双脱氧法

双脱氧链终止法

概述：双脱氧链终止法是现在应用最多的核酸测序技术，由Sanger等1977年提出。主要用于DNA基因分析。

原理：核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。如此每管反应体系中便合成以共同引物为5'端，以双脱氧碱基为3'端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分四个泳道进行电泳。以分离长短不一的核酸片段(长度相邻者仅差一个碱基)，根据片段3'端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。

Sanger双脱氧链终止法(酶法)测序程序：（注：RNA部分不看）(一) Sanger双脱氧链终止法(酶法)测序程序操作程序是按DNA复制和RNA反转录的原理设计的。

1.分离待测核酸模板，模板可以是DNA，也可以是RNA，可以是双链，也可以是单链。

2.在4只试管中加入适当的引物、模板、4种dNTP(包括放射性标记的ddNTP，例如P ddNTP 和DNA聚合酶(如以RNA为模板，则用反转录酶)，再在上述4只管中分别加入一种一定浓度的ddNTP(双脱氧核苷酸)。

3.与单链模板(如以双链作模板，要作变性处理)结合的引物，在DNA聚合酶作用下从5'端向3'端进行延伸反应，32P随着引物延长掺入到新合成链中。当ddNTP掺入时，由于它在3'位置没有羟基，故不与下一个dNTP结合，从而使链延伸终止。ddNTP在不同位置掺入，因而产生一系列不同长度的新的DNA链。

4.用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳同时分离4只反应管中的反应产物，由于每一反应管中只加一种ddNTP(如ddATP)，则该管中各种长度的DNA都终止于该种碱基(如A)处。所以凝胶电泳中该泳道不同带的DNA 3' 末端都为同一种双脱氧碱基。

5.放射自显影。根据四泳道的编号和每个泳道中DNA带的位置直接从自显影图谱上读出与模板链互补的新链序列。

双脱氧法原理示意图：如下图

双脱氧测序的试剂及具体操作步骤

变性双链模板的制备：(1) 材料Tris/葡萄糖缓冲液(20mmol/L Tris-HCl pH8.0，10mmo1/L EDTA，50mmo1/L 葡萄糖)，1% SDS，0.2mo1/L NaOH，异丙醇，TE缓冲液pH8.0，4mol/L LiCl，冰冷70%和无水乙醇，2mol/L NaOH，2mmol/L EDTA。

(2) 配制方法

①取1.5ml处于对数生产期的培养菌液(含有待测病毒核酸的重组质粒模板)，离心除去上清液后，用150ml Tris/葡萄糖缓冲液重悬菌团，在室温下放置5分钟。

②加入300ml的1%SDS，0.2mol/L NaOH，颠倒混合约15次，在室温下放置15分钟，加入225ml 3mol/L醋酸钠(pH4.5)，颠倒约15次混合，在冰浴中放置45分钟，然后离心5分钟。

③将650ml上清液转移至一支新管中，加入650ml异丙醇，混合后在室温下放置10分钟，离心5分钟后弃去异丙醇，抽真空干燥沉淀。

④用125ml TE(pH 8.0)重新溶解DNA，加入375ml的4mol/L LiCl，在冰浴中放置20分钟后，于4℃下离心5分钟。

⑤将上清液转移至一支新管中用饱和苯酚抽提后再用氯仿抽提，加入2倍体积的异丙醇，在室温下沉淀30分钟，离心5分钟，弃去上清液。

⑥用冰冷的70%乙醇洗沉淀，离心5分钟，弃去上清液并干燥，用50ml TE缓冲液重新溶解沉淀。用紫外分光光度计测定质粒DNA含量。

⑦取0.2mg质粒DNA，并将体积调至9ml，加入1ml 2mol/L NaOH，2mmol/L EDTA，在室温下放置5分钟，加入2ml 30mol/L醋酸钠(pH 4.5)和8ml水。

⑧加入6ml冰冷无水乙醇，混合后在干冰/乙醇浴中放置15分钟，在4℃下离心5分钟，小心地弃去上清液，用冰冷的70%乙醇洗沉淀，离心5分钟并小心地弃去上清液，真空抽干沉淀，并用TE缓冲液重新溶解沉淀。

延伸和终止反应：以利用T7DNA聚合酶进行的双脱氧链终止反应为例。

(1) 材料变性的双链DNA模板(溶解在TE缓冲液中)，0.5pmol/mL寡核苷酸引物(溶解在TE中，-20℃贮存)，5×测序缓冲液(200mmol/L Tris pH7.5，50mmol/L MgCl2，-20℃贮存)，0.1mol/l DTT(当月新配-20℃贮存)，15pmol/L的3种dNTP混合物(缺dATP)，1 000至1 500Ci/mmol32p dATP(在-20℃下达4至6周)，修饰的T7 DNA聚合酶，标准酶稀释溶液(20mmol/L Tris-HCl pH7.5，0.5mg/mlBSA，10mmol/L- 巯基乙醇，4℃贮存)，终止混合物(表2-30)，甲酰胺上样缓冲液(0.2ml 0.5mol/LEDTA pH8.0，10mg溴酚蓝，10mg二甲苯青，10ml甲酰胺)。

T7DNA聚合酶终止反应混合物

反应成分ddG ddA ddT ddC 最终浓度

H2O 15 15 15 15 -

5×测序缓冲液6 6 6 6 - 1mmol/L

4dNTP 6 6 6 6 200μmol/L

1mmol/L ddGTP 3 - - - 20μmol/L

1mmol/L ddATP - 3 - - 20μmol/L

1mmol/L ddTTP - - 3 - 20μmol/L

1mmol/L ddCTP - - - 3 20μmol/L

(2) 配制方法

①取4支0.5ml小离心管，标上G、A、T、C，每管加入7ml变性的双链DNA模板(分别为1和2mg)，1ml寡核苷酸引物和2ml 5×测序缓冲液混合，65℃保温2分钟，在室温下冷却30分钟。

②每管加入1ml 0.1mol/L DTT，2ml 1.5mol/L 3种dNTP混合物，0.5ml32P dATP和

2ml(2IU)修饰的T7DNA多聚酶混合物，在室温下放置5分钟。

③按标记每管分别加入3ml 4种ddNTP终止混合物的一种。

④短促离心后，在37℃下保温5分钟。

⑤加入5ml甲酰胺上样缓冲液，上样前在80℃下加热2分钟，并迅速置于冰浴上，每个样品取3ml，上样电泳。

折叠测序反应物电泳和序列读取：(1) 按普通聚丙烯酰胺凝胶制作方法制作梯度胶。(2) 按G、A、T、C次序加入每种样品，在G、A和T各泳道上样1ml，而在C泳道上样1.5ml。(3) 上样完毕加压1700V电泳，根据样品中溴酚蓝和二甲苯青染料迁移情况确定电泳时间。(4) 电泳完毕，在10℃冰醋酸中漂洗30分钟脱去尿素。(5) 在60℃或80℃干燥30分钟后，放射自显影读取序列。

读取合成链的核苷酸序列时，应从下往上读取。因为电泳时是从上向下的，即上为负极，下为正极，DNA带负电，从负极向正极移动。其中，小片段DNA移动速度最快，距离正极的点样处最远。所以，应该从最小片段读起，即，从下向上读取。

而模板链则应该从上向下读取，并且转换为测序的核苷酸的互补的核苷酸。