免疫胶体金标记手册
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浙江大学电子显微镜室浙江大学生物技术研究所
胶体金免疫标记技术培训班
技术资料
胡东维洪健徐颖
浙江大学
2001年10月
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一、胶体金的制备
根据不同的制备方法，可以制备出直径1－500nm的胶体金粒子，但做为免疫标记探针，其直径应在3-30nm范围内。
在氯化金（HAuCl4）水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同种类、不同剂量的还原剂，可以控制所产生的粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。还原剂浓度越高，核浓度也越高，氯化金的还原也就从更多的还原中心开始，因此产生的胶体金粒子数量越多，但体积也越小。粒子直径每增加一倍，数量减少为原来的1/8。
以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂，能够制备大小相对一致、直径3～16nm的胶体金。因此一般胶体金探针均使用该方法进行。但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄，而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。此时在溶液中添加0.1～0.2％的H2O2能够去除这些残基。双标记或制备5-10 nm的胶体金时建议使用该方法。
利用柠檬酸为还原剂，可以制备12～150 nm直径的胶体金。但制备大体积的胶体金时，胶体金粒子的误差也同时增加。因此做单标记时，建议使用该方法制备12-16 nm直径的胶体金。
除了上述方法外，也可以用磷作为还原剂来制备5 nm的胶体金，它避免了单宁酸残基的问题，但所形成的金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒，制备的残液需进一步处理，故该方法已经很少使用。
氯化金极易吸湿，故一般均以小剂量密封保存（0.5g或1g），因此在配制氯化金溶液时一次配完，暂时不用的可以用1.5 ml试管分装为1 ml保存（-20℃）。注意各种玻璃器皿一定要洗净并用双蒸水多次冲洗，有条件时可硅化处理（1％双氯硅烷/氯仿浸泡1小时，烘干）。配制各种试剂时均使用双蒸水，随后再用0.22 m微孔滤膜过滤后使用。三角瓶可反复多次使用，不用时应密封保存，以防污染。
制备好的胶体金保存寿命较长，可4℃保存6个月以上或室温下保存1-2个月。当出现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。但无论无何，在保存较长时间后应进行镜检，如出现大量胶体金粒子凝集，说明已经过期。
1、单宁酸/柠檬酸钠法制备3～16 nm胶体金
(1)取一250 ml三角瓶，加入79 ml双蒸水和1 ml 1％氯化金，预热至60～70℃。
(2)取一50 ml烧杯，加入4 ml 1％柠檬酸钠，然后根据所制备金粒子体积大小加入不
同用量的单宁酸及等量的25 mM K2CO3。预热至60～70℃。K2CO3的作用是保持
溶液的中性pH。因此如果单宁酸的量少于0.5 ml时，对pH的影响不大，K2CO3
可以省略。
(3)将上两种溶液迅速混合并充分混匀，加热至沸并保温10分钟。自然冷却。
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免疫胶体金标记手册
浙江大学电子显微镜室浙江大学生物技术研究所胶体金免疫标记技术培训班 技术资料 胡东维洪健徐颖
浙江大学2001年10月
一、胶体金的制备 根据不同的制备方法，可以制备出直径1－500nm的胶体金粒子，但做为免疫标记探针，其直径应在3-30nm范围内。 在氯化金（HAuCl4）水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同种类、不同剂量的还原剂，可以控制所产生的粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。还原剂浓度越高，核浓度也越高，氯化金的还原也就从更多的还原中心开始，因此产生的胶体金粒子数量越多，但体积也越小。粒子直径每增加一倍，数量减少为原来的1/8。 以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂，能够制备大小相对一致、直径3～16nm的胶体金。因此一般胶体金探针均使用该方法进行。但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄，而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。此时在溶液中添加0.1～0.2％的H2O2能够去除这些残基。双标记或制备5-10 nm的胶体金时建议使用该方法。 利用柠檬酸为还原剂，可以制备12～150 nm直径的胶体金。但制备大体积的胶体金时，胶体金粒子的误差也同时增加。因此做单标记时，建议使用该方法制备12-16 nm直径的胶体金。 除了上述方法外，也可以用磷作为还原剂来制备5 nm的胶体金，它避免了单宁酸残基的问题，但所形成的金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒，制备的残液需进一步处理，故该方法已经很少使用。 氯化金极易吸湿，故一般均以小剂量密封保存（0.5g或1g），因此在配制氯化金溶液时一次配完，暂时不用的可以用1.5 ml试管分装为1 ml保存（-20℃）。注意各种玻璃器皿一定要洗净并用双蒸水多次冲洗，有条件时可硅化处理（1％双氯硅烷/氯仿浸泡1小时，烘干）。配制各种试剂时均使用双蒸水，随后再用0.22 m微孔滤膜过滤后使用。三角瓶可反复多次使用，不用时应密封保存，以防污染。 制备好的胶体金保存寿命较长，可4℃保存6个月以上或室温下保存1-2个月。当出现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。但无论无何，在保存较长时间后应进行镜检，如出现大量胶体金粒子凝集，说明已经过期。 1、单宁酸/柠檬酸钠法制备3～16 nm胶体金 (1)取一250 ml三角瓶，加入79 ml双蒸水和1 ml 1％氯化金，预热至60～70℃。 (2)取一50 ml烧杯，加入4 ml 1％柠檬酸钠，然后根据所制备金粒子体积大小加入不
免疫胶体金技术常见影响因素分析
免疫胶体金技术常见影响因素分析 自胶体金作为特殊标记物进行研究以来,建立的各种免疫胶体金技术以其特异性强、灵敏度高、操作简捷等特点,在医学、农牧业、环境及食品检测等领域被广泛应用。免疫胶体金技术的反应过程是一个由金颗粒、抗原与抗体动态结合的反应过程,在这个过程中每个环节的好坏都直接影响试验的成败。而试验过程中每个环节又受到很多因素的影响和制约,下面将影响免疫胶体金技术的因素作一分析,为成功制备胶体金检测产品提供参考。 1耗材的选择 1.1不同型号膜的筛选。硝酸纤维素膜的型号在试验中至关重要,作为反应载体影响到整个试验的成败。不同的生产厂家生产硝酸纤维素膜时使用的聚合物和表面活性剂的来源、类型和数量均大不相同,对生产出的膜的性能产生较大影响——膜的孔径和分布结构不同。膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增;膜孔径越小,层析速度也越慢,金标复合物通过T线的时间就越长,反应也就越充分;因此膜孔径越小灵敏度越高,但是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就是假阳性越高。用于金标免疫快速试验的膜多为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜,不同的包被蛋白对膜有特定要求,试验者应根据蛋白质的性质选择适合孔径大小和分布结构的膜,找到合适的平衡点,使胶体金的标记物在膜上的流动速率为最佳。 1.2结合垫的选择。结合垫位于层析系统的中间,一般要求结合垫的网格均一且非特异性吸附低,能很好地负载胶体金标记物和待检测样品,而不被吸附;玻璃纤维素膜具备以上优点,同时具有一定的硬度,为试验中常用。 1.3样品垫及吸水纸的选择。样品垫和吸水纸位于胶体金免疫层析系统的两端,对于胶体金层析系统功能的实现起着举足轻重的作用。试验中应根据试纸条检测样品的性质选择合适的样品垫和吸水纸,保证样品在样品垫形成的通道中快速地流动而不被非特异性地吸附或者改变样品的性质。如检测样品为血清,则可选择网格较疏松的玻璃纤维素膜即可;如果检测样品为毒素,则可选择质量好的吸水纸和样品垫。吸水纸则要有很好的蓄水能力,保证样品中所用的液体都经过膜的反应区而被样品垫吸收和蓄积。
免疫胶体金技术影响因素分析
免疫胶体金技术影响因素分析 自20世纪70年代,Faulk等(1971)用胶体金作为特殊标记物进行研究以来,建立的各种免疫胶体金技术以其特异性强、灵敏度高、操作简捷等特点,在医学、农牧业、环境及食品检测等领域被广泛应用。免疫胶体金技术的反应过程是一个由金颗粒、抗原与抗体动态结合的反应过程,在这个过程中每个环节的好坏都直接影响试验的成败。而试验过程中每个环节又受到很多因素的影响和制约,下面将影响免疫胶体金技术的因素作一分析,为成功制备胶体金检测产品提供参考。 1耗材的选择 1.1不同型号膜的筛选硝酸纤维素膜的型号在试验中至关重要,作为反应载体影响到整个试验的成败。不同的生产厂家生产硝酸纤维素膜时使用的聚合物和表面活性剂的来源、类型和数量均大不相同,对生产出的膜的性能产生较大影响—膜的孔径和分布结构不同。膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增;膜孔径越小,层析速度也越慢,金标复合物通过T线的时间就越长,反应也就越充分;因此膜孔径越小灵敏度越高,但是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就是假阳性越高。用于金标免疫快速试验的膜多为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸
纤维素混合膜,不同的包被蛋白对膜有特定要求,试验者应根据蛋白质的性质选择适合孔径大小和分布结构的膜,找到合适的平衡点,使胶体金的标记物在膜上的流动速率为最佳。 1.2结合垫的选择结合垫位于层析系统的中间,一般要求结合垫的网格均一且非特异性吸附低,能很好地负载胶体金标记物和待检测样品,而不被吸附;玻璃纤维素膜具备以上优点,同时具有一定的硬度,为试验中常用。 1.3样品垫及吸水纸的选择样品垫和吸水纸位于胶体金免疫层析系统的两端,对于胶体金层析系统功能的实现起着举足轻重的作用。试验中应根据试纸条检测样品的性质选择合适的样品垫和吸水纸,保证样品在样品垫形成的通道中快速地流动而不被非特异性地吸附或者改变样品的性质。如检测样品为血清,则可选择网格较疏松的玻璃纤维素膜即可;如果检测样品为毒素,则可选择质量好的吸水纸和样品垫。吸水纸则要有很好的蓄水能力,保证样品中所用的液体都经过膜的反应区而被样品垫吸收和蓄积。 2关于胶体金的制备 制备颗粒均匀、分散度好的胶体金在金标免疫快速试验中非常关键,如果金颗粒直径的变异范围太大就会影响到试验的稳定性和重复性,如果金颗粒的形状不规则或粒径不均
胶体金的相关知识
免疫层析试纸包被技术简介 试纸生产 过程中一般有三种 溶液的包被处理，即 质控溶液，检测溶 液，和结合物溶液 （胶体金）。质控和 检测溶液就是C/T 线上包被的溶液。 在免疫层 析试纸硝酸纤维素 膜表面进行 C/T线的包被，是试纸生产制作的关键环节之一。免疫诊断试剂中使用的硝酸纤维素膜有两类，一种是免疫渗滤产品用的，按孔径选择一般采用0.45um-1.2um的膜，与分子生物学中用的印迹转移膜一样。Whatman Schleicher & Schuell的膜属于纯采用100%的纯硝酸纤维素，蛋白结合能力较高。另一类即免疫层析用膜，一般按侧向流动速度来划分，常用的范围一般在120-180秒/4cm。目前市场上的硝酸 纤维素膜材以带塑料底衬 为主，也有部分的膜不带 底衬。不带底衬的膜需注 意膜面的正反面，其光滑 度有适当差别。 鉴于流动封闭技 术的普及，C/T线的包被 目前流行先将膜粘贴在塑 料支持底板上，然后直接 将塑料板放入仪器上进行 划线操作，干燥后进行其 他部分的贴板组装，这种 划膜工艺可简称为划板。 但部分产品的工艺要求先直接在膜上划好C/T线，然后用特定配方的溶液将膜进行浸泡封闭处理，干燥后再贴膜及其他部分材料，这种划膜工艺可简称为划膜。 在结合物溶液（胶体金）的包被上，较多的用户倾向于用气动喷头进行定量操作。在科研及研发项目中，往往喷一条线或几条线就够用了，因此在单维往复平台上一次喷一条线也可接受。鉴于胶体金膜切条宽度一般在 3--7mm，不方便一条条依次地在移动平台上固定和取放。因此在批量生产过程中，一般建议采用成片的胶体金垫，用三维平台往复来回地间隔喷线，一次即可喷出二三十条。此后将喷好的金干燥再裁切成条，这样的操作会效率高，适合规模生产。 在某些免疫层析试纸产品生产工艺中，层析膜材或样品垫膜材需要用特定溶液进行整平面包被，要求效果均匀，如层析膜和样品垫的特定封闭处理。
免疫胶体金标记手册
大学电子显微镜室大学生物技术研究所胶体金免疫标记技术培训班 技术资料 胡东维洪健徐颖
大学2001年10月
一、胶体金的制备 根据不同的制备方法，可以制备出直径1－500nm的胶体金粒子，但做为免疫标记探针，其直径应在3-30nm围。 在氯化金（HAuCl4）水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同种类、不同剂量的还原剂，可以控制所产生的粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。还原剂浓度越高，核浓度也越高，氯化金的还原也就从更多的还原中心开始，因此产生的胶体金粒子数量越多，但体积也越小。粒子直径每增加一倍，数量减少为原来的1/8。 以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂，能够制备大小相对一致、直径3～16nm的胶体金。因此一般胶体金探针均使用该方法进行。但该方法制备的胶体金粒子直径围较窄，而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。此时在溶液中添加0.1～0.2％的H2O2能够去除这些残基。双标记或制备5-10 nm的胶体金时建议使用该方法。 利用柠檬酸为还原剂，可以制备12～150 nm直径的胶体金。但制备大体积的胶体金时，胶体金粒子的误差也同时增加。因此做单标记时，建议使用该方法制备12-16 nm直径的胶体金。 除了上述方法外，也可以用磷作为还原剂来制备5 nm的胶体金，它避免了单宁酸残基的问题，但所形成的金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒，制备的残液需进一步处理，故该方法已经很少使用。 氯化金极易吸湿，故一般均以小剂量密封保存（0.5g或1g），因此在配制氯化金溶液时一次配完，暂时不用的可以用1.5 ml试管分装为1 ml保存（-20℃）。注意各种玻璃器皿一定要洗净并用双蒸水多次冲洗，有条件时可硅化处理（1％双氯硅烷/氯仿浸泡1小时，烘干）。配制各种试剂时均使用双蒸水，随后再用0.22 m微孔滤膜过滤后使用。三角瓶可反复多次使用，不用时应密封保存，以防污染。 制备好的胶体金保存寿命较长，可4℃保存6个月以上或室温下保存1-2个月。当出现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。但无论无何，在保存较长时间后应进行镜检，如出现大量胶体金粒子凝集，说明已经过期。 1、单宁酸/柠檬酸钠法制备3～16 nm胶体金 (1)取一250 ml三角瓶，加入79 ml双蒸水和1 ml 1％氯化金，预热至60～70℃。 (2)取一50 ml烧杯，加入4 ml 1％柠檬酸钠，然后根据所制备金粒子体积大小加入 不同用量的单宁酸及等量的25 mM K2CO3。预热至60～70℃。K2CO3的作用是保 持溶液的中性pH。因此如果单宁酸的量少于0.5 ml时，对pH的影响不大，K2CO3
免疫胶体金技术影响因素分析_张付贤
免疫胶体金技术影响因素分析 张付贤1,2,王兴龙2 (1.吉林大学农学部畜牧兽医学院,长春 130062;2.军事医学科学院军事兽医研究所,长春 130062) 摘要:免疫胶体金技术以其快速、准确、简捷的特点,受到国内外科研工作者及基层工作人员的普遍关注。笔者从耗材的选择、胶体金的制备及标记、膜包被条件、缓冲液和产品保存及验证等方面分析免疫胶体金技术的影响因素,为制备胶体金检测产品提供理论依据和技术参考。 关键词:免疫胶体金技术;影响因素;选择;检测 中图分类号:Q-33 文献标识码:A 文章编号:1671-7236(2009)05-0199-04 自20世纪70年代,Faulk等(1971)用胶体金作为特殊标记物进行研究以来,建立的各种免疫胶体金技术以其特异性强、灵敏度高、操作简捷等特点,在医学、农牧业、环境及食品检测等领域被广泛应用。免疫胶体金技术的反应过程是一个由金颗粒、抗原与抗体动态结合的反应过程,在这个过程中每个环节的好坏都直接影响试验的成败。而试验过程中每个环节又受到很多因素的影响和制约,下面将影响免疫胶体金技术的因素作一分析,为成功制备胶体金检测产品提供参考。 1 耗材的选择 1.1 不同型号膜的筛选 硝酸纤维素膜的型号在试验中至关重要,作为反应载体影响到整个试验的成败。不同的生产厂家生产硝酸纤维素膜时使用的聚合物和表面活性剂的来源、类型和数量均大不相同,对生产出的膜的性能产生较大影响—膜的孔径和分布结构不同。膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增;膜孔径越小,层析速度也越慢,金标复合物通过T线的时间就越长,反应也就越充分;因此膜孔径越小灵敏度越高,但是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就是假阳性越高(李云等,2002)。用于金标免疫快速试验的膜多为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜,不同的包被蛋白对膜有特定要求,试验者应根据蛋白质的性质选择适合孔径大小和分布结构的膜,找到合适的平衡点,使胶体金的标 收稿日期:2008-11-28 作者简介:张付贤(1982-),男,河南人,硕士,研究方向:兽医微生物与免疫学。 通信作者:王兴龙(1959-),男,吉林人,博导,从事分子免疫学研究。E-mail:w ang xl-2006@https://www.360docs.net/doc/9512634882.html, 基金项目:吉林省科技厅计划项目(20050549)。记物在膜上的流动速率为最佳(邓省亮等,2007)。 1.2 结合垫的选择 结合垫位于层析系统的中间,一般要求结合垫的网格均一且非特异性吸附低,能很好地负载胶体金标记物和待检测样品,而不被吸附(张美玲,2006);玻璃纤维素膜具备以上优点,同时具有一定的硬度,为试验中常用。 1.3 样品垫及吸水纸的选择 样品垫和吸水纸位于胶体金免疫层析系统的两端,对于胶体金层析系统功能的实现起着举足轻重的作用。试验中应根据试纸条检测样品的性质选择合适的样品垫和吸水纸,保证样品在样品垫形成的通道中快速地流动而不被非特异性地吸附或者改变样品的性质。如检测样品为血清,则可选择网格较疏松的玻璃纤维素膜即可;如果检测样品为毒素,则可选择质量好的吸水纸和样品垫。吸水纸则要有很好的蓄水能力,保证样品中所用的液体都经过膜的反应区而被样品垫吸收和蓄积。 2 关于胶体金的制备 制备颗粒均匀、分散度好的胶体金在金标免疫快速试验中非常关键,如果金颗粒直径的变异范围太大就会影响到试验的稳定性和重复性,如果金颗粒的形状不规则或粒径不均一,使得胶体金标记物容易解离和沉淀而产生金标扩散不完全、反应区底色过深和假阳性现象;而且胶体金质量不好,胶体金结合物就不能快速而完整的从玻璃纤维上解离,从而影响试验结果(Bassab等,2001)。 胶体金的制备除了保证药品的质量外,制备过程中的细节关乎胶体金制备的成败。首先是操作环境和所用容器的清洁度(翟雷等,1996)。所有进入溶胶内的污物都会干扰胶体金颗粒的生成或使生成的胶体金出现聚堆现象,容器最好经酸洗和硅化处理。操作环境应保持清洁无尘粒,最好有专用工作
几种胶体金技术详解
胶体金免疫分析技术详解 随着免疫分析日益广泛应用于以临床为主以及非临床领域的诊断工业，免疫分析正在向两个方向发展：一类为全自动化的免疫分析；另一类为以硝酸纤维膜为载体的快速免疫分析。前者需要价格昂贵的全自动仪器及与仪器严格配套的各种试剂盒，目前只能在医疗及检测中心应用，虽也能较快速给出结果，但仍需一定时间，不适合远离医疗及检测中心的地区，更不能用于“患者床旁检验”和普查的需要，在酶免疫分析的基础上，主要以硝酸纤维素膜为载体的快速诊断方法迅速和广泛地发展起来。这类方法目前在文献及市场上的命名还很不统一。它实际上属于快速斑点免疫结合分析，主要有以下两种方法：斑点免疫渗滤分析DIFA和斑点免疫层析分析DICA。本篇主要介绍以金作为标志物的胶体金免疫分析技术。 金标记免疫分析技术也称免疫胶体金技术，是于1971年建立的一种信号显示技术。此技术最初用于免疫电镜检查，由胶体金颗粒标记抗原或抗体，与组织或细胞中相应的抗体或抗原相结合，在电子显微镜的检查时可起特异的示踪作用。此后，此技术与银染技术相结合建立的免疫金银染色法，使抗原抗体特异反应信号可在光学显微镜下观察。近10多年来，利用硝酸纤维素膜（NC）等为固相载体，以胶体金标记的抗原或抗体与特异配体的反应在膜上进行，建立了快速的金标记免疫渗滤技术和金标记免疫层析技术，并在传染病、心血管病、风湿病、自身免疫病的免疫学检测中广泛应用。 胶体金是指金微小粒子（0-100nm）分散在另一种物质中所形成的体系，通常指金以微小粒子分散在溶液中所形成的金溶胶，用此金溶胶标记蛋白质（抗原、抗体或SPA、SPG），胶体金颗粒具有高电子密度的特性，故在金标蛋白的抗原抗体结合处，显微镜下可见黑褐色颗粒；当这些标记物在相应的标记处大量聚集时，可在载体膜上呈现红色或粉红色斑点，从而用于抗原或抗体物质的半定量或定性。 与ELISA不同之处便是反应时间大大缩短，仅需要数分钟就完成了ELISA需数小时才能显示的结果。因为在GIFA和GICA中，高浓度的抗体集中固定在纤维素的微孔中，待测抗原在渗滤或层析时，流经微孔与固定的高浓度抗体紧密接触，很快完成免疫结合反应。这就是以膜为基础的胶体金快速免疫结合分析中的免疫浓缩作用。在ELISA中，待测抗原要在液相中经过扩散作用，逐渐与吸附在固相表面的抗体结合。同时，标记抗体也需要同样的扩散结合过程形成抗体-抗原-标记抗体复合物，故需时间较长。故此技术做到了名副其实的POCT。 原理： 将氯金酸（HAuCl4）用还原法制成一定直径的金溶胶颗粒（胶体金），标记金黄色葡萄球菌A
胶体金标记技术
胶体金免疫分析技术 随着免疫分析日益广泛应用于以临床为主以及非临床领域的诊断工业，免疫分析正在向两个方向发展：一类为全自动化的免疫分析；另一类为以硝酸纤维膜为载体的快速免疫分析。前者需要价格昂贵的全自动仪器及与仪器严格配套的各种试剂盒，目前只能在医疗及检测中心应用，虽也能较快速给出结果，但仍需一定时间，不适合远离医疗及检测中心的地区，更不能用于“患者床旁检验”和普查的需要，在酶免疫分析的基础上，主要以硝酸纤维素膜为载体的快速诊断方法迅速和广泛地发展起来。这类方法目前在文献及市场上的命名还很不统一。它实际上属于快速斑点免疫结合分析，主要有以下两种方法：斑点免疫渗滤分析DIFA 和斑点免疫层析分析DICA。本篇主要介绍以金作为标志物的胶体金免疫分析技术。 金标记免疫分析技术也称免疫胶体金技术，是于1971年建立的一种信号显示技术。此技术最初用于免疫电镜检查，由胶体金颗粒标记抗原或抗体，与组织或细胞中相应的抗体或抗原相结合，在电子显微镜的检查时可起特异的示踪作用。此后，此技术与银染技术相结合建立的免疫金银染色法，使抗原抗体特异反应信号可在光学显微镜下观察。近10多年来，利用硝酸纤维素膜（NC）等为固相载体，以胶体金标记的抗原或抗体与特异配体的反应在膜上进行，建立了快速的金标记免疫渗滤技术和金标记免疫层析技术，并在传染病、心血管病、风湿病、自身免疫病的免疫学检测中广泛应用。 胶体金是指金微小粒子（0-100nm）分散在另一种物质中所形成的体系，通常指金以微小粒子分散在溶液中所形成的金溶胶，用此金溶胶标记蛋白质（抗原、抗体或SPA、SPG），胶体金颗粒具有高电子密度的特性，故在金标蛋白的抗原抗体结合处，显微镜下可见黑褐色颗粒；当这些标记物在相应的标记处大量聚集时，可在载体膜上呈现红色或粉红色斑点，从而用于抗原或抗体物质的半定量或定性。 与ELISA不同之处便是反应时间大大缩短，仅需要数分钟就完成了ELISA 需数小时才能显示的结果。因为在GIFA和GICA中，高浓度的抗体集中固定在纤维素的微孔中，待测抗原在渗滤或层析时，流经微孔与固定的高浓度抗体紧密接触，很快完成免疫结合反应。这就是以膜为基础的胶体金快速免疫结合分析中的免疫浓缩作用。在ELISA中，待测抗原要在液相中经过扩散作用，逐渐与吸附在固相表面的抗体结合。同时，标记抗体也需要同样的扩散结合过程形成抗体-抗原-标记抗体复合物，故需时间较长。故此技术做到了名副其实的POCT。 原理： 将氯金酸（HAuCl4）用还原法制成一定直径的金溶胶颗粒（胶体金），标记金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）或抗体，用于免疫印迹、免疫组织化学定位或快速免疫渗滤、免疫层析实验。金标记免疫渗滤技术的原理同一般的免疫斑点试验，也是用已知抗原或抗体包被NC膜，再用金标记抗体或抗原来进行快速快速测定，阳性时斑点呈胶体金的红色。改进之处为采用了渗滤装置，更加简便。金标记免疫层析则是利用NC膜条状纤维的毛细管作用，使样品在涌动中与金标记物及包被在NC膜上的抗原或抗体结合，出现呈色的阳性信号。
胶体金标记技术
胶体金标记技术 胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物或显色剂，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。由于它不存在内源酶干扰及放射性同位素污染等问题，且利用不同颗粒大小的胶体金还可以作双重甚至多重标记，使定位更加精确。因此已成为继荧光素、酶、同位素及乳胶标记技术之后的一种新型标记技术。现已广泛应用于电镜、流式细胞仪、免疫印迹、蛋白染色、体外诊断试剂的制造等领域。 用胶体金作为特殊标记物的研究始于60年代初，1962年Feldberr等报道了用胶体金标记细胞进行电子显微镜的研究。1971年，Taylor又将胶体金引入电镜免疫标记技术中。近年来的研究表明，胶体金也可作为体外免疫加层试验的指示物。由于胶体金作为标记物具有很多优点，因此自其问世以来，在国内外的许多研究领域中得到了迅速的发展。 近年来，它更多的被应用于免疫学和细胞学相关分子水平的检测中。尤其随着人们物质生活的改善，有关人类健康的问题在现实生活中已显得非常突出。从90年代至今的多篇报道都是关于动物体或人体相关抗体和病原体检测的。 制备方法 在溶液中金颗粒呈圆形，边缘平整，界线十分清楚。金颗粒表面带有大量负电荷，由于静电的排斥力，使其在水中保持稳定状态，形成稳定的胶体，所以称其为胶体金。胶体金的制作方法有白磷还原法，抗坏血酸还原法，柠檬酸三钠还原法和鞣酸—柠檬酸三钠还原法。通过改变反应体系中氯金酸与还原剂的比例（即增加或减少还原剂的量）可得到所需不同直径的金颗粒。 但前两种方法制备得到的金颗粒直径大小不均一，所以目前常用后两种方法，以柠檬酸三钠还原法为例，有两种方法。 1．Frens标准方法： 1)取0.01%HAuCl4溶液50mL,加热煮沸，随即快速加入1%柠檬酸三钠溶液0.5mL。 2)约过25s沸腾的溶液变为淡蓝色，大约再过70s，蓝色突然转变为亮红色， 3)继续煮沸约5分钟后结束反应。 4)冷却后用0.1M K2CO3溶液调至所需PH值。 5)此后再延长反应时间或另加入额外的柠檬酸三钠都不影响实验结果。 该法制备得到的金颗粒直径约为41nm，如前所述要想得到更大或更小的金颗粒，该方法依然可行，唯一不同的是需要改变加入还原剂的量。另外，采用此标准方法所需反应时间最短。2．Slot标准方法： 1)取1mL1%HAuCl4溶液溶于100mL水中，2)再加入2mL1%二水柠檬酸钠溶液。 3)将该混合溶液加热煮沸约15~30min，直至溶液颜色变为亮红色， 4)冷却后，用0.1M K2CO3溶液调整PH值，该法制备的金颗粒直径约为15nm。 胶体金标记蛋白的原理是：在碱性条件下，胶体金颗粒表面带负电荷，可与蛋白质所带正电荷基团之间产生静电吸引而牢固结合，这种结合对所标记蛋白的生物学活性无明显影响。 胶体金免疫技术可大致分为液相胶体金标记技术和固相胶体金标记技术，其分类依据同酶免疫技术。最早的液相胶体金标记技术叫免疫金染色法（IGS），它仅以胶体金作为标记物和显色剂。最初的免疫金染色都采用单标记。即采用大小均一的金颗粒进行标记。后来发展到可利用不同颗粒大小的胶体金作双重标记甚至多重标记。但该方法均仅以胶体金显色，需要较高浓度的标记物，耗费抗体或抗原的量较多，而且需要较大直径的金颗粒（40-50nm），才能获得较高的灵敏度，而且当金颗粒过大时，标记物不稳定，长期贮存容易发生自动聚集。 为克服以上缺点，免疫金银染色法（IGSS）应运而生。该方法的原理是，先用胶体金标记物作免疫金染色，再加入含银的物理显影液，则银离子靠电荷吸引，大量吸附于金颗粒周围，使显色结果呈现金属银的蓝灰色，同时将显色信号进一步放大。应用时，由于本法最终显色是靠金属银的吸附沉积，因此不需要高浓度的胶体金标记物，将胶体金标记物稀释几十倍，仍可获得同免疫金染色一样的最佳效果。这样不仅可以节省大量的抗体或抗原标记物，而且可以节省大量的胶体金。本方法灵敏度的关键在于胶体金吸附银颗粒的数量。小直径的
免疫胶体金标记手册
浙江大学电子显微镜室浙江大学生物技术研究所 胶体金免疫标记技术培训班 技术资料 胡东维洪健徐颖 浙江大学 2001年10月
一、胶体金的制备 根据不同的制备方法，可以制备出直径1- 500nm的胶体金粒子，但做为免疫标记探 针，其直径应在3-30nm范围内。 在氯化金（HAuCI 4）水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同种类、不同剂量的还原剂，可以控制所产生的粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。还原剂浓度越高，核浓度也越高，氯化金的还原也就从更多的还原中心开始，因此产生的胶体金粒子数量越多，但体积也越小。粒子直径每增加一倍， 数量减少为原来的1/8。 以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂，能够制备大小相对一致、直径3?16nm的胶体金。因此一般胶体金探针均使用该方法进行。但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄，而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。此时在溶液中添加0.1?0.2%的 H2O2能够去除这些残基。双标记或制备5-10 nm的胶体金时建议使用该方法。 利用柠檬酸为还原剂，可以制备12?150 nm直径的胶体金。但制备大体积的胶体金 时，胶体金粒子的误差也同时增加。因此做单标记时，建议使用该方法制备12-16 nm直径 的胶体金。 除了上述方法外，也可以用磷作为还原剂来制备 5 nm的胶体金，它避免了单宁酸残 基的问题，但所形成的金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒，制备的残液需进一步处理，故该方法已经很少使用。 氯化金极易吸湿，故一般均以小剂量密封保存（0.5g或1g）,因此在配制氯化金溶液 时一次配完，暂时不用的可以用 1.5 ml试管分装为1 ml保存（-20 C）。注意各种玻璃器皿 一定要洗净并用双蒸水多次冲洗，有条件时可硅化处理（1%双氯硅烷/氯仿浸泡1小时， 烘干）。配制各种试剂时均使用双蒸水，随后再用0.22 m微孔滤膜过滤后使用。三角瓶可反复多次使用，不用时应密封保存，以防污染。 制备好的胶体金保存寿命较长，可4C保存6个月以上或室温下保存1-2个月。当出 现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。但无论无何，在保存较长时间后应进行镜检，如出现大量胶体金粒子凝集，说明已经过期。 1、单宁酸/柠檬酸钠法制备3?16 nm胶体金 （1）取一250 ml三角瓶，加入79 ml双蒸水和1 ml 1 %氯化金，预热至60?70C。 （2）取一50 ml烧杯，加入4 ml 1 %柠檬酸钠，然后根据所制备金粒子体积大小加入不同用量的单宁酸及等量的25 mM K2CO3。预热至60?70C。K2CO3的作用是保持 溶液的中性pH。因此如果单宁酸的量少于0.5 ml时，对pH的影响不大，K2CO3 可以省略。 （3）将上两种溶液迅速混合并充分
胶体金免疫技术在食品检测中的应用
胶体金免疫技术在食品检测中的应用 摘要：胶体金免疫技术（GICA）是免疫技术中的重要组成部分，是一种具有广阔发展前景的快速便捷的新技术。结合GICA技术的原理，着重探讨GICA技术在食品检测中的应用，为食品质量安全的监控提供理论依据。 关键字：胶体金免疫残留 The application of immune colloidal gold technique in food detection Abstract:Immune colloidal gold technique (GICA) is an important part of immune technique, It has a broad prospects for development of new technology in food detection .Combined with the principle of GICA, the author discussed application of GICA in food detection, which provides the theoretical basis of food quality and safety. Key words:colloidal gold immunoassay residue 正文：胶体金免疫技术是固相免疫标记技术，它是伴随着荧光标记、同位素标记以及酶标记等盛行起来的一种技术。胶体金免疫法作为一种新型快速的检测手段，具有灵敏度高、特异性强、快速简便、无污染等优点，被广泛应用在农副产品及环境卫生的检测中。 1 原理 胶体金免疫技术(gold immunoassay，GICA)是将金标记法与层析法相结合的一种免疫形式原理为:将具有特异性的蛋白固定在层析带上，样品溶液通过毛细管层析作用在层析带上泳动，层析带上待测物的受体与样品中的待测物发生高特异性和高亲和性的反应，最终检测带上富集了相应复合物，通过酶促显色或直接目测着色标记物几分钟内即可观测到结果[1]。 与酶联免疫相比，基于实验者肉眼可观测到的颜色结果，且不需要大型仪器及特殊试剂，操作简单，短时间即可得到结果并保留。胶体金颗粒在放射性物质的比较，金颗粒具有一定使用优势[2]。该方法简单、快速。不同的抗原可能是共轭对不同大小的金颗粒，因此逐一确认。在一定条件下定位精确、定量分析是可能的，由于金颗粒清晰可辨因此与其他结构或内源性物质可避免混乱。 2 制备 通过加入某些特定还原剂（如抗坏血酸、白磷、柠檬酸三钠等)，使氯金酸(HAuCl4)能够利用聚合反应聚合成一定大小的金颗粒，它们是带有负电的疏水性胶溶液，在静电力作用下其胶体状态不易破坏，该制备方法为化学还原法[3]。在制备过程中，加入还原剂的种类和浓度直接影响胶体金颗粒的大小，相关研究表明，欲制得直径较小的金颗粒，试验应选择还原能力较强的还原剂[4]。电子显微镜及光谱法能够准确地测定其含量，对其纯度能够较好地分析[5]。
胶体金技术
免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique) 文章来源： 文章作者： 发布时间：2007-04-24 字体： [大 中 小] （一） 原理 免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸（HAuCl 4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由 于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。 胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA 、PHA 、ConA 等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。 （二） 胶体金的制备 根据不同的还原剂可以制备大小不同的胶体金颗粒。常用来制备胶体金颗粒的方法如下。 1．枸橼酸三钠还原法 （1）10nm 胶体金粒的制备：取0.01％HAuCl 4水溶液100ml ，加入1％枸橼酸三钠水溶液3ml ，加热煮沸30 min ，冷却至4℃，溶液呈红色。 （2）15nm 胶体金颗粒的制备：取0.01％HAuCl 4水溶液100ml ，加入1％枸橼酸三钠水溶液2ml ，加热煮沸 15min ～30min ，直至颜色变红。冷却后加入0.1Mol/L K 2CO 30.5ml ，混匀即可。 （3）15nm 、18nm ～20nm 、30nm 或50nm 胶体金颗粒的制备：取0.01％HAuCl 4水溶液100ml ，加热煮沸。根 据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液4ml 、2.5ml 、1ml 或0.75ml ，继续煮沸约5min ，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm 、18～20nm 、30nm 和50nm 。 2．鞣酸—枸橼酸钠还原法 A 液：1％HAuCl 4水溶液1ml 加入79ml 双馏水中混匀。 B 液：1％枸橼酸三钠4ml ，1％鞣酸0.7ml ，0.1Mol/L K 2CO 3液0.2ml ，混合，加入双馏水至20ml 。
胶体金是一种常用的标记技术
胶体金是一种常用的标记技术，是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术，有其独特的优点。近年已在各种生物学研究中广泛使用。在临床使用的免疫印迹技术几乎都使用其标记。同时在流式、电镜、免疫、分子生物学以至生物芯片中都可能例用到。 1971年Faulk 和Taytor将胶体金引入免疫化学，此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法，在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。目前在医学检验中的应用主要是免疫层析法( immunochromatogra-phy)和快速免疫金渗滤法(Dot-immuogold filtration assay DIGFA)，用于检测HBsAg、HCG 和抗双链ＤＮＡ抗体等，具有简单、快速、准确和无污染等优点。 免疫胶体金技术的基本原理 胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶溶液，由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。 胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。 胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合，因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。 免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中，这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色。 常用的免疫胶体金检测技术 （1）免疫胶体金光镜染色法 细胞悬液涂片或组织切片，可用胶体金标记的抗体进行染色，也可在胶体金标记的基础上，以银显影液增强标记，使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面，可明显增强胶体金标记的敏感性。 免疫胶体金电镜染色法 可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样本或组织超薄切片结合，然后进行负染。可用于病毒形态的观察和病毒检测。 （2）斑点免疫金渗滤法 应用微孔滤膜（如膜）作载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体检测相应的抗原或抗体。 （3）胶体金免疫层析法 将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂（抗体或单克隆抗体）吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金
免疫胶体金标记手册
免疫胶体金标记手册 浙江大学电子显微镜室浙江大学生物技术研究所胶体金免疫标记技术培训班 技术资料 胡东维洪健徐颖 浙江大学 2０0１年1０月
一、胶体金的制备 根据不同的制备方法,可以制备出直径1-500nｍ的胶体金粒子，但做为免疫标记探针,其直径应在３－３0nm范围内。 在氯化金（HＡuＣl4）水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同种类、不同剂量的还原剂，可以控制所产生的粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。还原剂浓度越高,核浓度也越高，氯化金的还原也就从更多的还原中心开始,因此产生的胶体金粒子数量越多,但体积也越小。粒子直径每增加一倍,数量减少为原来的1/8。 以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂，能够制备大小相对一致、直径３~16nm的胶体金。因此一般胶体金探针均使用该方法进行。但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄，而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。此时在溶液中添加0．1～0.２％的H2O2能够去除这些残基。双标记或制备5－10 nｍ的胶体金时建议使用该方法。 利用柠檬酸为还原剂，可以制备１2～150 ｎm直径的胶体金。但制备大体积的胶体金时，胶体金粒子的误差也同时增加。因此做单标记时,建议使用该方法制备1２-16 nm直径的胶体金。 除了上述方法外,也可以用磷作为还原剂来制备５ nm的胶体金，它避免了单宁酸残基的问题，但所形成的金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒,制备的残液需进一步处理，故该方法已经很少使用。 氯化金极易吸湿,故一般均以小剂量密封保存（０.5ｇ或1ｇ)，因此在配制氯化金溶液时一次配完,暂时不用的可以用1.5 ｍl试管分装为1 ｍl保存(－2０℃)。注意各种玻璃器皿一定要洗净并用双蒸水多次冲洗,有条件时可硅化处理（1%双氯硅烷／氯仿浸泡1小时,烘干)。配制各种试剂时均使用双蒸水，随后再用0.22 m微孔滤膜过滤后使用。三角瓶可反复多次使用，不用时应密封保存,以防污染。 制备好的胶体金保存寿命较长，可4℃保存6个月以上或室温下保存１-2个月。当出现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。但无论无何，在保存较长时间后应进行镜检，如出现大量胶体金粒子凝集，说明已经过期。 1、单宁酸/柠檬酸钠法制备3~16 nm胶体金 (1)取一25０ ml三角瓶，加入79 ｍl双蒸水和１ ml 1％氯化金,预热至60～7０℃。 (2)取一50 ml烧杯，加入4 ml 1%柠檬酸钠,然后根据所制备金粒子体积大小加 入不同用量的单宁酸及等量的２5 mＭ K2ＣＯ3。预热至６0～70℃。Ｋ2CO3的作用 是保持溶液的中性pH。因此如果单宁酸的量少于0.5 ml时,对ｐH的影响不大，K ２ＣO3可以省略。 (3)将上两种溶液迅速混合并充分混匀，加热至沸并保温１0分钟。自然冷却。
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文档来源为:从网络收集整理.word版本可编辑.欢迎下载支持. 一、胶体金的制备 根据不同的制备方法，可以制备出直径1－500nm的胶体金粒子，但做为免疫标记探针，其直径应在3-30nm范围内。 在氯化金（HAuCl4）水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同种类、不同剂量的还原剂，可以控制所产生的粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。还原剂浓度越高，核浓度也越高，氯化金的还原也就从更多的还原中心开始，因此产生的胶体金粒子数量越多，但体积也越小。粒子直径每增加一倍，数量减少为原来的1/8。 以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂，能够制备大小相对一致、直径3～16nm的胶体金。因此一般胶体金探针均使用该方法进行。但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄，而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。此时在溶液中添加0.1～0.2％的H2O2能够去除这些残基。双标记或制备5-10 nm的胶体金时建议使用该方法。 利用柠檬酸为还原剂，可以制备12～150 nm直径的胶体金。但制备大体积的胶体金时，胶体金粒子的误差也同时增加。因此做单标记时，建议使用该方法制备12-16 nm直径的胶体金。 除了上述方法外，也可以用磷作为还原剂来制备5 nm的胶体金，它避免了单宁酸残基的问题，但所形成的金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒，制备的残液需进一步处理，故该方法已经很少使用。 氯化金极易吸湿，故一般均以小剂量密封保存（0.5g或1g），因此在配制氯化金溶液时一次配完，暂时不用的可以用1.5 ml试管分装为1 ml保存（-20℃）。注意各种玻璃器皿一定要洗净并用双蒸水多次冲洗，有条件时可硅化处理（1％双氯硅烷/氯仿浸泡1小时，烘干）。配制各种试剂时均使用双蒸水，随后再用0.22 m微孔滤膜过滤后使用。三角瓶可反复多次使用，不用时应密封保存，以防污染。 制备好的胶体金保存寿命较长，可4℃保存6个月以上或室温下保存1-2个月。当出现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。但无论无何，在保存较长时间后应进行镜检，如出现大量胶体金粒子凝集，说明已经过期。 1、单宁酸/柠檬酸钠法制备3～16 nm胶体金 (1)取一250 ml三角瓶，加入79 ml双蒸水和1 ml 1％氯化金，预热至60～70℃。 (2)取一50 ml烧杯，加入4 ml 1％柠檬酸钠，然后根据所制备金粒子体积大小加入不 同用量的单宁酸及等量的25 mM K2CO3。预热至60～70℃。K2CO3的作用是保持 溶液的中性pH。因此如果单宁酸的量少于0.5 ml时，对pH的影响不大，K2CO3 可以省略。 (3)将上两种溶液迅速混合并充分混匀，加热至沸并保温10分钟。自然冷却。 1文档来源为:从网络收集整理.word版本可编辑.
免疫胶体金技术及其应用
第26卷第3期 河 南 林 业 科 技 Vol. 26 No. 3 2 0 0 6年9月 Journal of Henan Forestry Science and Technology Sep. 2 0 0 6 收稿日期：2006-07-20 作者简介：曾辉（1982-），男，信阳人，在读硕士研究生. 免疫胶体金技术及其应用 曾辉 1，翟晓巧2，刘艳萍1，张国俊3，李晓梦 4 （1.河南农业大学，郑州 450002；2. 河南省林业科学研究院； 3.禹州市林业技术推广中心； 4.镇平县林业局） 摘 要：免疫胶体金技术是继三大标记技术后对免疫标记技术的又一大贡献，近年来发展迅速，应用范围极广。综述了免疫胶体金技术的原理、特点和应用，并分析了存在的问题，针对其存在问题提出展望。 关键词：免疫胶体金技术；应用 中图分类号：S482.8 文献标识码：B 文章编号： 1003-2630（2006）03-0037-02 Immune colloidal gold technique and its application ZENG Hui ,ZHAI Xiao-qiao ,LIU Yan-ping （1. Henan Agriculture University,Zheng zhou 450002,China 2.Henan Forestry Research Institute, Zhengzhou 450008,China) Abstract: Immune colloidal gold technique has great contribution to immunal labeling technique ,it develops quickly and applies comprehensively in recent years.The paper summaries the principle 、advantage and application of immune colloidal gold technique , meanwhile analyses the problem , then puts forward prospect. Key words: Immune colloidal gold technique ; application 免疫胶体金技术(ICG)是以胶体金为标记物，利用特异性抗原抗体反应，在光镜电镜下对抗原或抗体物质进行定位、定性乃至定量研究的标记技术。1962年Feldherr第一次介绍了胶体金可作为一种电子显微镜水平的示踪标记物。1971年，Faulk 和Taylor [1]首次用免疫金标技术研究沙门氏菌壁细胞抗原成分，将胶体金与抗体结合，应用于电镜水平的免疫细胞化学研究。这一年被公认为免疫胶体金技术诞生年。近年来，研究人员根据胶体金的物化性质进一步拓展了基于胶体金标记的生物检测技术及胶体金在其他生物学方面的应用。 1免疫胶体金技术的基本原理 氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小 的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合，因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。 2免疫胶体金技术的特点 免疫胶体金技术是继三大标记技术（荧光素、放射性同位素和酶）后发展起来的固相标记免疫测定技术，与现有其它标记方法和标记物相比，有以下特点：（1）胶体金制备容易，价格低廉；（2）免疫胶体金对组织细胞的非特异性吸附作用小，几乎不出现非特异性吸附；（3）金颗粒大小可以控制，颗粒均匀，可进行双重和多重标记，即用不同大小的金颗粒分别标记不同的抗体，实现在同一张切片上观察 两种以上的抗原，也可以和其他标记物配合进行双重或多重标记；（4）既可用于光镜，又可用于电镜；既可用于透射电镜，又可用于扫描电镜；（5）可以标记多种生物大分子物质，如抗体葡萄球菌蛋白A（SPA）、凝集素、多糖、多肽及其它蛋白质而不影响其生物活性；（6）由于胶体金本身有鲜艳的橘红色，可用光镜或肉眼观察实验结果，也可用分光光度计测定光吸收，进行定量分析。可在切片不同视野中根据金颗粒的数目来半定量抗原；（7）灵敏度高，染色简便，不影响原有超微结构的观察，显色结果可长期保存等。 3免疫胶体金技术的应用 胶体金标记技术由于标记物的制备简便，方法敏感、特异，不需要使用放射性同位素，或有潜在致癌物质的酶显色底物，也不要荧光显微镜，所以它的应用范围极广。 3.1在免疫学检验中的应用 Leuvering [2]于1980年最早报道了用胶体金检测人绒毛膜促性腺激素(hCG)的凝集试验，1985年起有商品试剂盒供应，从此胶体金成为免疫学测定方法研究开发的新热点，新的方法和试剂盒层出不穷。 3.1.1 凝集试验 单分散的免疫金溶胶呈清澈透明的溶液，其颜色随溶胶颗粒大小而变化，当与相应抗原或抗体发生专一性反应后出现凝聚，溶胶颗粒极度增大，光散射随之发生变化，颗粒也会沉降，溶液的颜色变淡甚至变成无色，这一原理可定性或定量地应用于免疫反应。 3.1.2 蛋白质印迹技术 除用胶体金结合物替代传统蛋白印迹法中的酶或放射性同位素等作标记物外，其原理和操作基本同传统法，但有以下优点：（1） 信号本底比大；(2) 无处理放射性同位素的麻烦；(3) 结果可长期保存；(4) 可采用银放大技术，灵敏度至少可提高10倍。 3.2应用于流式细胞仪中 应用荧光素标记的抗体，通过流式细胞仪计数分析细胞