分子克隆工具酶部分答案
分子克隆工具酶答案（选择和判断）
题1
关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有( )不太恰当。
B. 这一系统中的核酸酶都是Ⅱ类限制性内切核酸酶
题目2
Ⅱ型限制性内切核酸酶：( )
D. 限制性识别非甲基化的核苷酸序列
题目3
Ⅲ型限制性内切核酸酶：( )
E. 不同亚基的识别位点甲基化和限制活性相互排斥：MS亚基促使甲基化，R亚基促使限制
题目4
限制性片段长度多态性(RFLP)是：( )
E. 物种中的两个个体限制性图谱间的差别
题目5
下面有关限制酶的叙述哪些是不正确的?( )
E. 限制酶是外切酶而不是内切酶
题目6
因研究λ噬菌体的限制与修饰现象的本质而获得诺贝尔奖的科学家是：( )
C. WArber
题目7
第一个被分离的Ⅱ类酶是：( )
A. HindⅡ
题目8
双链DNA中一段自我互补的序列被称为回文序列，这种序列不具有下列特征：( )
B. 可增强基因的表达
题目9
在下列进行DNA部分酶切的条件中，控制那一项最好?( )
B. 酶量酶量
题目10
在下列试剂中，那一种可以螯合Ca2＋离子?( )
A. EGTA
题目11
在下列工具酶中，那一种可以被EGTA抑制活性?( )
C. Bal 31核酸酶
题目12
限制性内切核酸酶可以特异性地识别：( )
B. 双链DNA的特定碱基序列
题目13
限制性内切核酸酶的星号活性是指：( )
B. 在非常规条件下，识别和切割序列发生变化的活性。
题目14
下面哪一种不是产生星号活性的主要原因?( )
C. 酶切反应时酶浓度过低
题目15
关于回文序列，下列各项中，( )是不正确的
B. 是高度重复序列
题目16
关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有( )不太恰当
D. 这一系统中的核酸酶都是Ⅱ类限制性内切核酸酶
题目17
T4DNA连接酶是从T4噬菌体感染的E．coli中分离的，这种连接酶( ) B. 既能催化平末端连接又能催化黏性末端连接
题目18
DNA连接酶在体内的主要作用是在DNA复制、修复中封闭缺口，( )
A. 将双链DNA分子中的5，磷酸基团同3，-OH末端重新形成磷酸二酯键
题目19
在长模板链的指导下引物延伸合成长的DNA互补链时应选用( )
A. T7DNA聚合酶
题目20
末端转移酶是合成酶类，( )
D. 在C0 2＋的存在下，可以在3’突出末端延长DNA链
题目21
在基因工程中，可用碱性磷酸酶( )
B. 防止DNA的自身环化
题目22
从E．coli中分离的连接酶：( )
C. 需要NAD作辅助因子
题目23
下列酶中，除( )外都具有磷酸酶的活性
C. λ核酸外切酶
题目24
下列哪一种酶作用时需要引物? ( )
D. 反转录酶
题目25
S1核酸酶的功能是( )
B. 以上有两项是正确的
题目26
Klenow酶与DNA聚合酶相比，前者丧失了( )的活性
C. 5’-3’外切酶
题目27
用Bal31核酸酶作系列缺失突变时，( )
A. 需要Ca 2＋作辅助因子
题目28
在cDNA技术中，所形成的发夹环可用( )
A. 用S1核酸酶切除
题目29
可以在切口部位起作用的酶是( )
A. S1核酸酶
题目30
T4RNA连接酶：( )
A.作用时不需要模板
题目31
限制性内切核酸酶在DNA中的识别／切割位点的二级／三级结构也影响酶切效率。一般来说，完全切割质粒或病毒DNA，要比切割线状DNA需要更多的酶，最高的需要20倍。正确的答案是“对”。
题目32
限制与修饰现象是宿主的一种保护体系，它是通过对外源DNA的修饰和对自身DNA的限制实现的。
正确的答案是“错”。
题目33
如果限制性内切核酸酶的识别位点位于DNA分子的末端，那么接近末端的程度也影响切割，如HpaⅡ和MboI要求识别序列之前至少有一个碱基对存在才能切割。
正确的答案是“对”。
题目34
能够产生防御病毒侵染的限制性内切核酸酶的细菌，其本身的基因组中没有被该核酸酶识别的序列。
正确的答案是“错”。
题目35
已知某一内切核酸酶在一环状DNA上有3个切点，因此，用此酶切割该环状DNA,可得到3个片段
正确的答案是“对”。
题目36
迄今所发现的限制性内切核酸酶既能作用于双链DNA，又能作用于单链DNA
正确的答案是“错”。
题目37
基因工程中使用的Ⅱ类限制性内切核酸酶不仅有内切核酸酶的活性，而且有甲基化酶的活性
正确的答案是“错”。
题目38
甘油会使许多限制性内切核酸酶的特异性发生改变，是导致一些酶的星活性的主要原因之一，防止的办法是在酶切反应体系中，将甘油的浓度控制在5％以下。
正确的答案是“对”。
题目39
在限制与修饰系统中，修饰主要是甲基化作用，一旦位点被甲基化了，其他的限制性酶就不能切割了。
正确的答案是“错”。
题目40
T4DNA连接酶和E．coli连接酶都能催化平末端和黏性末端的连接。
正确的答案是“错”。
题目41
T4DNA连接酶和E．coli连接酶都能催化双链DNA和单链DNA的连接。
正确的答案是“错”。
题目42
Bal31核酸酶(Bal31nuclease)是Ca2+依赖性的，在反应混合物中加入EDTA便可抑制它的活性。
正确的答案是“错”。
题目43
T4DNA连接酶和E．coli连接酶作用时都需要A TP和NAD +作为辅助因子
正确的答案是“错”。
题目44
DNA聚合酶I有三种酶活性，其中3’-5’外切核酸酶的活性在较多的dNTP存在下，常被5’-3’合成酶的活性所掩盖。
正确的答案是“对”。
题目45
用同一种酶切割载体和外源DNA得到黏性末端后，为防止它们自身环化，要用CIP 将它们脱磷酸。
正确的答案是“错”。
基因工程中常用的三种工具酶
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease） 1．定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，也称为限制酶（restriction enzyme，RE）。 2．类型：来自原核生物，有三种类型。 Ⅰ型：兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性，随机切割。 Ⅱ型：大多能特异识别4～6个核苷酸序列（回文结构），最大识别序列为8个核苷酸，如SfiI、NotI；但有近10种Ⅱ型限制酶的识别序列为非回文结构，如SfaNI、MnlI等，Ⅱ型限制酶均可作为基因工程的工具酶。另有一些来源不同的限制酶的识别位点是相同的核苷酸序列，将这类酶特称为同工异源酶（isoschizomers）或同裂酶。同工异源酶切割产生相同的末端；有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，故可用来研究DNA 甲基化作用，如SmaI和XmaI；HpaII和MspI；MboI和Sau3AI是成对的同工异源酶；其中HpaII和MspI是一对同工异源酶，其识别位点是CCGG。与同工异源酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异，识别序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶（isocaudamers）。常用的限制酶BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。但必须指出，由两种同尾酶消化产生的粘性末端，重组之后所形成的序列结构再不能被原来的任何一种同尾酶所识别。 Ⅲ型：功能基本同Ⅰ型，但为特定位点切割。 三种限制酶的区别如下表所示： Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型 DNA底物dsDNA dsDNA dsDNA 辅助因子Mg2+,A TP,SAM Mg2+ Mg2+,A TP 识别序列特异特异特异 切割位点非特定（于识别序列前后100~1000bp范围之内）特定（切割于识别序列之中或近处，固定位点）特定（切割点在识别序列后25~75bp处） 与甲基化作用的关系内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用酶蛋白不具有甲基化作用内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用 3．命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株。另外用罗马数字代表同一菌株中不同限制酶的编号，现在常用来表示发现的先后次序。如HindⅢ是来自Haemophilus influenzae D（嗜血流感杆菌D 株第三种限制酶）。 4．切割位点和结果：限制酶位点在DNA链上是随机分布的，若识别位点为4bp，则44（256）个核苷酸可遇一个切点。若为6bp，则平均46（4096）个核苷酸才遇到一个切点。限制酶沿回文结构的对称轴切开，则产生平头末端（flush or blunt ends）如BalⅠ。多数限制酶错位
三四章分子克隆载体---答案_完_
第三章分子克隆载体（Molecular cloning vectors） 一、名词解析 1.质粒：质粒是染色体外的遗传因子，能进行自我复制（但依赖于宿主编码的 酶和蛋白质）；大多数为超螺旋的双链共价闭合环状DNA分子（covalently closed circle , cccDNA），少数为线性；大小一般为1～200Kb，有的更大。2.质粒拷贝数：质粒拷贝数(plasmid copy numbers)是指细胞中单一质粒的份数 同染色体数之比值,常用质粒数/每染色体来表示。不同的质粒在宿主细胞中的拷贝数不同。 3.质粒的不相容性：两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容 性，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及DNA 限制系统时出现的现象。 不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。 4.质粒的转移性：质粒具转移性。它是指在自然条件下，很多质粒可以通过称 为细菌接合的作用转移到新宿主内。它需要移动基因 mob ，转移基因 tra ，顺式因子 bom 及其内部的转移缺口位点 nic。 5.穿梭质粒：既能在真核细胞中繁殖又能在原核细胞中繁殖的载体。这类载体 必须既有细菌的复制原点或质粒的复制原点，又含有真核生物的复制原点，还具备酶切位点和合适的筛选指标。它用来转化细菌，又可以用于转化真核细胞。 6.α-互补：α-互补是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完 整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶（β -galactosidase ，由 1024 个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。α-互补是基于在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的 7.温和噬菌体：既能进入溶菌生命周期又能进入溶源生命周期的噬菌体。 8.溶源性细菌：具有一套完整的噬菌体基因组的细菌叫溶源性细菌。 9.整合：如果噬菌体的DNA是被包容在寄主细菌染色体DNA中，便叫做已整合 的噬菌体DNA。这中细菌提DNA组入细菌染色体DNA的过程，叫做噬菌体DNA 的整合或插入。 10.溶源化：用温和的噬菌体感染细菌培养物使之形成溶源性细菌的过程叫做溶 源化。
常用分子克隆实验方法
常用分子克隆实验方法I 一、植物总DNA的小量提取 方法1：提取吸附法。无须巯基乙醇、氯仿等有毒物质，产物无须Rnase处理。 (1)充分研磨。称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml溶液 A，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头将所有溶液移至1.5ml离心管 中，55℃水浴30min； (2) 高速离心去杂质。10,000rpm离心5min，取约600ul上清至新1.5ml离心管； (3) 核酸吸附。往上清液中加入1倍的异丙醇，轻轻混匀，再加入总体积1/4已混匀的 溶液B，静置3min; (4) 低速离心沉淀。5000rpm离心1min，轻轻倒掉上清，并用吸水纸轻吸离心管口， 再用移液枪吸走大部分残余液体； (5) 75%乙醇清洗。加入1ml75%乙醇，5000rpm离心30s，轻轻倒掉上清，用吸水纸稍 吸离心管口。重复该步骤一次，再5000rpm离心30s，然后用移液枪吸走管底的残 液，晾干5min； (6) 核酸洗脱。加入约55ul TE（PH8.0）至管底，轻轻重悬硅土，静置3min，10,000rpm 离心1min，用小枪头轻轻吸取出50ul管底溶液，冷藏。 方法2：CTAB法，此为在经典方法基础上，经过摸索改进，提高了得率，减少了污染。 (1)充分研磨。称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml CTAB 提取液，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头移至1.5ml离心管，65℃ 水浴30-60min。 (2) 氯仿抽提。10,000rpm离心3min，取约600ul上清。加入1倍的氯仿，轻轻混匀， 10,000rpm离心3min，取上清再抽提1遍。 (3) 核酸沉淀。加入预冷的1倍异丙醇或2倍乙醇，轻混匀，6000rpm离心3min，弃 上清。 (4) 清洗沉淀。轻加入1ml 75%乙醇，再吸掉上清，重复一次，倒置于吸水纸或横放于 离心管架上晾干5min。 (5) 溶解DNA。加50ul含Rnase A（约10ug/ml）的TE，常温下放置30min。取约3-5ul 电泳检测后，低温冷藏。
分子生物学基本工具-分子生物学-复习资料整理
第二章分子生物学基本工具 第一节基因操作的工具酶 【限制性核酸内切酶】是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。切开的是3，5－磷酸二酯键。 【限制性核酸内切酶的命名】 1.寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜体字母的略语表示酶来源的 菌种名称，如大肠杆菌Escherichia coli表示为Eco； 2.用一个正体字母表示菌株的类型，比如Eco R、Hin d； 3.如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则用罗马数字标出，比如Eco R I、Hin d III。 【II型限制性核酸内切酶的基本特点】 1.识别位点的特异性：每种酶都有其特定的DNA识别位点，通常是由4～8个核苷酸组成 的特定序列（靶序列）。 2.识别序列的对称性：靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文 结构。 3.切割位点的规范性：交错切或对称切（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。 【粘性末端】是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。 【平末端】在识别序列对称处同时切开DNA分子两条链，产生的平齐末端结构，不易于重新环化。 【同裂酶】能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同来源的内切酶。不同同裂酶对位点的甲基化敏感性有差别。 【同尾酶】识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的一类限制性核酸内切酶。 **由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的任一种所识别。
【一个限制酶单位（U）】在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为37℃）下，1h内中完全降解1μgλDNA所需要的酶量。 【DNA连接酶作用的特点】 1.连接的两条链必须分别具有自由3’－OH和5’－P，而且这两个基团彼此相邻，因此 不能封闭gap(缺口)，只能封闭nick(缺刻)。 2.在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程。 3.不能将两条单链连接起来或使单链环化起来。 【常见DNA连接酶】 ? E.coli DNA连接酶：连接具互补碱基黏性末端(最初研究表明），现在研究可连接平末 端；需NAD+辅助因子，活性低，不常用。 ?T4 DNA连接酶－连接具互补碱基黏性末端和平末端，需ATP辅助因子，活性高，常用。 【DNA连接酶的作用机制】 1.E(酶)＋ATP→E－AMP＋ppi E(酶)＋NAD→E－AMP＋NMN 2.E－AMP ＋DNA＝DNA－AMP＋E 3.DNA上的3’－OH对被活化的磷原子进行亲核攻击，形成磷酸二酯键，同时释放出AMP。 【衔接物/接头】由人工化学合成的一段10-12个核苷酸组成，具有有1个或几个限制性酶切位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。 【末端转移酶】是一类不依赖于DNA模板的DNA聚合酶。 特性：该类酶可以在没有模板链存在的情况下，将核苷酸连接到dsDNA或ssDNA的在3’－OH。特别是对于平末端的双链DNA末端加尾十分有用。 最常见的用途：给外源DNA片段及载体分子加上互补的同聚物尾巴，以创造黏性末端，便于重组。 第三节克隆载体 【克隆载体的定义】通过不同途径将承载的外源DNA片段（基因）带入受体细胞且能在其中维持的DNA分子。也称DNA克隆载体。 【克隆载体必备条件】 1.克隆位点(一个或多个) 2.能携带外源DNA片段进入受体细胞，能自我复制或整入染色体随受体细胞DNA复制而复 制。 3.有选择克隆子的标记基因 4.安全性(不含损害受体的基因，不任意转入别的，尤其人的细胞) 【质粒载体的生物学特性】 1.质粒是独立于染色体以外的能自主复制的裸露的双链环状（少数为线性和RNA）DNA分
分子克隆工具酶部分答案
分子克隆工具酶答案（选择和判断） 题1 关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有( )不太恰当。 B. 这一系统中的核酸酶都是Ⅱ类限制性内切核酸酶 题目2 Ⅱ型限制性内切核酸酶：( ) D. 限制性识别非甲基化的核苷酸序列 题目3 Ⅲ型限制性内切核酸酶：( ) E. 不同亚基的识别位点甲基化和限制活性相互排斥：MS亚基促使甲基化，R亚基促使限制 题目4 限制性片段长度多态性(RFLP)是：( ) E. 物种中的两个个体限制性图谱间的差别 题目5 下面有关限制酶的叙述哪些是不正确的?( ) E. 限制酶是外切酶而不是内切酶 题目6 因研究λ噬菌体的限制与修饰现象的本质而获得诺贝尔奖的科学家是：( ) C. WArber 题目7 第一个被分离的Ⅱ类酶是：( ) A. HindⅡ 题目8 双链DNA中一段自我互补的序列被称为回文序列，这种序列不具有下列特征：( ) B. 可增强基因的表达 题目9 在下列进行DNA部分酶切的条件中，控制那一项最好?( ) B. 酶量酶量 题目10 在下列试剂中，那一种可以螯合Ca2＋离子?( ) A. EGTA 题目11
在下列工具酶中，那一种可以被EGTA抑制活性?( ) C. Bal 31核酸酶 题目12 限制性内切核酸酶可以特异性地识别：( ) B. 双链DNA的特定碱基序列 题目13 限制性内切核酸酶的星号活性是指：( ) B. 在非常规条件下，识别和切割序列发生变化的活性。 题目14 下面哪一种不是产生星号活性的主要原因?( ) C. 酶切反应时酶浓度过低 题目15 关于回文序列，下列各项中，( )是不正确的 B. 是高度重复序列 题目16 关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有( )不太恰当 D. 这一系统中的核酸酶都是Ⅱ类限制性内切核酸酶 题目17 T4DNA连接酶是从T4噬菌体感染的E．coli中分离的，这种连接酶( ) B. 既能催化平末端连接又能催化黏性末端连接 题目18 DNA连接酶在体内的主要作用是在DNA复制、修复中封闭缺口，( ) A. 将双链DNA分子中的5，磷酸基团同3，-OH末端重新形成磷酸二酯键 题目19 在长模板链的指导下引物延伸合成长的DNA互补链时应选用( ) A. T7DNA聚合酶 题目20 末端转移酶是合成酶类，( ) D. 在C0 2＋的存在下，可以在3’突出末端延长DNA链 题目21 在基因工程中，可用碱性磷酸酶( ) B. 防止DNA的自身环化 题目22
第二章_基因工程中常用的工具酶
第二章基因工程中常用的工具酶 限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。 §2-1 核酸内切限制酶 定义：核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。 到目前为止已经从许多种不同的微生物中分离出了2300种以上不同的核酸内切限制酶。核酸内切限制酶的发现及其生物功能（图） 一、限制修饰系统的种类（图） 二、限制性内切酶的定义、命名 1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II型限制酶。 2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。 例如：Hin dⅢ前三个字母来自于菌种名称H. influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。 Eco RI—Escherichia coli RI Hin dⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ Sac I (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ) 三、Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶的缺点 a.Ⅰ型核酸内切限制酶虽然能够识别DNA分子中的特定序列，但它们的切割作用却是 随机的，在距特异性位点至少1000bp的地方可以随机地切割DNA分子，因此这类酶在基因克隆中显然是没有用处的。——远距离随机切割 b. Ⅲ型核酸内切限制酶大约从距离识别序列25bp处切割DNA分子。——远距离定点 切割 c.Ⅰ型核酸内切限制酶和Ⅲ型核酸内切限制酶，在切割反应过程中，都会沿着DNA分 子移动，因此是一种需要能量的过程。——需要能量的反应 d.Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶，一般都是大型的多亚基的复合物，既具有内切酶活性， 又具有甲基化酶活性。——内切酶活性和甲基化酶活性 四、Ⅱ型核酸内切限制酶的特点 (1)基本特点： ①在双链DNA分子上有一个特殊的靶子序列，即所谓的识别序列，并由此切割DNA 分子形成链的断裂；——识别序列 ②2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的；——单链切割
分子克隆载体
分子克隆载体（vector） 载体（vector）是指运载外源DNA有效进入受体细胞内的工具。载体同外源DNA在体外重组成DNA 重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。重组DNA 技术中最常用的载体有质粒、噬菌体λ，柯斯质粒（cosmid）和噬菌体M13。 载体（vector）是指运载外源DNA有效进入受体细胞内的工具。载体同外源DNA在体外重组成DNA重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。因此，作为载体应该满足以下几方面的要求：①有某种限制酶的一个切点，最好是有许多种限制酶的切点，而且每种酶的切点只有一个；②外源DNA插入后不影响载体在受体细胞中进行自我复制，载体应对受体细胞无害，以及载体能接纳尽可能大的外源DNA片段；③有利于选择的标记基因，可以很方便地知道外源DNA已经插入，以及把接受了载体的受体细胞选出；④具有促进外源DNA表达的调控区。 重组DNA技术中最常用的载体有质粒、噬菌体λ，柯斯质粒（cosmid）和噬菌体M13。它们的受体细胞都是大肠杆菌。这四种载体的大小和结构尽管各不相同，但它们的共同特点是：①都能在大肠杆菌中自主复制，而且能连同所带的外源DNA一起复制；②都很容易同细菌DNA分开并加以纯化；③都有一段DNA对于它们自身在细菌中的增殖不是必需的。因此，外源DNA可以插入这一段DNA中，或是置换这一段DNA而不影响载体的复制。根据这一特点，载体又可分成插入型和置换型两大类。 质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可整合到细菌染色体DNA中，随着染色体DNA的复制而复制。 载体可以分为：克隆载体、表达载体及穿梭载体。 1.克隆载体(cloning vector):通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。将重组后的载体引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中大量繁殖。常见的载体有质粒，噬菌粒，酵母人工染色体。 对载体的要求一种用作克隆载体的理想质粒一般具备下述特点：①具有松驰型复制子（如ColE1），复制子（replicon）是质粒自我增殖所必不可少的基本条件，并可协助维持使每个细胞含有一定数量的质粒拷贝。②在复制子外存在几个单一的酶切位点（或多克隆位点），以便目的DNA片段插入。③具有插入失活的筛选标记，理想的质粒载体应具有两种抗菌素抗性标志，如氨苄青霉素抗性基因（Amp r）和四环素抗性基因（Tet r）等，以便从
分子生物学实验讲义
分子生物学实验讲义 掌握质粒DNA小量快速提取法；了解DNA限制性核酸内切酶酶切鉴定原理。 质粒( plasmid )是一种染色体外的稳定遗传因子。其分子量大小在1－200kb 之间。是具有双链闭合环状结构的DNA分子，质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌 细胞中，具有自主 复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。质粒一 般独立游离在细胞质内，也可整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控 制的许多生物学功能却赋予宿主细胞某些表型。 所有分离质粒DNA勺方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌； 分离和纯化质粒DNA采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠 Sodium dodecyl sulfate, SDS )可使细胞壁裂解。细菌经溶菌酶和阴离子去污剂( SDS处理 后，细菌DNA 缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液 中。再经酒精沉淀、洗涤处理，可得到质粒DNA。 共价闭环DNA( covalently closed circular DNA ，简称cccDNA 质粒以超螺旋形式存在。若两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型
的DNA分子叫作开环DNA( open circular DNA, 简称ocDNA。在电泳时，同一 质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度都快，因此在本 实验中，质粒DNA在 电泳凝胶中呈现 3 条区带。 限制性内切酶是分子生物学研究中的一种工具酶，这类酶的特点是具有能够识别双链 DNA分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断 DNA的双链，形成一定长度的DNA片段。如：EcoRI和Hi nd?的识别序列和切口是: EcoR?：G?AATTC Hind?：A?AGCTT 限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少酶切片段，因此鉴定 酶切后的 片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大 致判断酶切片 段大小的差别。用已知分子量的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，就 可以粗略推测 分子形状相同的未知DNA勺分子量。 1．主要设备(Equipments) 1) 塑料离心管1.5mL X 30 塑料离心管架X 1 微量加样器10卩L、100卩L、1 000 uL各一支 4) 常用玻璃仪器及滴管等 5) 台式高速离心机( 16 000r/min ) 6) 电泳仪
分子克隆之载体构建完整步骤
分子克隆之载体构建完整步骤 一、目的片段的扩增和酶切 PCR反应的基本成分包括：模板DNA(逆转录所得cDNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液及水。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的高温变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的低温退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：DNA模板--引物结合物在。 准备： A.模板DNA：质粒DNA，逆转录cDNA或挑菌落 B.引物配制： a)存储液100uM：公司合成的引物干粉，13000rpm离心2min，加入管壁 nmol数x10ul的ddH2O振荡充分溶解。 b)工作液10uM：上下游引物存储液各10ul加80ul ddH2O混匀配制100ul 工作液。终浓度200-400nM。 1. PCR反应体系(50ul) Taq酶体系：Thermo 10x buffer （无Mg2+）5ul MgCl2（25mM）5ul dNTP （10mM）1ul 上下游引物工作液1ul 模板cDNA（质粒DNA 不超过100ng）2-4ul Taq DNA聚合酶0.5ul ddH2O 补充至50 ul 注：1. 其他体系如菌落PCR反应20ul按比例调整即可。2. 其他公司Taq酶或2x buffer mix已包含Taq酶、dNTPs时作相应调整。 PCR仪设置反应条件： 95℃ 5min 预变性 循环x30-35： 变性95℃ 30s 退火60℃ 30s （退火温度为引物Tm值-3~5℃） 延伸72℃ 60s （延伸时间根据产物长度：Taq酶效率约1kb/min）72℃ 7 min 补充延伸 4-10℃ 保温 高保真Pfu酶体系（优选）：Thermo
分子克隆技术
分子克隆技术
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克隆载体
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是用来在生物学寄主和试管间“传送”克隆的序 列的DNA分子 (如从细菌到试管再到植物细 胞)。 其共性有四点： 1. 启动自发复制的能力. 2. 含有遗传标记 (通常是显性的) 供选择。 3. 唯一的限切位点以利于克隆插入的DNA 4. 非必需DNA序列 尽可能少以克隆更大片 段。
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生
pBR322
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生
pBR322
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pBR322是4362bp的环状 双链DNA载体，有2个抗 药性基因（四环素和氨 苄青霉素），一个复制 起始点和多个用于克隆 的限制酶切点。当缺失 抗药性基因的大肠杆菌 被pBR322成功地转化 时，它便从该质粒获得 了抗生素抗性。两个抗 生素基因中均含供插入 外源DNA用的不同的单一 酶切位点。一般只选一 个抗生素基因作为插入 外源DNA之用。外源DNA 插入后该抗生素抗性失 活。另一抗生素抗性基 因则作为转化细菌后筛 选阳性克隆之用。
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四个重要位点
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负责质粒复制的rep复制子 (来自 pMB1; (2) 编码Rop 蛋白的rop基因，促进 不稳定的 RNA I – RNA II 复合体转变为 稳定的复合体并起着减少质粒拷贝数的 作用 (来自 pMB1); (3) 编码 beta-内酰胺 酶的bla基因，赋予对氨苄青霉素的抗性 (来自 Tn3转座子); (4) 编码四环素抗性蛋 白的tet基因 (来自 pSC101).
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分子生物学实验常用工具酶总结培训讲学
现代分子生物学实验手册 工具酶 基因工程：在人工可以控制条件下，将基因剪切或重新组合，再导入另一生物体内，使这些基因在其中表达并遗传下去的一门技术。核心：对基因进行人工切割、连接和重新组合，构建重组DNA。 工具酶：在基因工程的重组DNA过程中，所需要用到的酶的统称。 一、限制性内切酶（restriction endonuclease） 主要功能：对外源性的双链DNA进行切割、水解，不允许外源性DNA存在于细菌自身细胞内。（这种酶能对在自身细胞内存在的DNA种类给予限制——限制性内切酶） 限制-修饰系统：合成限制性内切酶的细胞，其自身的DNA不受酶的切割，这是因为细菌细胞还会合成一种修饰酶，可以对自身DNA进行修饰，即改变DNA原来具有的可以被限制性内切酶识别的核酸顺序结构，从而不被限制性内切酶识别及切割、水解。保护自身遗传物质稳定的机制。 限制性内切酶：从原核生物中发现的，约600种，可识别108种不同的特定DNA顺序。以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生DNA片段的5’端为P，3’端为- OH。 命名：获得该酶的细菌属名的第一个字母（大写）+该菌种名的前两个字母(小写)+株系的字母（小写）或数字+罗马数字（同一株菌种不同内切酶的编号）例： 细菌属名细菌种名菌株名称限制酶名称Arthrobacter luteus Alu I Escherichia coli RY13Eco R I Bacillus amyloliquefaciens H Ham H I Haemophilus influenzae Rd Hin d III （一）三种常用内切酶 1. I型限制性内切酶 同时兼有切割DNA的功能和修饰酶的修饰功能。 在酶的识别位点上，若DNA两条链菌没有发生甲基化，则行使内切酶的功能，对DNA进行切割，同时转变成ATP酶。若DNA双链中有一条链已发生甲基化，则此类酶显示修饰酶的作用，对另一条DNA进行甲基化修饰，然后在行切割功能。（实际上，有内切酶、修饰酶、ATP酶及解旋酶四种功能）I型限制性内切酶在DNA链上的识别位点和切割位点不一致，也不固定。没有时间应用价值。 【DNA甲基化：DNA化学修饰的一种形式，能在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现（外遗传机制）。多发生于CpG二核苷序列上（在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸中的胞嘧啶被选择性添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶）。甲基化位点可随DNA的复制而遗传（DNA复制后，甲基化酶可将新和成的未甲基化的位点进行甲基化）。DNA 甲基化可引起基因组中相应区域染色质结构变化，使DNA 失去限制性内切酶的切割位点，以及DNA 酶
分子生物学克隆表达常用载体序列
pcDNA3.1载体序列：5428bp GACGGA TCGGGAGA TCTCCCGA TCCCCTA TGGTGCACTCTCAGTACAA TCTGCTCTGA TGCCGCA TAGTTAAGCCAGTA TCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAG CAAAA TTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAA TTGCA TGAAGAA TCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGA TGTACGGGCCAGA TA TACGCGTTGACA TTGA TTA TTG ACTAGTTA TTAA TAGTAA TCAA TTACGGGGTCA TTAGTTCA TAGCCCA TA TA TGGAGTTCCGCGTTACA TAACTTACGGTAAA TGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCA TTGACG TCAA TAA TGACGTA TGTTCCCA TAGTAACGCCAA TAGGGACTTTCCA TTGACGTCAA TGGGTGGAGTA TTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACA TCAAGTGTA TCA TA TGCCAAGTACGCC CCCTA TTGACGTCAA TGACGGTAAA TGGCCCGCCTGGCA TTA TGCCCAGTACA TGACCTTA TGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACA TCTACGTA TTAGTCA TCGCTA TTACCA TGGTGA TGCGGTT TTGGCAGTACA TCAA TGGGCGTGGA TAGCGGTTTGACTCACGGGGA TTTCCAAGTCTCCACCCCA TTGACGTCAA TGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAA TCAACGGGACTTTCCAAAA TGTCG TAACAACTCCGCCCCA TTGACGCAAA TGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTA TA TAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTA TCGAAA TTAA TACGACT CACTA TAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGA TCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAA TTCTGCAGA TA TCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAG AGGGCCCGTTTAAACCCGCTGA TCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCA TCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAA T AAAA TGAGGAAA TTGCA TCGCA TTGTCTGAGTAGGTGTCA TTCTA TTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGA TTGGGAAGACAA TAGCAGGCA TGCTGGGGA TGCGGTG GGCTCTA TGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTA TCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCA TTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACT TGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAA TCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGA TTTAGTGCTTTACGGC ACCTCGACCCCAAAAAACTTGA TTAGGGTGA TGGTTCACGTAGTGGGCCA TCGCCCTGA TAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAA TAGTGGACTCTTGTTCCAAAC TGGAACAACACTCAACCCTA TCTCGGTCTA TTCTTTTGA TTTA TAAGGGA TTTTGCCGA TTTCGGCCTA TTGGTTAAAAAA TGAGCTGA TTTAACAAAAA TTTAACGCGAA TTAA TTCTGTGGAAT GTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTA TGCAAAGCA TGCA TCTCAA 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第二章 分子克隆工具酶题目
第二章分子克隆工具酶 一、选择题 1.有关基因工程的叙述正确的是（） A.限制性内切酶只在获得目的基因时才用 B.重组质粒的形成在细胞内完成 C.质粒都可作运载体 D.蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料 2.限制性内切酶EcoRⅠ在野生型的λ噬菌体DNA中有5个切点，Hind Ⅲ有7个切点。调 整这些酶切位点的数量，主要通过（）。 A.体内突变 B.完全酶切后连接 C.部分酶切 D.先用甲基化酶修饰后再酶切 二、填空题 1.如果用限制性内切核酸酶切割双链DNA产生5?突出的黏性末端，则可以用__________进行3?末端标记。如果用限制性内切核酸酶切割DNA产生的是3?突出的黏性末端，可以用__________________ 进行3?末端标记。 2.可用T4 DNA聚合酶进行平末端的DNA标记，因为这种酶具有____________和_______的活性。 三、判断题 1. pBR327是在pBR322的基础上去掉了1089bp的片段，留下了ampR和tetR的完整片段。pBR327比pBR322有更高的拷贝，每个细胞中含有30-45个拷贝。同时pBR327具有接合能力，能直接转入其他细胞（） 四、名词解释 1. DNA聚合酶 2. 限制性内切酶 3. 甲基化酶 4. T4-DNA连接酶 5. 核酸酶 6. Klenow酶 7. T4 DNA聚合酶 8. Taq DNA聚合酶 9. 逆转录酶10. 同裂酶 11. 核酶 五、简答题 1.限制性内切酶分为哪几大类，各有什么特点？ 2. DNA修饰酶主要有哪些，各有什么作用？ 3.简述Klenow聚合酶的用途。 4.比较E.coli DNA 连接酶和Taq DNA 连接酶的作用特点。