乳酸菌的分离培养

乳酸菌的分离培养

保加利亚乳杆菌

组长：

组员：

实验目的： 1.学习并掌握普通光学显微镜油镜的使用技术及微生物形态观察；

2.学习微生物制片、染色的基本技术，掌握乳酸菌的简单染色法及无菌操作接种技术；

3.通过对培养基的配制，了解配制培养基的一般步骤和方法，掌握微生物实验常用的器皿的清洗与包扎、培养基的制备、消毒灭菌。

4.了解各种灭菌的基本原理和应用范围，以及实验室中常用的灭菌方法。

5.了解酸奶中乳酸菌分离原理, 观察乳酸菌的基本形态,掌握用显微镜测微尺测量微生物细胞大小、数目的测定的方法。

6.了解稀释平板计数的原理，熟练掌握混合平板培养法。明确显微镜计数的原理并学习使用血球计数板进行微生物计数的方法。

7．初步学会乳酸菌培养的基本技术，了解并掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的原理和方法，掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。

8.了解并掌握微生物菌种保藏的常用方法及其优缺点，并了解不同微生物对不同的生物大分子的分解利用情况，认识微生物代谢类型的多样性。

实验原理：乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称，本实验中

用革兰氏染色法进行染色，革兰氏染色法是根据细菌细胞壁成分不同,脱色效果不同从而可以将细菌区分为G+和G-菌。通过革兰氏染色以及形态学观察，乳酸菌呈紫色，为革兰氏阳性菌；乳酸菌应为乳杆菌和乳球菌的混合体。酸奶中含有乳酸菌，而且目前市场上销售的酸奶中通常含有双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌四种菌。细菌及其它一些微生物的大小，通常用测微计来测量，测微计分接目测微计与镜台测微计；培养基是按照微生物生长发育的需要，用不同组份的营养物质调制而成的营养基质；灭菌是用物理或化学的方法来杀死或除去物品上或环境中的所有微生物，包括芽孢；自然条件下，微生物常以群落状态存在，这种群落往往是不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物的特性或者要大量培养或者使用某种微生物，必须从这些混杂的微生物群落中获得纯培养，这些获得纯培养的方法称为微生物的分离和纯化。用生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生化反应。

实验器材：

样品：含乳酸菌的酸奶

①培养基：改良MRS固体培养基

蛋白胨5g 牛肉膏5g 酵母提取物 2.5g 柠檬酸二铵1g 水500mL

乙酸钠2.5g K2HPO4 1g MnSO4·4H2O 0.125 吐温80 0.5mL

琼脂12.5g MgSO4·7H2O 0.29g CaCO3 5g 葡萄糖10g 。

仪器用品：500ml烧杯一个100ml量筒一个无菌培养皿12个

250ml容量三角瓶2个5ml无菌移液管1ml无菌移液管6只

15ml试管7只高压灭菌锅天平

水浴锅一个玻棒一根旋涡均匀器一台镜台测微尺

电磁炉一个棉花纱布目镜测微尺

牛皮纸麻绳接种环一个盖玻片

酒精灯一盏牛角匙pH试纸血球计数板

载玻片若干恒温培养箱酸度计擦镜纸、吸水纸

液体石蜡显微镜载玻片玻片架、洗瓶、酒精灯

火柴、滴管

药品：结晶紫，乙醇，草酸铵，碘，碘化钾，番红，KOH，NaCl，10％NaOH，2%氯化铁。

药品配制

结晶紫：结晶紫乙醇饱和液（结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中）20ml，1g草酸铵于蒸馏水100ml。将两液混匀即成。

卢戈氏碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加入蒸馏水300ml即成。

蕃红溶液：番红2.5g，95%乙醇100ml，溶解后存于密闭的棕色瓶中。用时取10ml与80ml蒸馏水混匀即可。

0.1%的吕氏美蓝染液：A液：美蓝0.3g，95%乙醇300ml；B液：0.01% KOH 100ml。混合A和B液即成，按1：100稀释即可。

生理盐水：称取0.9克氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到100毫升。

实验步骤：

一、培养基的培养

1．称量用天平称取蛋白胨1g, 牛肉膏1g , 酵母提取物0.5g ,柠檬酸二铵0.2g,乙酸钠0.5g , K2HPO4 0.2g, MnSO4·4H2O 0.025g, MgSO4·7H2O 0.06g , 葡萄糖2g , 吐温80 0.1mL , CaCO3 1g放入烧杯。

2．溶解向上述烧杯中加入蒸馏水50 mL无菌水，用玻璃棒搅匀后，放到酒精灯上加热,在石棉网上加热溶解后,加入2.5g琼脂，并继续用微火加热。在琼脂溶化的过程中，要控制火力的大小，并且不断搅拌，以免培养基溢出或烧焦。待琼脂完全溶化后，补加蒸馏水至100mL。

3．调节pH 用滴管逐滴滴入1mol/L的NaOH溶液，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸测pH，直到pH到6.8左右。

4．过滤要趁热用四层纱布过滤

5．培养基的分装将培养基趁热分装到2个三角瓶里(一半为宜)。注意：分装时不要将培养基沾在管口和试管上段，以免引起污染。

6．加棉塞培养基分装完毕以后，在管口上加一个棉塞。棉塞能防止杂菌污染，保证通气良好。加棉塞时，应使棉塞长度的2/3在试管口内。

7．包扎在管口外面包上一层牛皮纸，然后，用线绳扎好。在每捆试管外挂上标签，注明培养基名称、配制日期和制作者姓名

二、灭菌

1．打开高压蒸汽灭菌锅，将里面的灭菌桶取出，向锅内加水(最好用开水)，水面与底架平齐为宜（直至高水位灯亮起）。

2．将扎好的试管管口向上竖放在灭菌桶内，再将灭菌桶放回灭菌锅。（注意：灭菌桶内的物品不能放得

太挤，否则会影响灭菌效果）。

3．加盖，并将排气软管插入灭菌桶的排气槽内。（以两两对称的方式，同时旋紧相对的两个紧固螺栓，以防漏气）同时关闭灭菌锅上方的安全阀，打开排气阀，使水沸腾时得以排除锅内的冷空气。

4．设置灭菌温度和时间。温度为121℃,20分钟灭菌

5．排出锅内的冷空气，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升，当锅内的压力上升到98kPa 时，控制火力大小，使压力维持在98kPa左右20min。

6．灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力将至0时，打开排气阀，旋开盖子，取出灭菌物品。

三、无菌检查

将取出的灭菌培养基放入37℃温箱保温培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。

四、菌悬液的配制

先将酸奶样品搅拌均匀，用无菌移液管吸取样品10ml加入盛有90ml无菌水的三角瓶中，在旋涡均匀器上充分振摇20分钟，使样品均匀分散。用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml酸奶悬液注入9ml无菌水的试管中，吹息三次，使充分混匀。然后再用一支1ml无菌吸管从此试管中吸取1ml注入另一盛有9ml无菌水的试管中，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7各种稀释度的菌悬液（要取7只15ml试管）。

五、倒平板

取无菌平板12个，编号标明10-1、10-5、10-6、10-7各三套；将经高温消毒的培养基冷却到50℃左右，按无菌操作法倒12只平板，每皿约15ml；平置使培养基均匀分布在皿底，待凝固。

六、分离方法

A．涂布平板法

用三支1ml无菌吸管分别吸取10-5、10-6和10-7的稀释菌悬液各1ml，对号接种于与之对应的3个无菌平板中，每个平皿放0.2ml；尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平放与试验台上20 Min；然后倒置于40℃恒温箱中培养48小时。

B．平板划线

1、划线在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，按无菌操作对标有…10-1…的3个平板进行划操作。

常用的划线方法有;(a)用接种环以无菌操作挑取菌液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3-4条，再转动培养皿约70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分做第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部分做第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于放在40℃恒温培养箱中培养48小时。（b）将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于放在40℃恒温培养箱中培养48小时。

C．稀释混合平板法

先分别吸取1ml的10-5、10-6、10-7稀释度的菌悬液对号放入平板中，然后再倒入经高温消毒的并冷却到50℃左右培养基中，边倒入边摇匀，使样品中的微生物与培养基混合均匀，到冷凝成平板后，倒置于40℃恒温箱中培养48小时。

七、菌落特征的观察

恒温培养48小时过后，取出培养平板；选择菌落分布较好的平板，先对其菌落形态（如菌落的大小、表面状况、透明度、色泽、边缘、隆起度、透光性、是否分泌色素等特点）进行观察，初步找出乳酸菌菌落。乳酸菌的菌落很小，大约1~3 mm，园形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色；在产酸菌落周围还能产生CaCO3的溶解圈。

八、乳酸菌的形态观察及保加利亚乳杆菌的形态观察

（一）普通光学显微镜的使用

1.取镜从显微镜箱中取出显微镜时，用一手握镜臂，一手托镜座，直立移动，轻放在平稳的实验台上，使用前首先要熟悉显微镜的结构和性能，检查各部零件是否齐全，镜头是否清洁，做好必要地清洁和调整工作。

2.调节光照

1) 用粗调节器提升镜筒，将低倍物镜旋到镜筒下方，使镜头和载物台距离约为5mm左右。

2) 上升聚光器，使之与载物台表面相距1毫米左右。

3) 插上电源，开开电源开关。左眼看目镜调节反光镜镜面角度（在天然的光线下观察，一般用平面反

镜；若以灯光为光源，则一般多用凹面反光镜）。

4) 开闭光圈，调节光线强弱，直至视野内得到最均匀最适宜的光度为止。

3.低倍镜观察

1) 将载片标本（涂面朝上）置于载物台的标本夹上，并将标本部位处于物镜的正下方，转动粗调节器，

使镜头下降至镜面距离检视物大约5mm处。

2) 然后以左眼看目镜，另一眼睁开，一边观察视野，一边扭动粗调节器使镜头缓慢地升高，至视野内

出现物像后，改用细调节器上下微微转动，仔细调节焦距和照明，直至视野内获得清晰的物像，选择适宜部位，移到视野中心。

3) 移动推动器，换高倍镜观察。

4.高倍镜观察将高倍物镜转至镜筒下方，调节光圈和聚光镜，使光线亮度适中，再仔细反复转动微调螺旋，调节焦距，获得清晰物象，再移动推动器选择最满意的镜检部位将染色标本移至视野中央，待油镜观察。

5.油镜观察

1) 先用粗调节旋钮将镜筒提升（或将载物台下降）约2cm，转动转换器将油镜转至镜筒正下方。在玻

片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升，使油浸物镜浸入香柏油中，使镜头几乎与标本接触。

2) 左眼看目镜，右手反时针方向微微转动粗调螺旋，下将载物台，当视野中有模糊地标本物象时，改

用细调螺旋，并移动标本直至标本物象清晰为止。

3) 观察完毕，下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦擦镜纸蘸少许二甲苯

或乙醚酒精混合液（乙醚2份，纯酒精3份），擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭2~3下即可，（注意向一个方向擦拭）。

4) 将各部分还原：下降载物台最低处；转动物镜转换器，使物镜镜头转成八字形，再向下旋转至最低

处；将调节光源亮度的旋钮最小化；关掉电源；用柔软纱布清洁载物台等机械部分，放好显微镜，盖上罩。（如果是自然采光显微镜，降下聚光器，反光镜与聚光器垂直）。

6.换片另换新的标本片，必须从第三条开始操作。

7.用后必须清洁、复原观察完毕，上旋镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去镜头上的残留油迹，最后再用擦镜纸擦去残留的二甲苯。机械部件用细软布擦去灰尘和冷凝水，下降镜筒，将接物镜转成八字形置于载物台上。下降聚光镜，（切勿使接物镜与聚光镜相碰受损），反光镜垂直于镜座。放进显微镜箱中锁好，并放入指定的面微镜柜中。

（二）镜检（革兰氏染色方法）

1.涂片取干净载玻片一块，在载玻片中央加一滴蒸馏水，将培养的乳酸菌作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰1—2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。

2.染色

(1) 初染加草酸铵结晶紫染色液一滴，约1一2分钟，倾去染色液，用自来水小心地冲洗。

(2) 媒染滴加卢哥氏碘液冲去残水，并覆盖约1一2分钟，水洗。

(3) 脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20—30秒钟，立即用水冲净酒精，以终止脱色。

(4) 复染滴加番红液，染色2—3分钟，水洗。最后用吸水纸轻轻吸干。

(5) 镜检干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的乳酸菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。其中保加利亚乳杆菌呈杆状，成单杆、或双杆菌或长丝状；嗜热链球菌，呈球状，成对、或短链、或长链状。

十、保加利亚乳杆菌的细胞大小测定

1、目镜测微尺的校正把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重叠，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。因为镜台测微尺的刻度每格长l0μm，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。

例如目镜测微尺5小格正好与镜台测微尺5小格重叠，已知镜台测微尺每小格为l0μm，则目镜测微尺上每小格长度为=5×10μm/5＝10μm

2、菌体大小的测定取下镜台测微尺，将保加利亚乳杆菌染色标本片置于载物台上，先在低倍镜和高倍镜下找到目的物。然后在高倍镜下转动目镜测微尺，测出保加利亚乳杆菌的长和宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位），测出的格数乘上目镜测微尺每格的长度，即等于该菌的大小。同法在油镜下转动目镜测微尺测出保加利亚乳杆菌的长和宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位），测出的格数乘上目镜测微尺每格的长度，即等于该菌的大小。

例如目镜测微尺在显微镜下经过校正，当使用油镜时，每格相当于1.3 μm。如果测量菌体的长度相当于目镜测微尺的两格，则菌体长度应为1.3 μm×2 = 2.6 μm。

一般测定微生物细胞大小时，通常测量10—20个菌体左右，求出平均值，才能代表该菌的大小。用最大和最小的数值来表示菌体大小的范围。例如长为3~5μm，宽为1~2μm，则其大小为l~2×3~5μm。

3、取出目镜测微尺，将接目镜放回镜筒，再将目镜测微尺和镜台测微尺分别再用擦镜纸擦拭后，放回盒内保存。

（二）血球计数板在显微镜下直接计数保加利亚乳杆菌的数量

如图--血球计数板构造

上：俯视图（中间平台分为两半，各刻有一个方格网）

下：侧面图（中间平台与盖玻片之间有高度为0.1mm的间隙）

血球计数板通常是一块特制的厚载玻片，载玻片上有四条槽而构成三个平台（图5-2）。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽而隔成两半，每个半边上面各刻有一个方格网。每个方格网共分9大格其中间的1大格又称为计数室，微生物的计数就在此大格中进行。常用的血球计数板的计数室有两种规格的刻度网格。一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，即为16×25。另一种是一个大方格分成25个中方格而每个中方格又分成16个小方格，即25×16。但是不管计数室是哪种规格，其计数室的小格数总是相同的，即16×25= 25×16= 400（小格），见下图。

图--计数网的区分与分格

每一个大方格边长为lmm、则每一大方格面积为lmm2。盖上盖玻片后，载玻片计数室与盖被片之间的高度为0.1mm，所以每个计数室（大方格）的体积为0.1mm3。在计数时，通常数5个中方格的总菌数，求得平均值。再乘上16或25就得一大方格中的总菌数。然后再换算成1mL菌液中的总菌数。（1mL = 1cm3 = 1 000mm3）

操作步骤如下：

1、取培养后的保加利亚乳杆菌液振荡混匀，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释到10-2）。稀释度选择以小方格中的分布的菌体清晰可数为宜。一般以每小格内含4～5个菌体的稀释度为宜。

2. 取清洁无油的血球计数板，在计数室上面加盖玻片。

3.将保加利亚乳杆菌液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴（不宜过多），使菌液沿两玻片间自行渗入计数室，勿使产生气泡，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌液。也可以将菌液直接滴加在计数室上，然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。

4. 静置5min后，将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数板的大方格网位置。寻找时光圈要缩小，光线要偏暗些，并将计数室移至视野中央。

5．计数时用由16中格的计数板，要按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个中格（即100小格）的保加利亚乳杆菌数。如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个格外，还需数中央l个中格的保加利亚乳杆菌菌数（即80个小格）。由于菌体在计数室中处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，因而观察时必须不断调节微调如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。

6．在高倍镜下计数：随机地计数5个中格内的菌数，然后求得每个中格的平均值。乘上16（或25）就得出1大格中的总菌数，最后再换算到每1mL菌液中的含菌数量。由于菌体细胞在血球计数板上处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，故观察时必须不断调节微调节器，方能数到全部菌体以免遗漏。

7. 计算方法

8. 血球计数板用后，在水龙头上用水柱冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后，并用吸水纸吸水，最后用擦镜纸擦干净，并放回盒内。

十二、保加利亚乳杆菌的生理生化试验

（1）乙酰甲基甲醇V-P实验

接种新鲜的实验菌种于培养基中, 40℃恒温箱中培养48小时后,取培养液1mL在其中加入1ml 10％NaOH，混匀，再加入3－4滴2%氯化铁溶液。数小时后，培养基表面的下层出现红色者，为阳性(2)糖发酵实验

将表下表所示培养基成分(指示剂除外)称取、溶解、摇匀，调整pH值为6.8—7.0，添加1．6％溴甲酚紫指示剂，按l％的浓度添加试验糖类并溶解，分装试管，每管5mL，121℃蒸汽灭菌20min。室温冷却待用。接种供试菌液0．025ml，置37℃恒温培养l、3、5天观察并记录结果。

结果判定：阳性结果为培养基的颜色变黄，表示产酸；阴性结果为颜色不变(与不含糖类的对照管相同)或变蓝(紫)。

糖发酵试验基础培养基组成

培养基成分称取量

蛋白胨5g

牛肉膏5g

酵母膏5g

吐温80 0.5ml

1．6％溴甲酚紫溶液 1.4ml

蒸馏水1000ml

十三、菌种保藏（液体石蜡保藏法）

（1）液体石蜡灭菌在250ml三角烧瓶内装入100ml液体石蜡，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，121.3℃灭菌30分钟，然后置于105~110℃烘箱中1h，使水汽蒸发掉，备用。

（2）将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养。

（3）用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准，使菌种与空气隔绝。

（4）保藏棉塞外包牛皮纸，将试管直立放置于4℃冰箱保藏。