基因工程的载体
第三章基因工程的载体
一、概述
二、质粒载体
三、表达载体
一、概述
?1 概念
?载体：携带外源目的基因或DNA片段进入宿主细胞进行复制和表达的工具称之为载体，化学本质是DNA分子。
?克隆载体：主要用来克隆和扩增DNA片段，能带动外源基因在宿主细胞中复制扩增。
?表达载体：除具有克隆载体的基本元件外，还具有转录、翻译所必需的DNA元件，使外源基因在宿主细胞中有效表达。
一、概述
?2 功能
?运送外源基因高效转入受体细胞；
?为外源基因提供复制能力和整合能力；?为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。
一、概述
?3 分类
?按来源分：质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、酵母人工染色体载体
?按功能和用途分：克隆载体和表达载体
?按性质分：融合型载体和非融合型载体
?按受体细胞分：原核细胞载体和真核细胞载体
一、概述
?4 特性
?载体能在宿主细胞内进行独立稳定的DNA自我复制；或整合到染色体DNA上，随着染色体DNA的复制而同步复制；在载体中插入外源基因后，仍然保持稳定的复制状态和遗传特性；?载体容易从宿主细胞中分离纯化；
?有限制性酶切的克隆位点，以便于目的基因的组装，即多克隆位点；
一、概述
?4 特性
?能赋予细胞特殊的遗传标记，以便于对导入的重组体进行鉴定和检测；
?载体在细胞内的拷贝数高，方便外源基因在细胞内大量扩增；
?载体在细胞内稳定性高，保证重组体稳定传代而不易丢失；
?用于表达目的基因的载体还应具有启动子、增强子
二、质粒载体
1、质粒的基本特性
2、常用的质粒载体
3、质粒DNA的提取
4、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
二、质粒载体
质粒载体是以质粒DNA分子为基础构建而成的基因载体，主要用于原核生物和真核生物的基因转移及建立基因组文库和cDNA文库。
1、质粒的基本特性
（1）概念
①染色体外的遗传因子，能进行自我复制（但
依赖于宿主编码的酶和蛋白质）；
②大多数为双链，闭环DNA分子，少数为线形；
③大小为1 kb-200 kb，也有更大的。
双螺旋共价闭合环（超螺旋）开环双螺旋（一
个裂口）
线状双螺旋
（两个裂口）
构型：共价闭合环状、开环和线性
（2）质粒的复制
﹡ 复制起始区：通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始
区。
﹡ 复制子有不同的组成方式：滚环、θ等；
﹡ 在E.coli中，使用的大多数载体都带有一个来源于pMB1质粒或ColE1质粒的复制子。
（3）拷贝数
严谨型：拷贝数较少，大约1-几个
松弛型：拷贝数较多，几十至几百
一些质粒载体所携带的复制子及拷贝数
质粒复制子拷贝数pBR322及其衍生质粒pMB1 15-20 pUC载体pMB1 500-700 pACYC及其衍生质粒p15A 10-12
（4）质粒的不相溶性
﹡ 两种质粒在同一宿主中不能共存的现象称为质粒的不相溶性。
﹡ 在第二个质粒导入后，在不涉及DNA限制系统时，不相溶的质粒一般为利用同一复制系统，质粒分配到子细胞时会发生竞争，随机挑选，最终放大。
（4）质粒的不相溶性
﹡ 不相溶群：指那些具有不相溶的质粒组成的一个群体，一般具有相同的复制子。
现已发现30多个不相溶群。
（5）转移性
﹡ 在自然条件下，很多质粒可以通过细菌接合的作用转移到新宿主内。
﹡ 要素：移动基因mob，转移基因tra，转移起始位点。
﹡ 例：pBR322有起始位点bom的nic位点，可在第三个质粒（如ColK）编码的转移蛋白质作用下，通过接合性质粒来进行转移，但大多数载体无
nic/bom位点（如pUC ）。
（6）选择标记
选择标记基因
用于鉴别目标DNA的存在，将成功转化了质粒的宿主挑选出来。
(1)氨苄青霉素抗性基因ampicillin,Amp r, amp r
青霉素抑制细菌细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合，抑制转肽反应并抑制其活性。
Amp r编码一个酶，可分泌进入细菌的周质区，并催化β-内酰胺环水解，从而解除氨苄青霉素的毒性。
（2）四环素抗性基因tetracycline,tet r
四环素与核糖体30 S亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。
tet r基因编码一个由399个aa组成的膜结合蛋白，可阻止四
环素进入细胞。
（3）氯霉素抗性基因chloramphenicol,Cm r, Cat
Cm与核糖体50 S亚基结合并抑制蛋白质合成。
Cat基因编码一个四聚体细胞质蛋白，每个亚基23 kDa。
氯霉素乙酰转移酶在乙酰辅酶A存在的条件下，催化氯霉
素羟乙酰氧基衍生物的形成，该产物不能与核糖体结合。
（4）卡那霉素和新霉素抗性基因kanamycin / neomycin 可与核糖体成分相结合并抑制蛋白质合成的脱氧链霉胺氨基糖苷。
这两种抗生素可被氨基糖苷磷酸转移酶(APH(3‘)-II)所灭
活，该酶为25 kDa ，似乎位于外周质腔，这些抗生素的磷酸化干扰了它们向细胞质内的主动转移。
基因工程载体
基因工程课程论文： 基因工程载体的探索 学号：A09120248 姓名：金文杰 班级：生技1203 任课教师：任桂萍
基因工程载体的探索 摘要基因工程是要按人们的意愿去有目的地改造，创建生物遗传性，因此其最基本的工程就是要得到目的基因或核酸序列的克隆。基因工程载体是基因工程所必需的工具，是能将分离或合成的基因导入细胞的DNA分子，有质粒DNA、病毒DNA、λ噬菌体的衍生物三种主要类型。植物、动物、微生物所用的质粒可能不同，在不同条件下所需的质粒也不同，所选用的质粒按需要选用。在基因操作过程中使用载体有两个用途：一是用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制。较常见的几种载体有：质粒pUC19、M13、科斯载体等。 关键词：载体、质粒、λ噬菌体、病毒DNA 一、理想载体要求： 对理想的基因工程载体一般至少有以下几点要求；能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力；容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好；容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制，这就要求载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位点，且每种酶的切位点最好只有一个；容易从宿主细胞中分离纯化出来，这才便于重组操作；有容易被识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。这才介于克隆操作。 二、常见质粒 1、质粒pUC19最常用的大肠杆菌克隆用质粒pUC19，此质粒的复制起点处序列经过改造，能高频率起动质粒复制，使一个细菌pUC19的拷贝数可达500-700个；质粒携带一个抗氨芐青霉素基因，编码能水解β-内酰胺环，从而被坏氨芐青霉素的酶，当用pUC19转化细菌后放入含氨芐青霉素的培养基中，凡不含pUC19者都不能生长，结果长出的细菌就是都含有pUC19的；pUC19还携带细菌lac操纵元中的lacI和lacZ基因编码，β-半乳糖苷酶N端状146个氨基酸的段落，当培养基中含有诱导物IPTG(isopropyl-thiogalactoside异丙基-硫代半乳糖苷)和Xgal(5-bromo-4- chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)时，lacZ ' 基因被诱导表达产生的β-半乳糖苷酶N端肽与宿主菌表达的C端肽互补而具有β-半乳糖苷酶活性（质粒和宿主编码的肽段各自都没有酶活性，两都融为一体而具酶活性，称为α-互补，α-complementation），半乳糖苷酶水解Xgal而使菌落呈现蓝色；在lacZ '中间又插入了一段人工设计合成的DNA序列，其中密集多个常用的限制性核酸内切酶的位点，使外来的基因和序列能很方便地被插入此位置，当外来序列插入后则破坏了lacZ '编码的半乳糖苷酶活性，生长的菌落就呈白色，这种颜色标志的变化就很容易区分和挑选含有和不含有插入序列或基因的转化菌落，称为蓝白筛选法。 根据用途可以对质粒进行改造，例如：根据鼠李糖乳杆菌D- ldhD-乳酸脱氢酶基因序列, 设计扩增同源臂 D1和 D2的引物,扩增同源臂D1的引物为 Lr-d1-H和 Lr-d1-X,扩增同源臂 D2的引物为Lr-d2-E和Lr-d2-A。分析载体pU C19-CM和D-ldh基因的序列,分别在引物Lr-d1-H和Lr-d1-X的5’端添加H ind 和Xho酶切位点;在引物 Lr-d2-E和Lr-d2-A 的5端添加 EcoR和Apa酶切位点。利用这2对引物扩增得到的同源臂分别插入到载体pUC19-CMHind和Xho酶切位点、EcoR和Apa酶切位点中,得到自杀质粒 pUC19-CM-D测序确定序列插入的正确性利用引物 Pkd3-cm-1和 Pkd3-cm-2从质粒pKD3上扩增到氯霉素抗性基因CM, 大小为1200bp。质粒 pUC19和基因CM分别经Pst和Sac内切酶处理后连接, 转入大肠杆菌 JM 109中,PCR酶切鉴定及测序结果表明基因 CM 正确插入到质粒 pU C19中, 载体 pU C19-CM 构建成功。由同源臂 D1引物 Lr-d1-H和Lr- d1-X扩增长约为180bp左右的基因片段,由同源臂 D2的引物Lr-d2-E和L r-d2-A 扩增出了约237 bp的基因片段。将2个同源臂片段和 pUC19-CM 载体经酶切处理连接后, 转化至大肠杆菌 JM 109中,PCR酶切鉴
基因工程载体
第三章基因工程载体 体外获得的任一DNA片段,必须插入到可以自我复制的载体内,再转入宿主细胞,才能得到复制和进行表达。基因工程载体(Vectors)就是携带外源基因进入受体细胞进行繁殖和表达的一种工具。 载体的功能 运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 基因工程中3种主要类型的载体： 1.质粒载体 2.噬菌体载体 3.柯斯质粒（cosmid）载体 基因工程对载体的要求 （1）在宿主细胞内能独立复制。 （2）有选择性标记。 （3）有一段多克隆位点。 外源DNA插入其中不影响载体的复制。 （4）分子量小，拷贝数多。 （5）容易从宿主细胞中分离纯化。 第一节质粒(plasmid)载体 质粒是一种独立于染色体外的双链闭环的DNA分子，具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。 (一)质粒的构形 环形双链的质粒DNA在提取过程中通常出现三种不同的构型： ①共价闭合环形DNA（cccDNA） ②开环DNA（open circular,ocDNA） ③线形DNA（linear,lDNA） （二）质粒的转移性指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。 接合型质粒：除了带有自我复制所必需的遗传信息外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。如：F质粒（性质粒或F因子）甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。不符合基因工程的安全要求。 非接合型质粒：带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因而不能从一个细胞转移到另一个细胞。如R质粒（抗性质粒）、Col质粒（细菌素质粒）。 符合基因工程的安全要求。 R质粒： 带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（resistance）。 Col质粒： 细菌素通过与敏感细菌细胞壁的结合作用，抑制一种或数种细胞生命过程。 带有控制大肠杆菌素（colicin）合成的基因。大肠杆菌素对不带Col质粒的大肠杆菌有毒。 Col质粒或R质粒如果带有转移基因，也可以成为接合型质粒。 某些非接合型质粒（Col E1）在接合型质粒的存在和协助下也能DNA转移，这个过程由bom和mob基因决定。 （三）质粒的复制类型 1.严紧型质粒（stringent plasmid）低拷贝数，有1~3份的拷贝；（接合型质粒分子量大，一般属严紧型） 2.松弛型质粒（relaxed plasmid）高拷贝数，10~200份拷贝。（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型） 松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白质合成的控制，因此，当用蛋白质合成抑制剂氯霉素（Cml）处理寄主细胞，使大肠杆菌染色体DNA复制受阻时，松弛型质粒DNA仍可继续扩增（氯霉素抗性质粒例外）。而严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合成的严格限制，其拷贝数不能通过用氯霉素来增加，对于有剂量限制的基因克隆需要使用低拷贝数的质粒载体。
基因工程知识点全
第一章基因工程概述 1?什么是基因工程，基因工程的基本流程？ 基因工程（Genetic engineering ）原称遗传工程。从狭义上讲，基因工程是指将一种或多 种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。因此，供体、受体和载体称为基因工程的三大 要素。 1. 分离目的基因 2?限制酶切目的基因与载体 3. 目的基因和载体DNA在体外连接 4?将重组DNA分子转入合适的宿主细胞，进行扩增培养 5. 选择、筛选含目的基因的克隆 6. 培养、观察目的基因的表达 第二章基因工程的载体和工具酶 1. 基因工程载体必须满足哪些基本条件？ 具有对受体细胞的可转移性或亲和性。 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。 具有合适的筛选标记。 分子量小，拷贝数多。具有安全性。 2. 质粒载体有什么特征，有哪些主要类型？ 1、自主复制性 2、可扩增性 3、可转移性 4、不相容性 主要类型有1.克隆质粒2.测序质粒3.整合质粒4.穿梭质粒5.探针质粒6.表达质粒 3. 质粒的构建 （1）删除不必要的DNA区域，尽量缩小质粒的分子量，以提高外源DNA片段的装载量。一般来说，大于20Kb的质粒很难导入受体细胞，而且极不稳定。 （2）灭活某些质粒的编码基因，如促进质粒在细菌种间转移的mob基因，杜绝重组质粒扩 散污染环境，保证DNA重组实验的安全，同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因，提高质粒的拷贝数 （3 ）加入易于识别的选择标记基因，最好是双重或多重标记，便于检测含有重组质粒的受体细胞。（4）在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的DNA序列，即多 克隆接头（Polylinker ），便于多种外源基因的重组，同时删除重复的酶切位点，使其单一化，以便环状质粒分子经酶处理后，只在一处断裂，保证外源基因的准确插入。 （5 ）根据外源基因克隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达调控元件。 4. 什么是人工染色体载体？ 将细菌接合因子、酵母或人类染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体 5. 什么是穿梭载体？ 人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和 复制的载体。 6. 入-噬菌体载体及构建 hDNA为线状双链DNA分子，长度为48.5kb，在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端。 1缩短长度提高外源DNA片段的有效装载量删除重复的酶切位点 引入单一的多酶切位点接头序列，增加外源DNA片段克隆的可操作性 灭活某些与裂解周期有关基因。 使入-DNA载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌，以避免可能出现的污染现 象的发生。加装选择标记，便于重组体的检测 7. M13单链噬菌体DNA载体
基因工程复习题及解答
1基因工程的基本步骤，其特点是什么? 狭义基因工程的基本五步：切、接、转、增、检。 a.从供体中分离出基因组DNA ，用限制性内切酶分别将外源DNA和载体分子切开。 b.接，用DNA连接酶含有外源基因的DNA片段接到载体分子上，构成DNA重组分子。 c.转，借助细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中。 d.增，短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中。 e.检，筛选和鉴定经转化处理的细胞，获得外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞。 2基因工程的基本原理 a．利用载体DNA在受体细胞中独立于染色体DNA而自主复制的特性，将外源基因育载体重组，通过载体分子的扩增提高外源基因在受体细胞中拷贝数，以提高其宏观表达水平。涉及到DNA分子高拷贝复制以及稳定遗传的分子遗传的遗传学原理。 b．筛选、修饰、重组启动子、增强子、操作子和终止子等基因转录调控原件，并将这些原件与外源基因精确剪切，通过强化外源基因的转录水平而提高其表达水平。 c．选择、修饰、重组核糖体结合位点及密码子等mRNA的翻译调控后原件，强化受体细胞中目标蛋白的生物合成过程。（以上两步涉及基因表达调控的分子生物学原理。） d．在强化并维持基因工程菌（细胞）最佳生产效能的基础上，从工程菌大规模培养的工程和工艺角度切入，合理控制微生物反应器的增值熟读和最终数量，也是提高外源基因表达产物产量的重要环节。 3基因工程中载体的功能是什么？一个理想的载体具有哪些特征？ (1).载体有三大功能：a.为外源基因提供进入受体细胞的转移能力。b.为外源基因提供在受体细胞中复制或整合能力。c.为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力。 (2).理想载体所具有的4个特点：a.具有对受体细胞的可转移性或亲和性，以提高载体导入受体入细胞的效率。b.具有与特定受体细胞相适应的复制位点和整合位点，使得外源基因在受体细胞中稳定的遗传。c.具有多种单一的核算内切酶识别切割位点，以便于外源基因的剪接插入。d.具有合适的选择性标记，以便于重组DNA分子的检测。 4在构建质粒载体时，质粒的基本特征中哪些被利用？哪些通常被除去？为什么？ （1）质粒的基本特征：a。自主复制性，质粒能够利用宿主细胞的DNA复制系统独立的复制并保持恒定遗传，由必要区和非必要区组成。必要区含复制相关的基因，决定质粒的存活与复制功能。非必要区主要含抗性、毒素分泌、复杂物质降解等性状的基因，影响细胞表型。 b.可扩增性，有有严谨型和松弛型两种复制形式。 c.不相容性，不同的质粒能稳定的存在同一受体细胞内称为质粒的不相容。 d.可传递性，质粒在一系列特定转移基因控制下，可以通过结合作用在宿主细胞间进行自然传递。 e.自带有遗传标记性状。 （2）理想的质粒载体所具有的特点：a.能高效的导入受体细胞。b.具有完整的复制子功能和整合位点，能在受体细胞中稳定的遗传。C.具有易被检测的合适的选择性标记。d.具有多种限制性内切酶的单一识别位点。e.具有尽可能小的分子质量。f.属于松弛型复制。g.属于非传递型质粒。 5.质粒载体构建的基本思路？ a.删除DNA非必要区域，尽量缩小质粒的相对分子质量，提高外源DNA片段的装载量。 b.灭活不需要的基因（如为提高拷贝数而灭活的质粒表达的负调控基因，为防重组质粒扩散污染而灭活mob基因。
基因工程载体的分类及其特性
基因工程载体的分类及其特性 田文晓 1343001125 按照来源和性质分类 1、质粒载体 ①复制：通常情况下一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区。 在不同的质粒中，复制起始区的组成方式不同，有的可决定复制的方式，例如滚环复制和θ复制；在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于 pMB1 质粒或 ColE1 质粒的复制起始位点。 ②拷贝数：质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。严谨型质粒每个细胞中拷贝数大约为1 ～几个； 松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。 ③不相容性：两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第二个质 粒导入后，在不涉及 DNA 限制系统时出现的现象。不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。 ④转移性：指在自然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到新宿主内。它需 要移动基因 mob ，转移基因 tra ，顺式因子 bom 及其内部的转移缺口位点 nic。 2、噬菌体载体（包括λ噬菌体、M13噬菌体载体） 1)λ噬菌体载体：大的外援插入片段在质粒中不稳定，转导是比转化效率更高的过程，避免出 现无插入片段的空载体。 2)M13噬菌体载体：可以对任意克隆基因进行DNA进行诱变，测序方便，可以制备单链测序模 板；含有噬菌体DNA的噬菌体颗粒从转化细胞中分泌出来后，可以在生长平板上收集。 ①超感染免疫性：溶原性细菌在被噬菌体感染并溶原化后，不会被同种噬菌体再次感染。 ②经过若干世代后，溶原性细菌会开始进入溶菌周期，即溶原性细菌的诱发。此时，原噬菌 体从宿主基因组上切离下来进行增殖。 3、粘粒载体（柯斯质粒） ①具有λ噬菌体的特性。柯斯质粒载体在克隆了合适长度的外源DNA，并在体外被包装成噬菌 体颗粒之后，可以高效地转导对λ噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。但该载体不包含λ噬菌体的全部必要基因，因此不能够通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒。
转基因工程复习题与答案
基因工程原理复习题思考题 1、基因工程的定义与特征。 2、试述基因工程的主要研究内容。 3、基因工程在食品工业上有何应用发展？ 4、转基因是一把双刃剑，请客观谈谈对转基因及转基因食品安全性的认识。 1、原核生物和真核生物的基因表达调控有何差别？ 2、什么是基因？根据基因的产物，基因可分为哪三类？ 3、引起核酸变性的因素主要有哪些？核酸变性后性质有何变化？ 4、DNA复性及其影响因素。 1，DNA凝胶电泳中核酸分子分离的机理。 2，DNA凝胶电泳中影响电泳迁移率的因素主要有哪些？ 3，PCR的原理和主要反应过程，并分析影响PCR扩增的影响因素。 4，PCR引物设计的原则，若给一指定DNA序列并需要通过PCR扩增此序列，如何设计扩增引物？ 5，定量PCR的原理？Ct值的含义。 6，分子杂交的类型主要有哪些？探针的标记方法与标记类型？常用的双链DNA的标记方法是哪两种？ 7，Southern杂交一般过程及影响杂交因素。 8，基因组文库的构建过程？如何确定文库的大小？ 9，基因文库的类型包括哪两种？各有什么特点？ 10，一般质粒DNA的构型有哪几种？在琼脂糖凝胶电泳中的有何特点？ 11，碱裂解法提取质粒DNA的原理，分析影响试验结果的各种可能因素。 12，电泳缓冲液使用一定时间后出现DNA在凝胶中跑不动现象的原因，有何解决办法？ 13，电泳的指示剂和染色剂有何区别，各自的作用是什么？ 1限制性核酸内切酶的类型，基因工程常用的是哪种限制性核酸内切酶？ 2什么是星活性，产生星活性的因素可能有哪些？ 3结合已做的实验，分析影响酶切的因素。 4限制性核酸内切酶命名规则及各字母代表的含义。 5简单叙述同尾酶和同裂酶的差别。 6连接酶主要有哪些类型？有何异同点？影响连接酶连接效果的因素主要有哪些？ 7试分析提高平端DNA连接效率的可能方法。 8基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？ 1、作为基因工程载体，其应具备哪些条件？ 2、质粒的不相容性及其分子机理。 3、载体的类型主要有哪些？在基因工程操作中如何选择载体？ 4、质粒转化原理，影响转化率的因素有哪些？ 5重组体分子的选择方法主要有哪些？并简单阐述其原理 1、基因的克隆方法主要有哪些？并阐述其克隆原理（至少3种，都是书上找的， 自选哈，建议必选DD RT-PCR和SSH，原因请看下题） 2、简单阐述差异显示PCR克隆基因的原理及其优缺点，有何应用？ 3抑制性差减杂交的原理与应用。
基因工程名词解释
名词解释一 RNase:RNA水解酶 Restriction endonucleasr：限制性核酸内切酶 RBS:核糖体结合位点 SD sequence：SD序列。可结合原核生物的核糖体。 Ori：复制起始原点 Promptor：启动子 Klenow fragment：大肠杆菌pol1的大片段 Reverse tranecriptase：反转录酶 Transferred DNA：转移DNA MCS（multiple cloning site）：多克隆位点 IPTG: 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 X-gal：5-溴4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 GUS：β-葡萄糖苷酸酶 X-gluc：5-溴4-氯-3-吲哚-β-D葡萄糖苷酸酯 Ampr（ampicillin resistance gene）：氨苄青霉素抗性基因 Cmr：氯霉素抗性基因 Tetr：四环素抗性基因 Kanr：卡那霉素抗性基因 Ermr:红霉素抗性基因 Neor:新霉素抗性基因 supF:琥珀突变抑制基因 phagemid：噬菌粒 plasmid：质粒 YAC ( yeast artificial chromosome)：酵母人工染色体 BAC(Bacterial Artificial Chromosome）：细菌人工染色体 PAC（P1 artificialchromosome）：P1人工染色体 TEL: 端粒重复序列 CEN:着丝粒 ARS: 自主复制序列 Cosmid：黏粒 PCR（Polymerase Chain Reaction）:聚合酶链式反应 dNTP:脱氧三磷酸核苷 RT-PCR:反转录(reverse transcriptase)PCR或实时定量(real-time)PCR DD(RT)-PCR:差异(反转录)显示PCR TAIL PCR：热不对称相错PCR RACE: cDNA末端的快速扩增 RAPD：随机扩增多态性DNA AFLP:扩增片段长度多态性 SSH：抑制性扣除杂交 FISH:荧光原位杂交 Vector:载体 Blunt end：平末端 Match end/cohesive end:匹配黏端/黏性末端