葡萄球菌属检验
1．概述
葡萄球菌属是一类触酶试验阳性的革兰阳性球菌，包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、中间型葡萄球菌等35个种，17个亚种。金黄色葡萄球菌是最重要的致病葡萄球菌。
2.标本类型
血液、尿液、脑脊液、穿刺液、脓液等标本。
3.鉴定
3.1形态与染色革兰阳性球菌，成单、双、短链或不规则葡萄状排列。
3.2培养特性金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上的典型菌落为金黄色，周围有明显的?溶血环，部分菌落也可呈灰白色或柠檬色。在高盐甘露醇平板上呈淡橙黄色菌落。表皮葡萄球菌在血琼脂平板上菌落为白色或柠檬色，多数不溶血。
3.3生化反应金黄色葡萄球菌触酶试验阳性，分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和甘露醇，不分解棉子糖和水杨苷，明胶、血浆凝固酶和DNA酶试验阳性，七叶苷试验阴性。
3.4鉴别要点
3.4.1本菌属特征革兰阳性球菌，呈葡萄状排列，触酶试验阳性。金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上菌落呈金黄色或白色，DNA酶和血浆凝固酶试验均阳性，发酵苷露醇。
3.4.2与微球菌属的鉴别葡萄球菌属葡萄糖O/F试验为发酵型，镜下以葡萄状排列为主，菌体较小，而微球菌属为氧化型或无反应，镜下以四联排列为主，且菌体较大。
3.4.3与链球菌属的鉴别葡萄球菌属O/F试验为发酵型，触酶试验阳性，链球菌属葡萄糖O/F试验为氧化型，触酶试验阴性。
3.4.4凝固酶试验阳性葡萄球菌的鉴别见下表1。
表1凝固酶阳性葡萄球菌鉴别的关键性试验
菌名凝固触溶硝酸海藻半乳
酶酶血盐糖糖苷
酶
金黄色葡萄球菌金黄色
+++++-
亚种
金黄色葡萄球菌厌氧亚
+-+---
种
施氏葡萄球菌聚集亚种++++-ND
中间葡萄球菌++d+++
海豚葡萄球菌++++-ND
S.lutrae++++++
猪葡萄球菌d+-++-
注：“+”为90%以上菌株为阳性，“-”为90%以上菌株为阴性，“d”为11%-89%阳性，“ND”为无资料。
3.5操作步骤
3.5.1涂片、染色观察菌落特征，在血平板上挑取可疑菌落，涂片染色镜检。
3.5.2触酶试验参见《触酶试验标准操作规程》。
3.5.3凝固酶试验参见《凝固酶试验标准操作规程》。
3.5.4鉴定从血琼脂平板上挑取纯菌落，用微生物鉴定仪或传统生化反应进行细菌鉴定。
4.药敏
参见《药物敏感性试验标准操作规程》及CLSIM100-S20最新版本文件。
5.质量控制
参见《质量管理程序》。
6.检验结果解释与分析
6.1由于葡萄球菌分布广泛，从临床标本中分离到金黄色葡萄球菌时，将其定为致病菌
时应慎重。应根据凝固酶试验进一步确认。对可疑菌株的鉴定，最好利用商品化的鉴定系统根据生化图谱进行确定。表皮葡萄球菌分离自导管相关血流感染时，通常视为致病菌。溶血性葡萄球菌从泌尿感染病人分离得到时，尤其是细菌量较大或作为优势菌时，通常被视为致病菌。
6.2甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌（MRSA）对多种广谱强效抗菌药物呈多重耐药性。如果检测出耐甲氧西林的葡萄球菌菌株则报告耐所有青霉素、头孢菌素、碳青霉烯类和?-内酰胺药/?-内酰胺酶抑制剂类抗生素，对氨基糖苷类和大环内酯类抗生素常协同耐药。若葡萄球菌属对四环素敏感，则对多西环素和米诺环素敏感。某些菌对四环素中介或耐药，而对多西环素和米诺环素敏感。临床感染葡萄球菌的病人用喹诺酮类治疗3-4日后，原来敏感的葡萄球菌易产生耐药。所以对这类葡萄球菌需多次反复进行药敏试验。大环内酯类耐药葡萄球菌包括固有耐药和诱导耐药。所以临床试验室须进行“D”试验以检测克林霉素诱导性耐药，根据“D”试验结果来报告克林霉素的耐药性。
7.临床意义
葡萄球菌属在自然界分布很广。存在于空气、水、尘埃及皮肤上的葡萄球菌大多数无致病性。金黄色葡萄球菌主要引起局部组织的化脓性感染（疖、痈和创伤感染）、菌血症、心内膜炎等全身感染等，也可引起骨髓炎、化脓性关节炎、肺炎和深部脓肿等。腐生葡萄球菌引起尿道感染、前列腺炎、外伤和菌血症等。溶血葡萄球菌引起心内膜炎、菌血症、腹膜炎、尿道感染、外伤、骨折和关节炎等。
MRSA的治疗：轻度感染可选用SMZ-TMP和喹诺酮类，严重全身感染选用万古霉素或其他糖肽类药物。
8.鉴定流程
[1]
微生物学检验领域的指南.2008
[2]周庭银编着.临床微生物学诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007
[3]叶应妩，王毓三，申子瑜主编.全国临床检验操作规程.第3版.南京：东南大学出版社，2006
[4]MurrayPR.ManualofCinicalMicrobilogy.9thed.Washington:ASMPress,2007
[5]ISO15189：2007医学实验室-质量和能力认可准则.2007
金黄色葡萄球菌检测方法
金黄色葡萄球菌检测方 法 Revised as of 23 November 2020
金黄色葡萄球菌检测方法 1.纸片法 目前广泛应用的一种方法，用纸片、膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过观察微生物在测试片上面的生长、显色来测定食品中微生物。采用快速测试片检测具有显着的优点：可测定少量检品，不需要配制试剂，不需要大量的玻璃器皿，操作简便迅速；易于消毒保存，便于运输携带方便，价格低廉；除纸片外无其他任何废液废物，大大减少了工作量；可以在取样时同时接种，结果更能反映当时样本中真实细菌数，防止延长接种时间时细菌繁殖造成的污染。 技术优点：操作简单使用方便，避免了繁琐的操作。 技术缺点：用时间比较长，无法准确定性及计数。 此方法现在应用于快速检测领域，美国3M公司Petrifilm为载体的测试片应用最为广泛。但其也存在一些问题：Petrifilm测试片上覆盖了一层薄膜，当样品粘液过多时会出现菌落的扩散和融合，影响计数；Petrifilm测试片面积较小，当菌量大于250cfu时，准确计数较困难；待测样品中含有的某些有机物可能使显色减缓。使目视效果下降，导致计数偏低。 2.免疫学方法 各种免疫学方法的基本原理都是抗原抗体反应。抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。金黄色葡萄球菌特异的抗原能激发机体产生相应的特异性抗体。在免疫检测中，可利用单克隆抗体检测金黄色葡萄球菌的特异抗原，也可利用金黄色葡萄球菌抗原检测体内产生的特异抗体，两种方法均能判断机体的感染状况。目前对于金黄色葡萄球菌的测定主要进行了肠毒素的测定，方法以酶联免疫吸附实验为主，有胶体金方法，也有用亲和素一生物素乳胶凝集实验和免疫荧光实验，但都有一定的局限性。 免疫学方法包括下面两个部分： （1）抗原抗体技术分析：抗原抗体技术是免疫技术中的核心部分，对于金黄色葡萄球菌检测全菌免疫筛选抗体是很困难的事情，现在目前市场有的大多都是对金黄色葡萄球菌毒素类进行免疫得到的抗体，金黄色葡萄球菌毒素有12种，军事医学科学院生产的金黄色葡萄球菌毒素A、B、C的抗体。毒素抗体优势在于敏感度高，易于检查，缺点毒素种类多，检测其中几种不具有普遍性。毒素分离工艺复杂，要得到纯毒素成本比较高。 （2）免疫学方法技术分析：上述免疫学技术应用最多的是酶联免疫技术和胶体金侧向层析技术。酶联免疫技术广泛应用于实验室检测，由于一次可以检测多个样本，此技术多用于体外诊断，目前也广泛用于食品安全。胶体金技术由于操作简单，检测适度快等优势，在食品安全领域广泛用于现场快速检测。 基于免疫学方法的技术主要分为：酶联免疫技术、胶体金侧向层析技术、免疫荧光技术、免疫沉淀技术、乳胶凝集技术、免疫磁珠技术。 3.分子生物学方法 金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：肠毒素、血浆凝固酶、溶血素、杀白细胞素、表皮溶解毒素、毒性体克综合重量毒素I 等。而这些致病因子基因的鉴定(包括耐药性相关基因、毒素基因、酶基因及多
葡萄球菌属检验
1．概述 葡萄球菌属是一类触酶试验阳性的革兰阳性球菌，包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、中间型葡萄球菌等35个种，17个亚种。金黄色葡萄球菌是最重要的致病葡萄球菌。 2. 标本类型 血液、尿液、脑脊液、穿刺液、脓液等标本。 3. 鉴定 3.1 形态与染色革兰阳性球菌，成单、双、短链或不规则葡萄状排列。 3.2 培养特性金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上的典型菌落为金黄色，周围有明显的?溶血环，部分菌落也可呈灰白色或柠檬色。在高盐甘露醇平板上呈淡橙黄色菌落。表皮葡萄球菌在血琼脂平板上菌落为白色或柠檬色，多数不溶血。 3.3 生化反应金黄色葡萄球菌触酶试验阳性，分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和甘露醇，不分解棉子糖和水杨苷，明胶、血浆凝固酶和DNA酶试验阳性，七叶苷试验阴性。 3.4 鉴别要点 3.4.1 本菌属特征革兰阳性球菌，呈葡萄状排列，触酶试验阳性。金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上菌落呈金黄色或白色，DNA酶和血浆凝固酶试验均阳性，发酵苷露醇。 3.4.2 与微球菌属的鉴别葡萄球菌属葡萄糖O/F试验为发酵型，镜下以葡萄状排列为主，菌体较小，而微球菌属为氧化型或无反应，镜下以四联排列为主，且菌体较大。 3.4.3 与链球菌属的鉴别葡萄球菌属O/F试验为发酵型，触酶试验阳性，链球菌属葡
萄糖O/F试验为氧化型，触酶试验阴性。 3.4.4 凝固酶试验阳性葡萄球菌的鉴别见下表1。 表1 凝固酶阳性葡萄球菌鉴别的关键性试验 菌名 凝固 酶触酶溶血 硝酸 盐 海藻 糖 半乳糖 苷酶 金黄色葡萄球菌金黄色亚 种 +++++- 金黄色葡萄球菌厌氧亚种+-+--- 施氏葡萄球菌聚集亚种++++-ND 中间葡萄球菌++d+++ 海豚葡萄球菌++++-ND S.lutrae++++++ 猪葡萄球菌d+-++- 注：“+”为90%以上菌株为阳性，“-”为90%以上菌株为阴性，“d”为11%-89%阳性，“ND”为无资料。 3.5 操作步骤 3.5.1 涂片、染色观察菌落特征，在血平板上挑取可疑菌落，涂片染色镜检。
实验六 金黄色葡萄球菌检验
实验六金黄色葡萄球菌检验（第二篇） 1 目的 1.1 了解金黄色葡萄球菌检验原理 1.2 掌握金黄色葡萄球菌鉴定要点和检验方法 2 原理 葡萄球菌在自然界分布极广，空气、土壤、水、饲料、食品(剩饭、糕点、牛奶、肉品等)以及人和动物的体表粘膜等处均有存在，大部分是不致病，也有一些致病的球菌。金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属一个种。可引起皮肤组织炎症，还能产生肠毒素。如果在食品中大量生长繁殖，产生毒素，人误食了含有毒素的食品，就会发生食物中毒，故食品中存在金黄色葡萄球菌对人的健康是一种潜在危险，检查食品中金黄色葡萄球菌及数量具有实际意义。 金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，使血浆凝固，多数致病菌株能产生溶血毒素，使血琼脂平板菌落周围出现溶血环，在试管中出现溶血反应。这些是鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标。 3 材料 3.1 样品 奶、肉、蛋、鱼制品和饮料等。 3.2 菌种 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 藤黄八叠球菌（Sarcina lutea） 3.3 培养基与试剂 7.5%氯化钠肉汤、血琼脂平板、Baird-parker氏培养基、无菌盐水、兔血浆、革兰氏染色液。 3.4 其它 显微镜、温箱、离心机、无菌吸管、无菌试管、无菌平皿、均质器、载玻片、L型涂布棒、酒精灯、接种环等。 4 流程 5 步骤 5.1 一般培养 称取25g固体样品，加入225mL无菌生理盐水，制成混悬液(液体样品可不稀释)。吸取5mL上述混悬液，接种于7.5%氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤50mL培养基
内，同时挑取混悬液或液体样品直接在血平板和Baird-Parker平板划线分离。同时将对照菌种在上述两种平板上作划线分离接种。置36±1℃温箱培养24h。 5.2 分纯培养 将上述血平板和Baird-Parker平板上挑取可疑菌落,先观察对照的菌落特征,再观察被检样品的菌落.,并挑取可疑菌落在血平板上进行分离纯化。若无菌落生长，可用也增菌培养物在上上述平板上划线分离，在36±1℃温箱培养24h后再分离纯化，挑取可疑菌落及对照菌种进行革兰氏染色及血浆凝固酶试验。 5.3 形态特征 本菌为革兰氏阳性球菌，排列是葡萄状，无芽孢，无荚膜，致病性葡萄球菌菌体较小，直径约为0.5～1um。 在肉汤中呈混浊生长，在胰酪胨大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈混浊生长，血平板菌落呈金黄色，也有时呈白色，大而突起、圆形、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。在Baird-Parker平板上为圆形、光滑凸起、湿润、直径2～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度。偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。 5.5血浆凝固酶试验 挑取上述可疑菌落菌种于肉浸液肉汤，同时将金黄色葡萄球菌和藤黄八叠球菌分别接种于肉浸液肉汤，在36±1℃温箱培养24h后进行血浆凝固酶试验。 吸取1∶4新鲜兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入培养24h的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养基0.5mL，振荡摇匀，放在36℃温箱或水浴内，每0.5h观察一次，观察6h，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为是阳性结果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。 6 结果 根据形态染色，血平板情况以及血浆凝固酶试验，判别检样有否金黄色葡萄球菌。 7 思考 7.1 金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上的菌落特征如何？为什么？ 7.2 鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标是什么？
实验七--食品中金黄色葡萄球菌的检验
实验七食品中金黄色葡萄球菌的检验 一、实验目的要求 1、了解食品的质量与金黄色葡萄球菌检验的意义。 2、掌握金黄色葡萄球菌的生物学特性。 3、掌握金黄色葡萄球菌检验的生化试验的操作方法和结果的判断。 4、掌握食品中金黄色葡萄球菌检验的方法和技术。 二、原理 葡萄球菌在自然界分布极广，空气、土壤、水、饲料、食品(剩饭、糕点、牛奶、肉品等)以及人和动物的体表粘膜等处均有存在，大部分是不致病，也有一些致病的球菌。金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属一个种。可引起皮肤组织炎症，还能产生肠毒素。如果在食品中大量生长繁殖，产生毒素，人误食了含有毒素的食品，就会发生食物中毒，故食品中存在金黄色葡萄球菌对人的健康是一种潜在危险，检查食品中金黄色葡萄球菌及数量具有实际意义。 金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，使血浆凝固，多数致病菌株能产生溶血毒素，使血琼脂平板菌落周围出现溶血环，在试管中出现溶血反应。这些是鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标。 三、试剂和仪器 （一）最先准备的器材 规格名称数量用途 1、500ml广口瓶1个稀释样品 2、500ml三角瓶1个制生理盐水 3、250ml三角瓶3个制培养基等 4、10×100mm试管6支血浆凝固酶试验 5、1ml移液管2支 6、10ml移液管 2 支 7、直径为90 mm平皿12套制血平板B-P平板 8、250ml量筒1支 （二）应灭菌的其它器材 剪刀1把不锈钢汤匙1把称量纸适量 （三）应制备的培养基 培养基总量所用容器 1.无菌水50ml/瓶1瓶250ml三角瓶（全班共用） 2.0.85%生理盐水70ml/瓶1瓶250ml三角瓶（全班共用） 3.0.85%生理盐225ml/瓶1瓶500ml三角瓶 4.7.5%NaCl肉汤50ml/瓶1瓶250ml三角瓶
金黄色葡萄球菌及其检验
我们以SN标准中的最近似值(MPN)测定法来进行讲解： 这种方法适用于检测认为带有大量竞争菌的食品及其原料和未经处理的食品中的少量金黄色葡萄球菌。 1、样品制备： 固体或半固体食品: 以无菌操作称取25g样品,放入装有225mL灭菌生理盐水的灭菌均质杯内,于8000r/min均质1～2min,制成1:10样品匀液。 液体食品: 用灭菌吸管吸取25mL样品,放入装有225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内 (瓶内预置适当数量的玻璃珠),经充分振摇制成1:10样品匀液。 供计数检验时,可按十进位递增稀释法将样品匀液再进行适当稀释。 2、选三个连续稀释度，从每个稀释度分别取1 mL稀释样品液，接种3管含10％氯化钠why?还记得么？金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10-15%NaCl肉汤中生长。因此，这事实上是一种选择性的增菌。胰蛋白胨大豆肉汤。样品的最高稀释度必须达到能获得阴性终点,置36±1℃培养48 h。 3、用3 mm接种环,从有细菌生长的各管中移取1 环,划线接种于表面干燥的Baird- Parker琼脂平板,置36±1℃培养45～48h。 4、从有细菌生长的每一平板上至少挑取1个可疑金黄色葡萄球菌菌落,移种到肉汤培养基中,置36±1℃培养20～24 h。 5、取肉汤培养物0.3mL同0.5mL凝固酶试验兔血浆于8mm×100mm试管内充分混合,置36±1℃培养,定时观察是否有凝块形成,至少观察6 h,以内容物完全凝固,使试管倒置或倾斜时不流动者为阳性。试验中需同时做巳知阳性和阴性对照。对可疑结果,应进行革兰氏染色、镜检和其他辅助试验{如耐热核酸酶试验等} 加以证实。 6、报告结果：根据凝固酶试验结果查最近似值(MPN)表,报告金黄色葡萄球菌的MPN/g (mL)。 附：怎样在平板上进行细菌的划线分离。 1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法
葡萄球菌属检验
葡萄球菌属检验文件编码（GHTU-UITID-GGBKT-POIU-WUUI-8968）
1．概述 葡萄球菌属是一类触酶试验阳性的革兰阳性球菌，包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、中间型葡萄球菌等35个种，17个亚种。金黄色葡萄球菌是最重要的致病葡萄球菌。 2.标本类型 血液、尿液、脑脊液、穿刺液、脓液等标本。 3.鉴定 3.1形态与染色革兰阳性球菌，成单、双、短链或不规则葡萄状排列。 3.2培养特性金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上的典型菌落为金黄色，周围有明显的?溶血环，部分菌落也可呈灰白色或柠檬色。在高盐甘露醇平板上呈淡橙黄色菌落。表皮葡萄球菌在血琼脂平板上菌落为白色或柠檬色，多数不溶血。 3.3生化反应金黄色葡萄球菌触酶试验阳性，分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和甘露醇，不分解棉子糖和水杨苷，明胶、血浆凝固酶和DNA酶试验阳性，七叶苷试验阴性。 3.4鉴别要点 3.4.1本菌属特征革兰阳性球菌，呈葡萄状排列，触酶试验阳性。金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上菌落呈金黄色或白色，DNA酶和血浆凝固酶试验均阳性，发酵苷露醇。 3.4.2与微球菌属的鉴别葡萄球菌属葡萄糖O/F试验为发酵型，镜下以葡萄状排列为主，菌体较小，而微球菌属为氧化型或无反应，镜下以四联排列为主，且菌体较大。 3.4.3与链球菌属的鉴别葡萄球菌属O/F试验为发酵型，触酶试验阳性，链球菌属葡萄糖O/F试验为氧化型，触酶试验阴性。 3.4.4凝固酶试验阳性葡萄球菌的鉴别见下表1。 表1凝固酶阳性葡萄球菌鉴别的关键性试验
菌名凝固 酶 触 酶 溶 血 硝酸 盐 海藻 糖 半乳 糖苷 酶 金黄色葡萄球菌金黄色 亚种 +++++- 金黄色葡萄球菌厌氧亚 种 +-+--- 施氏葡萄球菌聚集亚种++++-ND 中间葡萄球菌++d+++ 海豚葡萄球菌++++-ND S.lutrae++++++ 猪葡萄球菌d+-++- 注：“+”为90%以上菌株为阳性，“-”为90%以上菌株为阴性，“d”为11%-89%阳性，“ND”为无资料。 3.5操作步骤 3.5.1涂片、染色观察菌落特征，在血平板上挑取可疑菌落，涂片染色镜检。 3.5.2触酶试验参见《触酶试验标准操作规程》。 3.5.3凝固酶试验参见《凝固酶试验标准操作规程》。 3.5.4鉴定从血琼脂平板上挑取纯菌落，用微生物鉴定仪或传统生化反应进行细菌鉴定。 4.药敏 参见《药物敏感性试验标准操作规程》及CLSIM100-S20最新版本文件。 5.质量控制 参见《质量管理程序》。 6.检验结果解释与分析 6.1由于葡萄球菌分布广泛，从临床标本中分离到金黄色葡萄球菌时，将其定为致病菌时应慎重。应根据凝固酶试验进一步确认。对可疑菌株的鉴定，最好利用商品化的鉴定系统根据生化图谱进行确定。表皮葡萄球菌分离自导管相关血流感染时，通常视为致病菌。溶血性葡萄球菌从泌尿感染病人分离得到时，尤其是细菌量较大或作为优势菌时，通常被视为致病菌。
葡萄球菌属检验
精心整理1．概述 葡萄球菌属是一类触酶试验阳性的革兰阳性球菌，包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、中间型葡萄球菌等35个种，17个亚种。金黄色葡萄球菌是最重要的致病葡萄球菌。 2.标本类型 血液、尿液、脑脊液、穿刺液、脓液等标本。 3.鉴定 3.1形态与染色革兰阳性球菌，成单、双、短链或不规则葡萄状排列。 3.2培养特性金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上的典型菌落为金黄色，周围有明显的 溶血环，部分菌落也可呈灰白色或柠檬色。在高盐甘露醇平板上呈淡橙黄色菌落。表皮葡萄球菌在血琼脂平板上菌 O/F试 ”为3.5.1涂片、染色观察菌落特征，在血平板上挑取可疑菌落，涂片染色镜检。 3.5.2触酶试验参见《触酶试验标准操作规程》。 3.5.3凝固酶试验参见《凝固酶试验标准操作规程》。 3.5.4鉴定从血琼脂平板上挑取纯菌落，用微生物鉴定仪或传统生化反应进行细菌鉴定。 4.药敏 参见《药物敏感性试验标准操作规程》及CLSIM100-S20最新版本文件。 5.质量控制 参见《质量管理程序》。 6.检验结果解释与分析 6.1由于葡萄球菌分布广泛，从临床标本中分离到金黄色葡萄球菌时，将其定为致病菌时应慎重。
精心整理 应根据凝固酶试验进一步确认。对可疑菌株的鉴定，最好利用商品化的鉴定系统根据生化图谱进行确定。表皮葡萄球菌分离自导管相关血流感染时，通常视为致病菌。溶血性葡萄球菌从泌尿感染病人分离得到时，尤其是细菌量较大或作为优势菌时，通常被视为致病菌。 6.2甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌（MRSA）对多种广谱强效抗菌药物呈多重耐药性。如果检测出耐甲氧西林的葡萄球菌菌株则报告耐所有青霉素、头孢菌素、碳青霉烯类和?-内酰胺药/?-内酰胺酶抑制剂类抗生素，对氨基糖苷类和大环内酯类抗生素常协同耐药。若葡萄球菌属对四环素敏感，则对多西环素和米诺环素敏感。某些菌对四环素中介或耐药，而对多西环素和米诺环素敏感。临床感染葡萄球菌的病人用喹诺酮类治疗3-4日后，原来敏感的葡萄球菌易产生耐药。所以对这类葡萄球菌需多次反复进行药敏试验。大环内酯类耐药葡萄球菌包括固有耐药和诱导耐药。所以临床试验室须进行“D”试验以检测克林霉素诱导性耐药，根据“D”试验结果来报告克林霉素的耐药性。 7.临床意义 金黄等， 等。 MRSA 物。 8. [1] [2] [3]
葡萄球菌属检验
蒈1．概述 蒅葡萄球菌属是一类触酶试验阳性的革兰阳性球菌，包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、中间型葡萄球菌等35个种，17个亚种。金黄色葡萄球菌是最重要的致病葡萄球菌。 芀2.标本类型 袈血液、尿液、脑脊液、穿刺液、脓液等标本。 薈3.鉴定 袆3.1形态与染色革兰阳性球菌，成单、双、短链或不规则葡萄状排列。 羂3.2培养特性金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上的典型菌落为金黄色，周围有明显的 溶血环，部分菌落也可呈灰白色或柠檬色。在高盐甘露醇平板上呈淡橙黄色菌落。表皮葡萄球菌在血琼脂平板上菌落为白色或柠檬色，多数不溶血。 袁3.3生化反应金黄色葡萄球菌触酶试验阳性，分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和甘露醇，不分解棉子糖和水杨苷，明胶、血浆凝固酶和DNA酶试验阳性，七叶苷试验阴性。 蚈3.4鉴别要点 羃3.4.1本菌属特征革兰阳性球菌，呈葡萄状排列，触酶试验阳性。金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上菌落呈金黄色或白色，DNA酶和血浆凝固酶试验均阳性，发酵苷露醇。 蚄3.4.2与微球菌属的鉴别葡萄球菌属葡萄糖O/F试验为发酵型，镜下以葡萄状排列为主，菌体较小，而微球菌属为氧化型或无反应，镜下以四联排列为主，且菌体较大。 蚀3.4.3与链球菌属的鉴别葡萄球菌属O/F试验为发酵型，触酶试验阳性，链球菌属葡萄糖O/F试验为氧化型，触酶试验阴性。 螈3.4.4凝固酶试验阳性葡萄球菌的鉴别见下表1。 莄表1凝固酶阳性葡萄球菌鉴别的关键性试验 膂菌名葿凝固 酶 袇触 酶 螅溶 血 袄硝酸 盐 膈海藻 糖 羇半乳糖 苷酶 膆金黄色葡萄球菌金黄色亚种莂+ 芁+ 肇+ 莃+ 肄+ 羀- 肇金黄色葡萄球菌厌氧亚种螄+ 蒁- 蝿+ 膇- 膄- 芃- 螁施氏葡萄球菌聚集亚种芇+ 薅+ 蚁+ 薀+ 莇- 羆ND 莃中间葡萄球菌荿+ 蒇+ 肃d 袁+ 膈+ 薆+ + - ND
葡萄球菌属检验
文件页码：1/3 1．概述 葡萄球菌属是一类触酶试验阳性的革兰阳性球菌，包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、中间型葡萄球菌等35个种，17个亚种。金黄色葡萄球菌是最重要的致病葡萄球菌。 2. 标本类型 血液、尿液、脑脊液、穿刺液、脓液等标本。 3. 鉴定 3.1 形态与染色革兰阳性球菌，成单、双、短链或不规则葡萄状排列。 3.2 培养特性金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上的典型菌落为金黄色，周围有明显的 溶血环，部分菌落也可呈灰白色或柠檬色。在高盐甘露醇平板上呈淡橙黄色菌落。表皮葡萄球菌在血琼脂平板上菌落为白色或柠檬色，多数不溶血。 3.3 生化反应金黄色葡萄球菌触酶试验阳性，分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和甘露醇，不分解棉子糖和水杨苷，明胶、血浆凝固酶和DNA酶试验阳性，七叶苷试验阴性。 3.4 鉴别要点 3.4.1 本菌属特征革兰阳性球菌，呈葡萄状排列，触酶试验阳性。金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上菌落呈金黄色或白色，DNA酶和血浆凝固酶试验均阳性，发酵苷露醇。 3.4.2 与微球菌属的鉴别葡萄球菌属葡萄糖O/F试验为发酵型，镜下以葡萄状排列为主，菌体较小，而微球菌属为氧化型或无反应，镜下以四联排列为主，且菌体较大。 3.4.3 与链球菌属的鉴别葡萄球菌属O/F试验为发酵型，触酶试验阳性，链球菌属葡萄糖O/F试验为氧化型，触酶试验阴性。 3.4.4 凝固酶试验阳性葡萄球菌的鉴别见下表1。 表1 凝固酶阳性葡萄球菌鉴别的关键性试验 菌名凝固酶触酶溶血硝酸盐海藻糖半乳糖苷酶 金黄色葡萄球菌金黄色亚种+ + + + + - 金黄色葡萄球菌厌氧亚种+ - + - - - 施氏葡萄球菌聚集亚种+ + + + - ND 中间葡萄球菌+ + d + + + 海豚葡萄球菌+ + + + - ND S.lutrae + + + + + + 猪葡萄球菌 d + - + + - 注：“+”为90%以上菌株为阳性，“-”为90%以上菌株为阴性，“d”为11%-89%阳性，“ND”为无资料。 3.5 操作步骤 3.5.1 涂片、染色观察菌落特征，在血平板上挑取可疑菌落，涂片染色镜检。 3.5.2 触酶试验参见《触酶试验标准操作规程》。 3.5.3 凝固酶试验参见《凝固酶试验标准操作规程》。 3.5.4 鉴定从血琼脂平板上挑取纯菌落，用微生物鉴定仪或传统生化反应进行细菌鉴定。 4. 药敏 参见《药物敏感性试验标准操作规程》及CLSI M100-S20最新版本文件。 5. 质量控制
实验5 金黄色葡萄球菌的检验
实验5 金黄色葡萄球菌的检验 1 目的和要求 （1）掌握金黄色葡萄球菌的检验方法 （2）了解金黄色葡萄球菌各检验步骤的依据及原理 2 基本原理 金黄色葡萄球菌进入人体内，可引起局部的痈疾和蜂窝组织炎，还可以引起肺炎、心肌炎、骨骼炎、肾盂肾炎等系统化脓性感染，甚至可发展成败血症。此外，食品中生长金黄色葡萄球菌是食品卫生中的一种潜在危险，因为金黄色葡萄球菌在是中会产生肠毒素，食用后将引起食物中毒，这在我国细菌性食物中毒事件中，仅次于沙门氏菌和副溶血弧菌。因此，检验食品中金黄色葡萄球菌是实际意义。绝大多数金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上产生金黄色色素，菌落周围有透明的溶血圈，在厌氧条件下能分解甘露醇产酸，产生血浆凝固酶和耐热的DNA酶。 3 实验材料 3.1 检样乳与乳制品（如奶粉、消毒乳）、肉制品、饮料 3.2 菌种金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌斜面培养物。 3.3 培养基7.5%氯化钠肉汤、肉浸液肉汤、血琼脂平板、Baird-Parker氏培养基 3.4 试剂与染色剂无菌生理盐水、兔血浆、革兰氏染色液等。 3.5 仪器与其他用具无菌吸管（1mL、5、10）、无菌试管、载玻片、接种环、酒精灯、显微镜、均质器、恒温箱等。 4 检样程序 5 操作步骤 5.1 5.1.1样品的处理
称取25 g 样品至盛有225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min，或放入盛有225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min。若样品为液态，吸取25 mL 样品至盛有225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预臵适当数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀。 5.1.2 增菌和分离培养 5.1.2.1 将上述样品匀液于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严重时在10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。 5.1.2.2 将上述培养物，分别划线接种到Baird-Parker 平板和血平板，血平板36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。Baird-Parker 平板36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h 或45 h～48 h。 5.1.2.3 金黄色葡萄球菌在Baird-Parker 平板上，菌落直径为2 mm～3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。 5.1.3 鉴定 5.1.3.1 染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为0.5 μm～1 μm。 5.1.3.2 血浆凝固酶试验：挑取、Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落1个或以上，分别接种到5 mL BHI和营养琼脂小斜面，36 ℃±1℃培养18 h～24 h。 取新鲜配臵兔血浆0.5 mL，放入小试管中，再加入BHI 培养物0.2 mL～0.3 mL，振荡摇匀，臵36℃±1℃温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察 6 h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒臵时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。 结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到 5 mL BHI，36 ℃±1℃培养18 h～48 h，重复试验。 病原性葡萄球菌多数产生血浆凝固酶，非病原性的一般不产生。因此，该法是判定葡萄球菌有无致病性的重要指标。 5.2 金黄色葡萄球菌Baird-Parker平板计数 5.2.1 样品的稀释 5.2.1.1固体和半固体样品：称取25 g样品臵盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min～10000 r/min均质1 min～2 min，或臵盛有225 mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2 min，制成1:10的样品匀液。 5.2.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL样品臵盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预臵适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。 5.2.1.3 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用 1 支1 mL 无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。 5.2.1.4 按5.2.1.3 操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1 次1 mL 无菌吸管或吸头。 5.2.2 样品的接种
葡萄球菌属鉴定
葡萄球菌属鉴定 一、目的 对某一细菌的鉴定水平，可提供以下几方面的价值：（1）决定 治病方法；（2）作流行病学研究；（3）了解细菌与感染的关系； （4）进行学术交流。 二、原理 根据葡萄球菌的形态染色、培养特性、生化反应、抗原构造等 将葡萄球菌由属鉴定到具体种类。 三、标本 不同病种及不同检查目的而定，可为脓汁、渗透液、咽拭子、 血、脑脊液、食物、呕吐物、粪便等，置于无菌瓶内送检。四、试剂及器材 革兰氏染液、培养皿、培养瓶、生化鉴定管、血浆、玻片、接 种针（环）、酒精灯等。 五、鉴定程序 标本 涂片、染色 痰、脓汁、血、脑脊液粪便、呕吐物
平皿 可凝菌落 纯培养 涂片、染色、触酶实验 葡萄状（G+）、触酶（+） 血浆凝固酶、葡萄糖甘露醇分解、高盐耐受实验 甘露醇分解（需O2、甘露醇分解（—） 厌O2均+） 血浆凝固酶（+）、新生霉素（+）血浆凝固酶（—） 新生霉素 S R 表皮葡萄球菌腐生葡萄球菌 六、质量控制 每周进行一次葡萄球菌标准菌株的革兰氏染色、触酶、血浆凝固酶及新生霉素实验。 七、实验室解释及临床意义
1、葡萄球菌广泛存在于自然界，医院内葡萄球菌的存在成为院 内交叉感染的重要因素。 2、葡萄球菌是化脓性感染的重要病原菌。 3、葡萄球菌引起尿路感染的比例很大。 八、安全防护措施 在操作过程中，要穿好工作衣，戴好口罩、手套，必要时戴眼 罩，严格按操作规程，结束后，用次氯酸溶液（0.2%）擦拭实 验台、显微镜手柄、载物台，浸泡手，然后紫外线消毒30分钟。 九、标本处理 废弃标本，培养基等统一由专门人员高压消毒处理。 十、参考文献 诊断细菌学，李仲兴等主编、第一版、香港、黄河文化出版社，1992。
金黄色葡萄球菌检测
金黄色葡萄球菌检测 1 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 1.1 恒温培养箱：36℃±1℃。 1.2 冰箱：2℃～5℃。 1.3 恒温水浴箱：37℃～65℃。 1.4 天平：感量0.1g。 1.5 均质器。 1.6 振荡器。 1.7 无菌吸管：1ml（具0.01ml刻度）、10ml（具0.1ml刻度）或微量移液器及吸头。 1.8 无菌锥形瓶：容量100ml、500ml。 1.9 无菌培养皿：直径90mm。 1.10 注射器：0.5ml。 1.11 pH计或pH比色管或精密pH试纸。 2 培养基和试剂 2.1 Baird-Parker 琼脂平板：见附录中1。 2.2 脑心浸出液肉汤(BHI) ：见附录中2。 2.3 兔血浆：见附录中3。 2.4 营养琼脂小斜面：见附录中4。 2.5 无菌生理盐水：见附录中5。 3 操作步骤 3.1 样品的稀释
3.1.1 固体和半固体样品 称取25g样品置盛有225ml生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min均质1min～2min，或置盛有225ml稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1：10的样品匀液。 3.1.2 液体样品 以无菌吸管吸取25ml样品置盛有225ml生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1：10的样品匀液。 3.1.3 用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1ml，沿管壁缓慢注于盛有9ml稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1ml无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。 3.1.4 按3.1.3操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用一次1ml无菌吸管或吸头。 3.2 样品的接种 根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1ml样品匀液以0.3ml、0.3ml、0.4ml接种量分别加入三块Baird-Parker平板，然后用无菌L棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。使用前，如Baird-Parker平板表面有水珠，可放在25℃～50℃的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。 3.3 培养 在通常情况下，涂布后，将平板静置10min，如样液不易吸收，可将平板放在培养箱36℃±1℃培养1h；等样品匀液吸收后翻转平皿，倒置于培养箱，36℃±1℃培养，45h～48h。
葡萄球菌属
葡萄球菌属 金黄色葡萄球菌 形态染色：呈圆形或椭圆形，无鞭毛，无芽孢，除了少数菌株外不能形成荚膜。为革兰阳性球菌。 培养特性：兼性厌氧。对营养要求不高。最适生长温度：35-37℃，最适pH：7.4-7.6。 在普通培养基上形成2-3mm大小，呈金黄色，白色，柠檬色等不透明圆形凸起的菌落。 在血平板上菌落较大，致病性葡萄球菌可形成透明的β-溶血环。 耐盐，能在含10%-15%NaCl的培养基上生长。 在20%-30%CO2环境中，有利于其毒素的产生。 生化反应：葡萄球菌生化反应活泼： 1.触酶（+） 2.能分解葡萄糖，麦芽糖，乳糖和蔗糖，产酸不产气。 3.能分解氨基酸和蛋白质。 4.分解甘露醇。 5.液化明胶。 6.产生血浆凝固酶。 7.硝酸盐还原（+） 抗原构造：1.葡萄球菌A蛋白 2.多糖抗原 致病性：酶类：1.血浆凝固酶：结合凝固酶结合于菌体表面，能与血浆中的纤维蛋白原交联使菌体快速凝集。游离凝固酶由细菌分泌至体外，可使血浆中的纤维蛋白原变成纤维蛋白而是血浆凝固。 2.耐热核酸酶（TN）:能耐受100℃，15分钟加热，水解DNA和RNA 。 3.透明质酸酶（HAase）:能水解细胞外成分透明质酸，协助细菌在组织内传播扩散。 4.磷酸酶等。 毒素：致病性葡萄球菌能产生溶血毒素，为外毒素。 葡萄球菌产生的杀白细胞素（PVL）能损伤中性粒和巨噬细胞，形成脓液，导致组织坏死等。金黄色葡萄球菌根据其噬菌体可分为三群：噬菌体Ⅰ群可产生毒性休克综合征毒素。 噬菌体Ⅱ群产生表皮脱落样毒素，能引起人类烫伤样皮肤综合征。噬菌体Ⅲ群可产生耐热的肠毒素，能引起食物中毒，表现为急性肠胃炎。 致病类型：1.化脓性疾病：如皮肤化脓性感染，器官化脓性感染如气管炎，肺炎，心内膜炎等，以及全身感染如败血症及脓毒血症等。 2.毒素性疾病： 3.医院感染：主要为凝固酶阴性葡萄球菌产生，如表皮葡萄球菌引起人工瓣膜心内膜炎，静脉导管感染和人工关节感染等。 耐药性：对β-内酰胺类抗生素耐药。
葡萄球菌感染
【葡萄球菌感染】 葡萄球菌感染是常见的细菌感染性疾病，多表现为皮肤、软组织感染，也可由此导致病情严重、危及生命的败血症、心内膜炎、肺炎、脑膜炎等;此外尚可引起异物相关感染、尿路感染、骨髓炎、关节炎、肠炎等。 葡萄球菌为革兰阳性球菌，属于微球菌科，葡萄球菌属，此属有细菌32种，除金黄色葡萄球菌(金葡菌)产生血浆凝固酶外，其余多数菌种为凝固酶阴性，寄殖于人类皮肤。其中较常见的致病菌为表皮葡萄球菌 (表葡菌)、溶血葡萄球菌和腐生葡萄球菌，少见的致病菌有:头葡萄球菌、孔氏葡萄球菌、人葡萄球菌、吕克杜纳西葡萄球菌、解糖葡萄球菌、施氏葡萄球菌、模仿葡萄球菌、华纳葡萄球菌和木糖葡萄球菌；罕见致病或致病性不肯定的有:阿尔莱葡萄球菌、耳葡萄球菌、山羊葡萄球菌、肉葡萄球菌、溶酪葡萄球菌、产色葡萄球菌、海豚葡萄球菌、马胃葡萄球菌、胆汁葡萄球菌、鸡葡萄球菌、家畜葡萄球菌、中间葡萄球菌、克氏葡萄球菌、缓慢葡萄球菌、家蝇葡萄球菌、巴士德葡萄球菌、鱼发酵葡萄球菌、松鼠葡萄球菌和小牛葡萄球菌。 葡萄球菌直径为0.5～1.5μm，无动力、无芽胞、一般不形成荚膜。葡萄球菌在普通培养基生长良好，多数为需氧或兼性厌氧菌，生长最适宜的温度为30～370C和最适pH4～7.5，但在6.5～400C和pH4.2～9.3均可生长。耐盐性较强，在含10～15%氯化钠培养基中仍能生长。 葡萄球菌的基因组包括一条约280Okb的环状染色体、前噬菌体、质粒和转座子。染色体和染色体外的遗传因子均有编码细菌毒力和对抗生素耐药的基因，这些基因可通过染色体外的遗传因子在葡萄球菌不同菌株之间传播，也可向其他革兰阳性球菌传播。 （一）分型可根据葡萄球菌表型特征如：噬菌体溶解、血清反应、生化反应和耐药谱等分型;目前主要根据DNA的特征用DNA指纹图谱、质粒指纹图谱、凝固酶基因型等方法分型。根据表型特征的分型方法与根据DNA特征的分型方法相结合对调查耐药菌流行特征、追踪感染源、传播途径、考察感染控制效果等方面有重要作用。 （二）葡萄球菌的毒力金葡菌致病性最强，主要与其产生各种毒素和酶以及某些细菌抗原有关。 1.毒素
金黄色葡萄球菌检验步骤
金黄色葡萄球菌检验步骤 一.设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃ 。 2 冰箱：2 ℃ ~5 ℃ 。 3 恒温水浴箱：37 ℃±1 ℃ 。 4 天平：感量0.19 。 5 均质器。 6 振荡器。 7 无菌吸管：1 mL （具0.01mL 刻度）、10mL （具0.lmL 刻度）或微量移液器及吸头。 8 无菌锥形瓶：容量100 mL 、500 mL 。 9 无菌培养皿：直径90 mm 。 10 注射器：0.5 mL 。 11 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。 二、培养基和试剂 1 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤 2、7.5%氯化钠肉汤 3 血琼脂平板 4 Baird - Parker 琼脂平板 5 脑心浸出液（BHI）肉汤 6 兔血浆 7 磷酸盐缓冲液 8 营养琼脂斜面 9 革兰氏染色液 10 无菌生理盐水：称取8.5g氯化钠溶于1 000 mL 蒸馏水中，121 ℃ 高压灭菌15 min 。 11 1 mol/L 氢氧化钠（NaOH ) ：称取40g 氢氧化钠（NaOH ）溶于1 000 mL 蒸馏水中。 12 1 mol/L 盐酸（HCL ) : 37 ％浓盐酸90 mL ，加蒸馏水到1 000 mL 。
操作步骤 5.1 样品的稀释 5.1.1 固体和半固体样品：称取25g 样品至盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min~10 000r/min 均质1 min~2 min ，或放人盛有225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min ~2 min ，制成1 : 10 的样品匀液。 5.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品至盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1 : 10 的样品匀液。 5.2 增菌和分离培养 5.2.1 增菌培养：吸取5 mL 上述样品匀液，接种于50 mL 7.5 ％氯化钠肉汤或10 ％氯化钠胰酪胨大豆肉汤培养基内，36 ℃±1 ℃培养18h ~24h 。金黄色葡萄球菌在7.5 ％氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严重时在10 ％氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。 5.2.2 将上述培养物，分别划线接种到Baird -Parker 平板和血平板，血平板36 ℃±1 ℃培养18h~24h 。Baird-Parker 平板36℃±1 ℃培养18h ~ 24h 或45h ~ 48h 。 5.2.3 金黄色葡萄球菌在Baird-Parker 平板上，菌落直径为2 mm~3 mm ，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落，但无浑浊带及透明圈。菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。 5.2.4 形态：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为0.5um~1um。 5.3 血浆凝固酶试验 5.3.1 挑取Baird - Parker 平板或血平板上可疑菌落1 个或以上，分别接种到5 mL BHI 和营养琼脂斜面，36℃±l℃培养18h~24h 。 5.3.2 取新鲜配制兔血浆0.5 mL ，放人小试管中，再加人5.3.1 BHI 培养物0.2 mL~0.3 mL ，振荡摇匀，置36 ℃±1 ℃温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6h ，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。5.3.3 结果如可疑，挑取营养琼脂斜面的菌落到5 mL BHI , 36 ℃±1 ℃培养18h~48h ，重复5.3.2 。 5.4 葡萄球菌肠毒素的检测 可疑食物中毒样品或产生葡萄球菌肠毒素的金黄色葡萄球菌菌株的鉴定，应按附录 B 检测葡萄球菌肠毒素。 6 结果与报告 6.1 结果判定：符合5.2.3、5.2.4、血浆凝固酶试验阳性，可判定为金黄色葡萄球菌。 6.2 结果报告：在25g（或25ml）样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。
金黄色葡萄球菌及检验
金黄色葡萄球菌及检验 一、生物学特性 典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8μm左右，显微镜下排列成葡萄串状。金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37°C，最适生长pH 7.4。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1-2mm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10- 15%NaCl肉汤中生长。可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红反应阳性，VP反应弱阳性。许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感。 二.流行病学 金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。因而，食品受其污染的机会很多。近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占45%，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。金黄色葡萄球菌的流行病学一般有如下特点： 季节分布，多见于春夏季；中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。上呼吸道感染患者鼻腔带菌率83%，所以人畜化脓性感染部位常成为污染源。一般说，金黄色葡萄球菌可通过以下途径污染食品： 食品加工人员、炊事员或销售人员带菌，造成食品污染；食品在加工前本身带菌，或在加工过程中受到了污染，产生了肠毒素，引起食物中毒；熟食制品包装不严，运输过程受到污染；奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时，对肉体其他部位的污染。 肠毒素形成条件： 存放温度，在37°C内，温度越高，产毒时间越短； 存放地点，通风不良氧分压低易形成肠毒素； 食物种类，含蛋白质丰富，水分多，同时含一定量淀粉的食物，肠毒素易生成。 三.致病性 金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：a.溶血毒素：外毒素，分α、β、γ、δ四种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死；b.杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞；c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关；d.脱氧核糖核酸
葡萄球菌
葡萄球菌链球菌肺炎链球菌 形态结构属G+菌，无鞭毛，无芽孢，为需氧或兼性厌氧。【葡萄球菌的有毒株也没有荚膜，剩下二者的有毒株都有荚膜】 培养 特征 普通培养基中正常生长 血琼脂平板上可形成完 全透明的溶血环。普通培养基中不能生长。 【必须加入血液，组织液 及葡萄糖才可培养。】 血琼脂平板上形成三种不 同的溶血环，只有乙型的 溶血环才是致病性菌形成 的。 普通培养基中与葡萄球菌 类似的菌落。但因为会产生 自溶酶，故如果向培养基中 加入胆汁，会产生菌体自溶 现象，出现“脐状”菌落。 血琼脂平板上形成甲型溶 血环。 生化反应分解菊糖不分解菊糖，不被胆汁溶 解 分解菊糖，被胆汁溶解 抵抗 力 强于其他无芽孢菌种较弱较弱 免疫 力 不能获得牢固的免疫同型间可获得牢固的免疫建立较稳定的特异性免疫 首选药物对多种抗生素敏感首选青霉素G荚膜多糖菌苗首选青霉 素 致病物质葡萄球菌溶血素 凝固酶 杀白细胞素 肠毒素 表皮剥脱毒素 毒性休克综合症 链球菌溶血素 链激酶 链道酶 透明质酸酶 荚膜 致热外毒素 M蛋白 脂磷壁酸 肺炎链球菌溶血素 荚膜 紫癜因子 所致疾病一病原菌寄生造成的： 化脓性感染：疥 病原菌寄生造成的： 化脓性感染：局部感染如 中耳炎，和如淋巴管炎。 大叶性肺炎 所致疾病二毒素造成的： 食物中毒 烫伤样皮肤综合征 毒性休克综合征 致热外毒素：猩红热 所致疾病三葡萄球菌性肠炎（假膜 性肠炎）是菌群失调引 起的。 M蛋白造成的变态反应性 疾病：急性肾小球肾炎， 心肌炎，风湿热。以上三 种疾病都是由乙种链球菌 造成。 所致疾病四由甲种链球菌（条件致病菌）造成的亚急性细菌性心内膜炎。 微生 物学 肠毒素检测