微生物的鉴定方法总结-2015.6.26

目录

1 微生物鉴定技术—传统方法 (1)

1.1 细菌微菌落技术 (1)

1.2 生理生化反应特征 (1)

1.3 生态学特征 (2)

1.4 血清学反应 (2)

1.5 选择、鉴定用培养基法 (3)

1.6 微量多项实验鉴定系统 (3)

2 微生物鉴别方法—新技术新方法 (3)

2.1 细胞壁组分分析 (3)

2.2 红外光谱IR (3)

2.3 气相色谱GC (4)

2.4 高效液相色谱HPLC (4)

2.5 质谱分析MS (4)

3 微生物鉴别方法—分子生物学方法 (4)

3.1分子生物学技术 (4)

3.2 PCR技术 (4)

3.3 基因探针技术 (4)

3.4 16SrDNA基因同源性分析 (5)

微生物的鉴定方法

1 微生物鉴定技术—传统方法

在传统的分类鉴定中，微生物分类鉴定的主要依据是形态学特征、生理生化反应特征、生态学特征以及血清学反应、对噬菌体的敏感性等。在鉴定时，我们把这些依据作为鉴定项目，进行一系列的观察和鉴定工作。

1.1 细菌微菌落技术

细菌的形态、大小、颜色及其它特征与细菌的基本生物学特性如代谢类型、分裂方式、繁殖速度等有密切关系。肉眼所见菌落，即大菌落是由大量的菌体紧密堆积而成，有不少生物学特性不能辨别；微菌落则是指细菌生长繁殖早期在固相载体上形成的只能借助显微镜进行观察的细菌集落。与大菌落相比，微菌落边缘及中央有明显不同的表形特征。可据此对微生物的种类进行鉴定。缺点：受操作人员主观性影响大。

（1）细胞形态

在显微镜下观察细胞外形大小、形状、排列等，细胞构造，革兰氏染色反应，能否运动、鞭毛着生部位和数目，有无芽孢和荚膜、芽孢的大小和位置，放线菌和真菌的繁殖器官的形状、构造，孢子的数目、形状、大小、颜色和表面特征等。（2）群体形态

群体形态通常是指以下情况的特征：在一定的固体培养基上生长的菌落特征，包括外形、大小、光泽、黏稠度、透明度、边缘、隆起情况、正反面颜色、质地、气味、是否分泌水溶性色素等；在一定的斜面培养基上生长的菌苔特征，包括生长程度、形状、边缘、隆起、颜色等；在半固体培养基上经穿刺接种后的生长情况；在液体培养基中生长情况，包括是否产生菌膜，均匀浑浊还是发生沉淀，有无气泡，培养基的颜色等。如是酵母菌，还要注意是成醭状、环状还是岛状。

1.2 生理生化反应特征

（1）利用物质的能力

包括对各种碳源利用的能力（能否以CO2为唯一碳源、各种糖类的利用情况等）、对各种氮源的利用能力（能否固氮、硝酸盐和铵盐利用情况等）、能源的要求（光能还是化能、氧化无机物还是氧化有机物等）、对生长因子的要求（是否需要生长因子以及需要什么生长因子等）。

（2）代谢产物的特殊性

这方面的鉴定项目非常多，如是否产生H2S、吲哚、CO2、醇、有机酸，能否还原硝酸盐，能否使牛奶凝固、冻化等。

（3）与温度和氧气的关系

测出适合某种微生物生长的温度范围以及它的最适生长温度、最低生长温度和最高生长温度。对氧气的关系，看它是好氧、微量好氧、兼性好氧、耐氧还是专性厌氧。

1.3 生态学特征

生态学特征主要包括它与其他生物之间的关系（是寄生还是共生，寄主范围以及致病的情况）。在自然界的分布情况（pH情况、水分程度等）、渗透压情况（是否耐高渗、是否有嗜盐性等）。

1.4 血清学反应

很多细菌有十分相似的外表结构（如鞭毛）或有作用相同的酶（如乳酸杆菌属内各种细菌都有乳酸脱氢酶）。虽然它们的蛋白质分子结构各异，但在普通技术下（如电子显微镜或生化反应），仍无法分辨它们。然而利用抗原与抗体的高度敏感特异性反应，就可用来鉴别相似的菌种，或对同种微生物分型。

用已知菌种、型或菌株制成的抗血清，与待鉴定的对象是否发生特异性的血清学反应来鉴定未知菌种、型或菌株。

该法常用于肠道菌、噬菌体和病毒的分类鉴定。利用此法，已将伤寒杆菌、肺炎链球菌等菌分成数十种菌型。

1.5 选择、鉴定用培养基法

在培养基中加入特异性的生化反应底物、抗体、荧光反应底物、酶反应底物等，可使目标培养物的选择、分离、鉴定一次性完成。如生物一梅里埃公司的BP+RPF(兔血浆+纤维蛋白原)培养基，可在24h内鉴定金黄色葡萄球菌。

1.6 微量多项实验鉴定系统

该系统的原理是根据微生物生理生化特征鉴定的结果，所进行的数码分类鉴定。它是针对微生物的生理生化特性，配制各种底物、培养基、试剂等，分别微量加入各个分隔室中，冷冻干燥脱水或不干燥脱水，各分室在同一塑料条或板上构成检测卡。在未知菌加入其中检测后，通过查检索表或直接输入计算机得到鉴定结果。最短甚至能在2-4h出结果。

微生物多项鉴定技术优点突出，能快速、敏感、准确、重复性好的鉴定微生物，缺点是各系统差异较大，有的价格昂贵，有的个别反应不准。但毫无疑问，它是微生物鉴定技术向快速、简易和自动化发展的重要方向之一。

2 微生物鉴别方法—新技术新方法

2.1 细胞壁组分分析

细胞壁组分分析首先应用于放线菌分类中，把它作为区分“属”的依据之一。它比单纯用形态进行分类更全面。近年来，有人对18个属的放线菌的细胞壁进行了分析，根据细胞壁的氨基酸组成，将其分为6个细胞壁类型，又根据细胞壁的糖的组成分成4个糖类型，在此基础上，结合形态特征提出了相应的科属检索表。

2.2 红外光谱IR

一般认为，每种物质的化学结构都有特定的红外光谱。若两个样品的吸收光谱完全相同，可以初步认为它们是同一种物质。因此，红外光谱技术被应用到微生物的分类中。它先后对芽孢杆菌、乳酸菌、大肠杆菌、酵母菌进行分类，近年来又应用于放线菌分类中。

根据有关学者的试验表明，这种方法简便快速，样品少，结果较好，不仅可

以初步了解各属菌的细胞成分的化学性质，同时也有助于微生物间系统发育关系的探索。但是它也有不足之处，借助于红外线光谱区分属内的种和菌株是困难的，但可以作为“属”的分类特征。

2.3 气相色谱GC

2.4 高效液相色谱HPLC

2.5 质谱分析MS

3 微生物鉴别方法—分子生物学方法

3.1分子生物学技术

以上几种都是应用细菌的表现特性(包括形态、生理、生化、血清等)进行鉴定。虽然这种方法很成功，但对十分相似的细菌却难以区别。进二十年来，核酸技术应用于分类鉴定已成为发展趋势。

3.2 PCR技术

PCR技术采用体外酶促反应合成特异性DNA片段，再通过扩增产物来识别细菌。由于PCR灵敏度高，理论上可以检出一个拷贝的基因，因此在细菌的检测中只需短时间增菌甚至不增菌，即可通过PCR进行筛选，节约了大量时问，但PCR 技术缺点：增菌培养基成分和其他微生物DNA对Taq酶具有作用，可能导致检验结果假阴性；微量的外源性DNA进入PCR后可以引起无限大产生假阳性结果；扩增过程中有一定的装配误差会对结果产生影响。

3.3 基因探针技术

基因探针技术利用具有同源性序列的核酸单链在适当条件下互补形成稳定的DNA RNA或DNA DNA链的原理，采用高度特异性基因片段制备基因探针来识别细菌。基因探针的优点是减少了基因片段长度多态性所需要分析的条带数。如法国生物一梅里埃公司的基因探针检测系统，30min完成微生物的确证试验，基因探针的缺点是不能鉴定目标菌以外的其他菌。

3.4 16SrDNA基因同源性分析

16S rDNA基因同源性分析是一种常用的细菌分子鉴定方法，16SrDNA基因的扩增需要细菌染色体DNA作为模板。目前建立了1种新的快速高效的细菌染色体DNA提取方法，整个提取过程仅耗时2min，从而使得细菌的快速鉴定成为可能。

当前制药企业中应有较多的是表型鉴定的一些系统，但随着现代科技的发展，微生物鉴定正经历由表现型向基因型鉴定转变的过程。近年来兴起的基因探针技术及全自动微生物检测系统，将从根本上改变微生物的检测方法，具有非常广阔的应用前景。

参考文献：

[1]陈艳.微生物鉴定方法的比较[J]-中国水产.2005(1).

[2]夏菠,周传云,张庆芬等.开菲尔中菌种分离与鉴定方法初探[C].2005.

[3]苏德模,马绪荣.药品微生物学检验技术.2007.01(1).

[4]吴清平,周艳红,蔡芷荷.卫生微生物特异性显色培养基的研究与应用[J].中

国卫生检验杂志,2005,15(1).