室浙江大学生物技术研究所胶体金免疫标记技术培训班

技术资料

胡东维洪健徐颖

精品

浙江大学2001年10月

一、胶体金的制备

根据不同的制备方法，可以制备出直径1－500nm的胶体金粒子，但做为免疫标记探针，其直径应在3-30nm范围内。

在氯化金（HAuCl4）水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同种类、不同剂量的还原剂，可以控制所产生的粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。还原剂浓度越高，核浓度也越高，氯化金的还原也就从更多的还原中心开始，因此产生的胶体金粒子数量越多，但体积也越小。粒子直径每增加一倍，数量减少为原来的1/8。

以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂，能够制备大小相对一致、直径3～16nm的胶体金。因此一般胶体金探针均使用该方法进行。但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄，而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。此时在溶液中添加0.1～0.2％的H2O2能够去除这些残基。双标记或制备5-10 nm的胶体金时建议使用该方法。

利用柠檬酸为还原剂，可以制备12～150 nm直径的胶体金。但制备大体积的胶体金时，胶体金粒子的误差也同时增加。因此做单标记时，建议使用该方法制备12-16 nm直径的胶体金。

除了上述方法外，也可以用磷作为还原剂来制备5 nm的胶体金，它避免了单宁酸残基的问题，但所形成的金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒，制备的残液需进一步处理，故该方法已经很少使用。

氯化金极易吸湿，故一般均以小剂量密封保存（0.5g或1g），因此在配制氯化金溶液时一次配完，暂时不用的可以用1.5 ml试管分装为1 ml保存（-20℃）。注意各种玻璃器皿一定要洗净并用双蒸水多次冲洗，有条件时可硅化处理（1％双氯硅烷/氯仿浸泡1小时，烘干）。配制各种试剂时均使用双蒸水，随后再用0.22 m微孔滤膜过滤后使用。三角瓶可反复多次使用，不用时应密封保存，以防污染。

制备好的胶体金保存寿命较长，可4℃保存6个月以上或室温下保存1-2个月。当出现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。但无论无何，在保存较长时间后应进行镜检，如出现大量胶体金粒子凝集，说明已经过期。

1、单宁酸/柠檬酸钠法制备3～16 nm胶体金

(1)取一250 ml三角瓶，加入79 ml双蒸水和1 ml 1％氯化金，预热至60～70℃。

(2)取一50 ml烧杯，加入4 ml 1％柠檬酸钠，然后根据所制备金粒子体积大小加入

不同用量的单宁酸及等量的25 mM K2CO3。预热至60～70℃。K2CO3的作用是保持溶液的中性pH。因此如果单宁酸的量少于0.5 ml时，对pH的影响不大，K2CO3可以省略。

(3)将上两种溶液迅速混合并充分混匀，加热至沸并保温10分钟。自然冷却。

柠檬酸钠（ml）单宁酸（ l）胶体金（nm）

4 5000 3

4 2000 4

4 500 6

4 120 8

4 70 10

4 10 16

2、白磷还原法制备5 nm胶体金

(1)取250 ml三角瓶一个，加79 ml双蒸水，1 ml 1%氯化金，并用0.25 M K2CO3

将溶液调至中性（pH7.0）。

(2)取0.2 ml饱和磷/乙醚溶液加到1.5 ml试管中，再加0.8 ml乙醚，混匀。取0.7

ml加入溶液（1）中(磷有毒且易燃，操作请带手套，多余的磷溶液用CuSO4进行中和)。

(3)室温下轻轻摇匀15 min，然后加热沸腾并保持5 min，自然冷却。

3、柠檬酸三钠法制备12-30 nm胶体金(Frens, 1973)

(1)取250 ml三角瓶一个，加100 ml双蒸水及1 ml 1%氯化金，加热沸腾；

(2)取不同量的1%柠檬酸钠加入上述溶液中。混匀，再保持沸腾30 min，溶液颜色

首先变黑，再逐渐变红，粒子体积较小时，溶液呈桔红色，而粒子体积较大时，

柠檬酸钠(ml) 胶体金(nm)

5 12

4 16

3 24

2.8 30

则颜色偏向紫色。

注意：

(1)由于使用试剂质量及其它方面可能存在的误差，以及制备过程中的其它问题，胶体金粒子的大

小及一致性与理论值可能有偏差，因此，在制备完成后必须进行镜检。如出现粒子体积偏差太大，粒子凝聚，粒子边缘不清晰等问题，须重新制备。

(2)胶体金溶液最好保存在4℃冰箱中；也可保存在室温下，一般可保存1-2个月。但决不可保存

在0℃以下，否则金粒子发生凝聚。

二、蛋白-金复合体的制备

一般认为胶体金粒子表面为一层AuCl2，因此，粒子表面带有负电荷，这种负电荷粒子之间相互排斥，形成稳定悬浮的胶体金溶液。

金颗粒表面可以包被一层生物大分子（如蛋白）来稳定和保护这些粒子，以免受外来