单克隆抗体糖基化修饰研究进展_王冲

蛋白质修饰位点预测详解

蛋白质修饰位点预测详 解 公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]

蛋白质修饰位点分析目录

（特别提示:ctrl+单击目录下的标题链接，可以跟踪标题；ctrl+单击标题后的图标 可以返回目录） 实验目的 找出“人类connexin43”蛋白质上面的所有可能磷酸化位点，并说明为什么（注释） 找出“人类血红蛋白”上面的糖基化位点，注释结果 实验平台 uniprot数据库: (查看蛋白的修饰情况) 预测未知蛋白磷酸化位点 DISPHOS: PhosphoSitePlus:

预测未知蛋白的糖基化修饰位点 N型糖基化位点预测： O型糖基化位点预测： 实验过程 一、“人类connexin43”蛋白质磷酸化位点修饰 1、“人类connexin43”蛋白质序列下载 蛋白序列： 2、uniprot数据库查看蛋白磷酸化位点 网站链接： 3、在线软件预测指定蛋白磷酸化位点 （1）DISPHOS 预测未知蛋白磷酸化位点 网站链接： 开始预测 结果

DISPHOS由蛋白序列预测蛋白磷酸修饰位点，总共有37个丝氨酸修饰位点，13个苏氨酸修饰位点，16个酪氨酸修饰位点。但是根据打分，只有8个丝氨酸修饰位点可能存在。 （2）PhosphoSitePlus预测指定蛋白磷酸化位点 网站链接： 开始预测 结果 筛选参考文献来源多于5篇的磷酸化修饰位点，丙氨酸磷酸化修饰位点数目为1、丝氨酸为17、苏氨酸数目为1、酪氨酸数目为7。 4、“人类connexin43”蛋白质磷酸修饰结论 在线数据库查询和在线软件预测结果基本一致，“人类connexin43”蛋白质磷酸位点数量相对一般蛋白质较多，且丝氨酸磷酸修饰位点最多。“人类connexin43”蛋白质极有可能是一种活性较高的蛋白质，与机体的生物活性显着相关。 通过各种文献阅读和网络筛选发现connexin43蛋白质是一种哺乳动物连接蛋白，是主要的细胞缝隙连接蛋白，其表达的异常与多种疾病的发生有关。 二、“人类血红蛋白”糖基化位点修饰 Ncbi下载人类血红蛋白的蛋白序列保存为：

蛋白质糖基化修饰研究进展

期末考核 课程：Glycobiology 蛋白质糖基化研究进展 姓名：马春 学号：2013113022 班级：生命科学与技术基地班 时间：2016.1.1

蛋白质糖基化研究进展 马春 （西北大学生命科学学院，陕西西安，710069） 摘要：糖基化修饰是生命活动中最广泛、最复杂、也是最重要的蛋白质翻译后修饰之一，不仅影响着蛋白质的空间构象、生物活性、运输和定位，而且在分子识别、细胞通信、信号转导等特定生物过程中发挥着至关重要的作用。本文综述了糖基化的分类、在生命体中的作用、糖基化位点分析及糖链分析方法等。 关键词：蛋白质糖基化;分析方法 生命体是一种极其复杂且动态变化的有机系统，不断发生着各种生物化学反应，进行新陈代谢，并协调、控制各部分生物功能的发挥。蛋白质是生命体内各种生化反应的载体和生物功能的执行者，如分子识别、信号转导、免疫应答等。蛋白质功能的正常发挥保证着生命有机系统正确、有序、高效地运转。基因在转录和翻译后产生具有特定序列的氨基酸长链，即蛋白质的前体，再经过共价修饰、折叠、卷曲并形成特定的空间构象后，成为具有正常功能的成熟蛋白质。而共价修饰在这个成熟过程中发挥着重要的调节作用。不仅如此，蛋白质成熟后的许多关键功能，特别是涉及控制、调节等方面的功能，都是通过共价修饰实现的。这些发挥重要功能的共价修饰，就是蛋白质翻译后修饰它们使蛋白质的结构更为合理、功能更为完善、调节更为精细、作用更为专一。翻译后修饰可以发生在蛋白质的任一位点上，并且种类繁多，目前有文献报道的翻译后修饰就多达数百种，常见的有碟酸 化修饰、糖基化修饰、乙醜化修饰等。 蛋白质糖基化修饰是最广泛、最复杂、最重要的翻译后修饰之一，据推断有超过的蛋白质都发生了糖基化修饰。这些糖蛋白广泛分布于生命体中，特别是在细胞膜上和体液中含量丰富，大部分膜蛋白和分泌蛋白都是糖蛋白。糖基化修饰不仅影响蛋白质的空间构象、生物活性、运输和定位，而且在分子识别、细胞通信、信号转导等特定生物过程中发挥着至关重要的作用。 1 糖基化类型 糖蛋白中的糖部分被称为聚糖。而己糖则是聚糖中最常见的组分。包括葡萄糖、半乳糖和甘露糖以及他们的一些简单修饰形式，如葡萄糖的α-羟基被酰化氨基取代生成N-乙酰葡糖胺。根据蛋白质被糖类修饰形式的不同可以把蛋白质糖基化分成以下四类： 1.2 N位糖基化 聚糖与天冬酰胺侧链的酰胺氮连接而修饰蛋白质。在动物细胞中，与天冬酰胺连接的糖，几乎都是N-乙酰葡糖胺，而且连接方式总是β构型。N 位糖基化根据其末端精细结构的不同又可分为高甘露糖型、复合型和杂合型。在N位糖基化中Asn-Xaa-Ser ／ Thr（Xaa 是除Pro外的任何氨基酸）被认为是N位糖基化的先决条件，不过少数情况下Asn-Xaa-Cys 序列也可以糖基化。 1.1 O位糖基化： 聚糖与丝氨酸或苏氨酸残基上的氧连接来修饰蛋白质。此糖基化多发生在临近脯氨酸的丝氨酸或苏氨酸残基上,但并没有发现特异的序列作为糖基化位点.O位多聚糖以逐步加接

(完整word版)蛋白质糖基化类型与点

1.2蛋白质糖基化类型与特点 蛋白质的糖基化是一种最常见的蛋白翻译后修饰,是在糖基转移酶作用下将糖类转移至蛋白质,和蛋白质上特殊的氨基酸残基形成糖苷键的过程。研究表明,70%人类蛋白包含一个或多个糖链,1%的人类基因组参与了糖链的合成和修饰。哺乳动物中蛋白质的糖基化类型可分为三种:N-糖基化、0-糖基化和GPI糖基磷脂酰肌醇锚。大多数糖蛋白质只含有一种糖基化类型,但是有些蛋白多肽同时连有N-糖链、O-糖链或糖氨聚糖。 (l) N-糖基化:糖链通过与蛋白质的天冬氨酸的自由NH 基共价连接,将这种 2 糖基化称为N-糖基化。N-连接的糖链合成起始于内质网(ER),完成于高尔基体。N-糖链合成的第一步是将一个14糖的核心寡聚糖添加到新形成多肽链的特征序列为Asn-X-Ser/Thr(X代表任何一种氨基酸)的天冬酰胺上,天冬酰胺作为糖链受体。核心寡聚糖是由两分子N-乙酰葡萄糖胺、九分子甘露糖和三分子葡萄糖依次组成,第一位N-乙酰葡萄糖胺与ER双脂层膜上的磷酸多萜醇的磷酸基结合,当ER膜上有新多肽合成时,整个糖链一起转移。寡聚糖转移到新生肽以后,在ER 中进一步加工,依次切除三分子葡萄糖和一分子甘露糖。在ER形成的糖蛋白具有相似的糖链,由Cis面进入高尔基体后,在各膜囊之间的转运过程中,原来糖链上的大部分甘露糖被切除,但又由多种糖基转移酶依次加上了不同类型的糖分子,形成了结构各异的寡糖链。血浆等体液中蛋白质多发生N-糖基化,因此N-糖蛋白又称为血浆型糖蛋白。 (2) O-糖基化:糖链与蛋白质的丝氨酸或苏氨酸的自由OH基共价连接。0-糖基化位点没有保守序列,糖链也没有固定的核心结构,组成既可是一个单糖,也可以是巨大的磺酸化多糖,因此与糖基化相比,0-糖基化分析会更加复杂。0-连接的糖基化在高尔基体中进行,通常第一个连接上去的糖单元是N-乙酰半乳糖,连

单克隆抗体药物研究新进展

单克隆抗体药物研究新进展 单克隆抗体药物，俗称“生物导弹”，是一种具备疾病治疗靶向性治疗的药物，该种药物针对一些对应疾病的治疗具备极强的治疗针对性，往往可以取得较为有效的治疗效果，其整体所占市场份额也比较大。该领域的药品已经慢慢成为一种治疗疾病的主流药物，随着相关研究人员的不断研究推进，其整体呈现一种不断拓宽化的发展。本文从单克隆抗体药物整体的市场情况、靶点及技术三个方面进行全面的研究探索。 标签：治疗性抗体；上市抗体药物；靶点；技术综述 抗体药物的第一次应用是于十九世纪，采用血清疗法针对患者进行相关治疗，在这个阶段人们对抗体药物的认知停留在使用有效的阶段；随着医疗实力的不断发展，直到1975年杂交瘤技术之后，才逐步实现了抗体的更为全面的认知及大规模量产的过程。现阶段随着社会的不断发展，疾病种类也越来越多，治疗起来也越来越麻烦，在这样一种大的背景下，单克隆抗体药物的全面研究和使用，有效的帮助患者进行疾病的靶向治疗和恢复。 一、抗体药物的市场情况 抗体药无是一种具备靶向性，能实现与靶抗原特异性结合来实现对疾病针对性治疗的药物，该种药物在进行使用的过程中，对患者的病症能做到针对性的治疗，具备治疗过程中的安全性治疗及快速准确性治疗。该种药物常常作用与一些恶性肿瘤及免疫性疾病的治疗。因为这些疾病都具备一定的治疗难度，故此药物的出现，可以有效的实现对症治疗，帮助患者进行相关疾病的缓解，因为这样的一种原因，导致在进行相关应用的过程中，该种药物得到了巨大的发展[1]。现阶段，单克隆抗体药物已经成为一种在市场上占据巨大份额的药物，其具备巨大的经济效益，同时帮助患者进行各种疾病的治疗和恢复，其整体已经成为针对疾病进行治疗的有效思路及理论。针对该种药物的扩展，主要是针对一些靶向性进行全面的研究，研究出新的靶点，制造出更多针对更多病症的单克隆抗体药物。 二、靶点研究进展 单克隆抗体药物具备一对一的治疗针对性，其靶点的把控是针对疾病治疗的重要点。世界范围之内，针对新靶点的研究如火如荼。针对热点靶点的研究，主要通过分析世界范围内患者的病症及发病几率进行全面的分类研究，研究出一些有效且具备普遍性的靶点，全面促进单克隆抗体药物的研究和发展。其现阶段世界主要研究靶点分以下几类。 （一）PD-1、PD-L1 PD-1是一种存在于T细胞表面的免疫抑制跨膜蛋白，主要针对癌症进行相关治疗，其主要作用有两点：1.针对慢性感染炎症进行相关限制；2.针对癌症中

平分型GlcNAc糖基化修饰的生物学功能

万方数据

万方数据

?１４０?董方，等．平分型Ｇ１ｃＮＡｃ糖基化修饰的生物学功能 蛋白分选的负性调节信号ｎ２１。 ３．３生殖发育调控 人类精子缺乏ＭＨＣＩ类分子，使其易于被ＮＫ细胞溶解。而ＭＨｃＩ阴性的肿瘤细胞通过在肿瘤细胞表面表达足量的平分型Ｎ一聚糖，而阻断ＮＫ细胞的溶解作用。因此，精细胞也可能通过同样的机翩选避ＮＫ的细胞溶解作用。利用超敏质谱仪对精细胞Ｎ一聚糖测序可以检测到３类Ｎ一聚糖：①高甘露糖塑；②二天线平分型；③以ｈｉｓｘ和ＩＪｅｗｉｓ丫作为终端修饰的二天线、三天线、四天线型。糖蛋白染色显示，携带呐穿列糖蛋白分布于顶体 莉不是位于浆膜；丽功能缺陷的精子则表现为抗娜抗体分布异常（图２）。推测惨饰聚糖可以 抑制生殖道内计对精子糖蛋白的抗原特异性免疫反嘘。嘲』ＩＩＩ匕，人类精子哟主要聚糖与先天性及获得性免疫反瘟哟抑制有关。这些结果支持哺乳类动物表邀碳水化合物与｜配子《耨删魄哆保护及人类在子宫棚哟发育有关。某些特殊类型的细胞表达特异性糖姐模式，惜此发挥相嘘睡句生物学功能‘引。 嘲２久类储子表达的主要Ｎ－聚糖 ｋ：高甘露糖型（Ｍａ呜９ｔｏｌ湖舢：）；瞻：：件有或不件 宥核心者澡糖者藻糖修饰哟平分型二天线结构； ｌＯ：盖、兰、嘲毙线聚糖，板心砻澡糖岩藻糖修饰，镌带呱嫡毋致／或蜥ｒ谬饰 赃娠ｌｆ目关糖蜚囟【（畔ｅ粤ｌ堋呀啪舯幽峨硼挈蜘ｏ＿删坩ｉ拣，‰９是反刍勘物滋养层细胞分泌韵主 要蛋白。，遨些蛋白储存在滋养屡巨大细胞分秘颗粒恂．，与母体子宫止发细胞融合后释放进入母体器。雷。妊娠串期Ｉｐ黻最丰寓的弘聚糖是四无线核心绪！藻糖基眈修饰辅构’，并连接有平分型蛾Ｎｋ。组成湖８航塬［№№娆．，３（?Ｇ姗№鲫、４９ｌ创必．，删ｌ渊№］哟聚糖均为删天线型。采用识别铷薯睨原的单克糟醐谢：（心埴ｌｌ９对分泌颗粒染色，分断：显示、，鳃娠．娩出话歪分娩前数天．，可以检测判黜ａ航原的存在。Ｉ山褴凝集素ｔ（ｔ脚溅ｉ珏删脚Ｉ卜ｓｉｓｌｅｃｔｉｎ）（该凝集素可以与ａ２，３?唾液酸修饰的乳糖氨）组织化学分析显示，该分泌颗粒在妊娠３２ｄ及分娩前呈阳性。提示在妊娠不同阶段ＰＡＧｓ的Ｎ一聚糖修饰模式有相应的改变，这些聚糖的不同糖型可能介导不同妊娠阶段的不同生理功能【ｌ引。 平分型Ｎ一聚糖在发育调控中的具体功能虽然还不明确，但在进化上高度保守。对斑马鱼的胚胎发育过程中Ｎ一聚糖表达动态分析显示，受精后４～７ｈＮ．聚糖仅仅可以检测到，但１２—１５ｈＮ一聚糖表达显著增加。对这些聚糖的结构分析表明，含有或不含有岩藻糖和（或）平分型ＧｌｃＮＡｃ残基的复合型二天线Ｎ一聚糖是主要的表达聚糖¨５Ｉ。 ３．４神经发育及再生 与三甘露糖核心上Ｂｌ，４甘露糖相连接平分型ＧｋＮＡｃ残基修饰的双天线Ｎ．聚糖在脑组织内含量丰富，被认为是脑型糖链。脑组织来源的神经细胞系ＣＧ４半乳糖基转移酶Ｉ表达活性增强，即导致该脑型糖链合成的减少；该型糖链表达水平的高低决定于半乳糖基转移酶Ｉ活性的强弱。半乳糖基转移酶活性表达增强也导致ＣＧ４细胞生长停滞及表型异常，并伴有细胞死亡率的增加，即便是半乳糖基转移酶Ｉ活性中等程度的增加，也会导致Ｎ．聚糖合成途径的中断，对ＣＧ４细胞是致死性的结局．１引。提示中枢神经系统Ｎ．聚糖的平分型ＧｌｃＮＡｃ修饰在神经系统发育过程中具有重要调节作用。在血清饥饿反应条件下，Ｎｅｕｍ２ａ细胞转染ＧｎＴ．Ⅲ后可以诱导轴突样反应，整合素Ｂ１分布部位伴有神经突和突起形成。这种神经纤维生成增强效应可被添加包含平分型ＧｌｃＮＡｃ的Ｎ．聚糖或植物血凝素（印曲Ｉ岫路ｌ瓶ｎａ￡ｉＩｌｇｐｈ）ｒｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｈｉｎ，Ｅ４一ＰＨＡ）所抑钶，该凝集素主要识别平分型ＧｌｃＮＡｃ【４］。Ｇｎｒ．一的促神经纤维生成作用也可以被抗Ｂｌ整合素功能阻断抗体显著抑制。事实上，ｐｌ整合素也是ＧｎＴ一■的靶蛋白之一，也已经通过Ｅ４．ＰＨＡ的础—曲帆船ｓ啊分析所证实。提示携带平分型Ｇｌｃ—ＮＡｃ的Ｎ?聚糖对神经纤维再生具有一定调节作罔㈣。 大鼠嗜铬细胞瘤细胞系转染ＧＩｌＴ．Ⅲ，可抑制瞰Ｆ及整合素刺激神经突的生长。这种神经突生长抑制作用可被丝裂原或细胞外信号调节激酶激酶．噩（趣缈小艘删蚰砌－【ｉ嘲ｓｅｋｉ岫ｓｅ＿ｌ，ＭＥＫ．１＞所逆转。与此一致韵是，ＥＧＦＲ介导的ＥＲＫ激活也可被舶ＢⅡ转染所阻滞；ＧｎＴ一■突变（Ｄ３２ｌＡ）则难以抑制神经突起韵生长；凝集素印迹分析显 示，野生型ＧｍＢ■转染细胞的ＥＧｎｔ的Ｎ一聚糖结万方数据

单克隆抗体及其应用的研究进展

2009年第1期畜牧兽医科技信息国兽医科学,2007,37(1):29-32 [9]李余动,等.胶体金免疫层析法快速检测氯霉素残留[J].中国食品卫生杂志,2005,17(5):416-419 [10]张明,等.免疫胶体金法检测磺胺甲恶唑残留的研究[J].中国兽药 杂志,2006,40(4):17-24 [11]邓省亮,等.胶体金免疫层析法快速检测黄曲霉毒素B1的研究 [J].食品科学,2007,28(2):232-236 [12]Sun Xiulan,et al.Preparation of gold-labeled antibody probe and its use in immunochromatography assay for detection of aflatoxin B1[J].International Journal of Food Microbiology ，2005，99(2):185-194 [13]赖卫华,等.应用胶体金试纸条快速检测赭曲霉毒素A 的研究[J]. 食品科学,2005,26(5):204-207 [14]Timo Klewitz,et al.Immunochromatographic assay for determina tion of botulinum neurotoxin type D[J].Sensors and Actuators B:Chemical,2006,113(2):582-589 1975年德国学者Kohler 和英国学者M ilstein 发明了杂交瘤技术。他们成功地将骨髓瘤细胞和产生抗体的B 淋巴细胞融合为杂交瘤细胞，这种合成的杂交瘤细胞稳定、有致瘤性、能产生抗体，其分泌的抗体是由识别一种抗原决定簇的细胞克隆所产生的均一性抗体，故称之为单克隆抗体(简称单抗)。自从鼠源单抗之后，单抗历经了鼠源性抗体、嵌合抗体、 人源化抗体、人源性抗体4个发展阶段。近年来随着分子生物学和细胞生物学的发展，单克隆抗体的应用已日益普及，单抗理论几乎应用到生物学研究的每一个区域。单克隆抗体制备技术的发展也就显得尤为重要。1 单克隆抗体的研究进展 1.1鼠源性单抗自单克隆抗体制备技术问世以来，制备单抗的一般程序基本相同，从超免疫的供体中即抗原免疫的小鼠，获取脾细胞，再与骨髓瘤细胞融合，最后对单个细胞进行克隆，培养出能分泌单抗的克隆细胞。目前生产的单抗大多是鼠源性的，但其在临床应用方面还存在着很大的弊端，主要是鼠源单抗与NK 等免疫细胞表面Fc 段受体亲和力弱,产生的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)作用较弱，而且它与人补体成分结合能力低,对肿瘤细胞的杀伤能力较弱，并且鼠源性抗体在人血循环中的半衰期短，它发挥AD-CC 作用的时间较短； 其次鼠单克隆抗体还具有免疫原性，使宿主易引起过敏反应。这样一方面降低了单抗的效价，另一方面又会给病人带来严重的后果。因此鼠源性单克隆抗体还应进一步改善才能广泛应用于临床。 1.2嵌合抗体抗体的恒定区是抗体分子结构中免疫原性 最强的部位，而决定抗体特异性的是抗体的可变区。从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig 恒定区的基因连 接,再插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体。也就是将鼠源性单抗在保留其抗原结合活性的基础上，尽可能的去除鼠源化部分或代之以人源化片断，减少了鼠源性抗体的免疫原性，从而尽可能的减少单抗的异源性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。但是这种抗体仍保留了30%的鼠源性，可诱发人抗小鼠反应(HAM A)。 1.3人源化抗体由于嵌合抗体异源性仍然很大，因此需要对鼠源抗体进行人源化改造，进一步人源化的方法很多,主要是重构抗体和表面重塑技术。重构抗体就是互补决定区(complementarity determining region,CDR)移植，将鼠抗体的CDR 移植到人抗体的相应部位，这样人源化程度可达90%以上，目前该方法是人源化单抗最常用、最基本的方法。而表面重塑技术，即将鼠抗体框架区表面氨基酸的残基(surface amino acid residues,SAR)进行人源化改造。该方法是仅替换与人抗体SAR 差别明显的区域，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换。 1.4人源性抗体虽然人源化抗体解决了鼠抗体的免疫原 性等问题，但生产人源化抗体仍有很大的困难；人源化过程需大量繁复、昂贵的电脑模拟，需取代不同的氨基酸以恢复选择性和亲和力，工作量非常大，并且它总还含有少量鼠源性成分。完全的人源性抗体才是用于治疗的理想抗体，目前它主要通过3种途径来研制：噬菌体抗体库技术、核糖体展示技术和转基因小鼠制备人源性抗体。1.4.1 噬菌体抗体库技术 噬菌体抗体库技术是迄今发展 最成熟、 应用最广泛的抗体库技术。其基本原理是将蛋白分子或肽段的基因克隆到丝状噬菌体的基因组DNA 中,与噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白,从而使该异源分子呈现于噬菌体表面。通过这种方式,形成了一个收藏上亿个以体外方式制得的不同抗体的基因数据库,使从任何真实的抗原中迅速分离高度相似的同族抗体成为可能。分离得到的抗体可用于 单克隆抗体及其应用的研究进展 孔 维1，杨文辉2 （1.东北农业大学动物医学院，哈尔滨150001；2.哈尔滨北方森林动物园，哈尔滨150300） 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000作者简介：孔维（1979～），湖南平江人，硕士研究生 专论与综述 9

生物类似药糖基化相似性评价中的审评思考

生物类似药糖基化相似性评价中的审评思考 糖基化作为一种重要的翻译后修饰，造成了蛋白类药物分子结构上的多样性和异质性，对有效性、安全性和药动学性质都有重要影响。糖基化是生物类似药和参照药相似性评价的难点之一。本文以单克隆抗体药物为例，介绍蛋白类药物糖基化表征的常用方法以及审评工作中生物类似药糖基化表征的技术考虑，为研发单位开发生物类似药以及监管机构对糖基化相关的技术审评提供参考。近年来，蛋白类药物由于在肿瘤、关节炎、糖尿病、心血管疾病等适应证上，显示出了作用靶点特异、疗效突出、安全性好等优点，极大满足了病患需求，已经成为药物研发的最重要领域之一［1］。然而，蛋白类创新药物由于巨大的研发成本，且价格高昂，严重影响了药物的可及性。各国监管机构纷纷出台政策法规指导和鼓励生物类似药的研发。2015年国家药品监督管理局药品审评中心发布了《生物类似药研发与评价技术指导原则》后，国内迎来了生物类似药的研发热潮，目前已陆续有相关产品获批上市。蛋白类药物由于多数采用哺乳动物细胞表达体系，细胞内存在着复杂的翻译后修饰和酶类反应，造成了表达产物在糖基化分子结构的多样性，生产工艺和细胞株的微小变化都可能导致目的蛋白糖修饰基团结构上的明显差异，因此，生物类似药基本上无法做到与原研产品在糖基化分子结构上完全一致［2－3］。相对于小分子药物，现有科学研究对单抗等大分子蛋白药物的分子结构与功能的认知仍然存在局限。目前对大分子药物之间的相似性评价方面往往需要综合药学、动物和人体等试验数据，结构和质量的相似性研究的深度和程度决定了开展人体临床评估的必要性和程度。各国监管机构鼓励研发企业采用最新的分析技术手段对原研药和生物类似药的结构进行深入研究，证明与原研药的“相似性”。 蛋白糖基化是一种重要的翻译后修饰，造成了蛋白药物糖基化修饰分子结构上的多样性和异质性。蛋白糖基化对蛋白的免疫原性和有效性有重要影响［4］，被普遍认为是治疗性蛋白药物最重要的关键质量属性( CQA) 之一。细胞基质和生产工艺的变化都可能影响终产品蛋白的糖基化修饰的组成和结构［5－6］。因此，研发单位需要对不同研发阶段的蛋白药物进行全面深入的表征，保证生产工艺的一致性、产品的安全性、生物类似药和原研药的可比性。本文将以

人源化单克隆抗体的研究进展

论人源化单克隆抗体的研究进展 *** （生物工程一班生命科学学院 ***大学哈尔滨 150080） 摘要：自从单克隆抗体问世至今已广泛应用与临床治疗，然而鼠源性单克隆抗体在临床治疗中会产生人抗鼠抗体反应，从而使鼠源性单克隆抗体的应用受到极大限制。随着基因工程技术和抗体工程技术的迅速发展，人源性单克隆抗体开始快速发展而逐渐代替鼠源性单克隆抗体。本文将就人源化单克隆抗体的构建以及其在临床治疗方面的应用进行综述。 关键词：单克隆抗体人源化临床治疗 Theory humanized monoclonal antibody research progress *** (The 1st class of Bioengineering , College of Life Science, *** University, Harbin, 150080) Abstract: Since the advent of monoclonal antibody has been widely applied in clinical treatment, but the mouse source sex monoclonal antibodies in clinical treatment will produce people resistance to mouse antibody response, so that the rat source sex monoclonal antibody application are highly limited. Along with the genetic engineering technology and the rapid development of antibody engineering technology, humanized sex monoclonal antibody began to rapid development and gradually replaces the rat source sex monoclonal antibody. This paper will review humanized monoclonal antibody construction and the application of clinical treatment in this article. Keywords: monoclonal antibody humanized clinical treatment 1975年。Kohler和Milstein将小鼠骨髓瘤细胞和经免疫的小鼠脾细胞融合，形成了可产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，该细胞机能产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术[1]，此后单抗药物开始迅速发展并广泛应用于临床。1982年，Philip Karr 将第一株抗独特型单抗(anti- ld) 应用于B细胞淋巴瘤的临床治疗并取得成功[2]，使得治疗性抗体的研究很快成为生物医药的热点，许多以单克隆抗体为研究对象的公司相继成立。然而，鼠源性单克隆抗体应用于人类有较强的免疫原性，能诱发人抗鼠抗体( Human ant-i mouse antibody, HAMA) 反应，引起强烈的免疫排斥反应[3]，而且鼠源性单克隆抗体不能有效地激活人体的生物效应功能，因此限制了其临床应用。这使研究学者意识到研制鼠源性单克隆抗体人源化或完全的人源性抗体才有可能减少或避免HAMA反应并提高疗效。然而反复实验证明, 杂交瘤技术不能提供稳定分泌人抗体的细胞株。直到80年代末期，随着分子生物学研究的深入，在抗体基因工程研究领域相继出现了一

糖基化对蛋白功能影响-有图电子教案

糖基化对蛋白功能影 响-有图

精品资料 糖基化对膜蛋白功能影响常常是很重要的，对特异的生物学功能起介导作用:1，对细胞具有保护、稳定、组织及屏障等多方面作用； 2，可作为外源性受体的特异性配体，某些糖连可作为各种病毒、细菌及寄生物的特异受体；3，糖连也可作为内源性受体的特异性配体，参与介导清除、周转及胞内穿行作用； 4，最后要说的正是我所关心的：在受精和发育生物学中，糖连在受精过程中起着重要的作用，这方面的证据有：在小鼠卵透明带糖蛋白ZP3上的O－聚糖参与精卵结合。 活细胞中去糖基化的方法： 1，衣霉素在体内阻断N－连糖， 2，将内切神经氨酸酶注入发育中的视网膜提示了多唾液酸的特异性作用－－将高纯度酶注入细胞内＋恰当的对照 3，将糖基修饰酶的cDNA在活细胞或动物中表达 4，在培养环境中加入凝集素或抗体把特异的聚糖封闭掉 蛋白质的修饰与加工包括糖基化、羟基化、酰基化、二硫键形成等，其中最主要的是糖基化，几乎所有内质网上合成的蛋白质最终被糖基化。糖基化的作用是：①使蛋白质能够抵抗消化酶的作用；②赋予蛋白质传导信号的功能；③某些蛋白只有在糖基化之后才能正确折叠。糖基一般连接在4种氨基酸上，分为2种：O-连接的糖基化（O-linked glycosylation）：与Ser、Thr 和Hyp的OH连接，连接的糖为半乳糖或N-乙酰半乳糖胺，在高尔基体上进行O-连接的糖基化；N-连接的糖基化（N-linked glycosylation）：与天冬酰胺残基的NH2连接，糖为N-乙酰葡糖胺，如图 （图为N-连接的糖基化引自Molecular Biology of the Cell. 4th ed. 2002）。 仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除谢谢2

糖基化对蛋白功能影响-有图

糖基化对膜蛋白功能影响常常是很重要的，对特异的生物学功能起介导作用:1，对细胞具有保护、稳定、组织及屏障等多方面作用； 2，可作为外源性受体的特异性配体，某些糖连可作为各种病毒、细菌及寄生物的特异受体；3，糖连也可作为内源性受体的特异性配体，参与介导清除、周转及胞内穿行作用； 4，最后要说的正是我所关心的：在受精和发育生物学中，糖连在受精过程中起着重要的作用，这方面的证据有：在小鼠卵透明带糖蛋白ZP3上的O－聚糖参与精卵结合。 活细胞中去糖基化的方法： 1，衣霉素在体内阻断N－连糖， 2，将内切神经氨酸酶注入发育中的视网膜提示了多唾液酸的特异性作用－－将高纯度酶注入细胞内＋恰当的对照 3，将糖基修饰酶的cDNA在活细胞或动物中表达 4，在培养环境中加入凝集素或抗体把特异的聚糖封闭掉 蛋白质的修饰与加工包括糖基化、羟基化、酰基化、二硫键形成等，其中最主要的是糖基化，几乎所有内质网上合成的蛋白质最终被糖基化。糖基化的作用是：①使蛋白质能够抵抗消化酶的作用；②赋予蛋白质传导信号的功能；③某些蛋白只有在糖基化之后才能正确折叠。糖基一般连接在4种氨基酸上，分为2种：O-连接的糖基化（O-linked glycosylation）：与Ser、Thr和Hyp 的OH连接，连接的糖为半乳糖或N-乙酰半乳糖胺，在高尔基体上进行O-连接的糖基化；N-连接的糖基化（N-linked glycosylation）：与天冬酰胺残基的NH2连接，糖为N-乙酰葡糖胺，如图（图为N-连接的糖基化引自Molecular Biology of the Cell. 4th ed. 2002）。

对已知蛋白序列的： 1。蛋白酶切，2-D胶，糖链染色，可确定糖基化位点2。用糖苷酶将糖切下，NMR可分析糖单体结构 3。分离切下的糖链，质谱分析 4。 ........

单克隆抗体的制备及其应用研究进展

单克隆抗体的制备及其应用研究进展 燕珊珊 摘要:单克隆抗体技术的突破为医学和生物学的基础研究开创了新纪元。基因工程抗体技术的发展更为疾病治疗、临床试验和科研方面做出巨大贡献。此外，抗体还可能执行除目前所具有之外的更多功能。本文将就单克隆抗体的制备及其应用研究进展进行论述。 关键词:单克隆抗体；基因工程；小鼠骨髓瘤细胞；细胞杂交瘤技术；噬菌体；临床应用 抗体是机体免疫系统的重要效应分子，从第一代多克隆抗体（polyclonalantibody,PcAb）到第二代单克隆抗体的成功制备，人们投入了大量的临床应用研究，对医学和生物学的发展发挥了巨大的作用。 单克隆抗体（monoclonal antibodies，mAbs）技术的突破为医学和生物学的基础研究开创了新纪元。基因工程抗体技术的发展更为疾病治疗、临床试验和科研方面做出巨大贡献。目前，制备mAbs 的方法中比较成熟的主要有以下几种：1. 抗原特异性的B 淋巴细胞杂交瘤技术；2. 人-鼠嵌合抗体制备技术； 3.噬菌体展示技术获得的抗原特异性人源性抗体；4. 转基因小鼠制备的人mAbs；5.核糖体展示技术。

通过这些方法，我们利用相应抗原靶向构建治疗性抗体，从而达到预防、治疗疾病的目的，促进生物制药学的发展。以下主要是对抗体制备技术的发展及其应用研究进展进行综述。 1 鼠源性抗体 1975 年，Kohler 和Milstein[1] 将小鼠骨髓瘤细胞和经绵阳红细胞免疫的小鼠脾细胞融合，形成了可产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，该细胞既能产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。由免疫B细胞-浆细胞、瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞系可分泌单一、特异性、纯化的抗体，且能在选择培养基中生长、无限增值、分裂，同时在选择培养基作用下，利用代谢缺陷补救机理筛选出同时具有两种细胞特征的细胞克隆。这种经过反复克隆而挑选出来的融合细胞所产生的抗体称为单克隆抗体(McAb)。它在分子结构、氨基酸序列以及特异性等方面都是一致的。淋巴细胞杂交瘤技术的主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、单抗的鉴定等。至今，科学家们已经建立众多鼠源性mAbs 来诊断和治疗多种人类疾病。然而作为在人体内的应用，鼠源单抗尚存在一些问题。鼠源性抗体作为异种蛋白应用于人体可引起免疫反应，产生人抗鼠抗体（human anti-mouse antibody,HAMA）[2]，很大程度上限制了mAbs 的临床应用。此外，鼠源性mAbs 不能与人类抗体FcRn 结合[3]。为了克服以上这些问题，近年，随着分子生物学的发展，人们已有可能通过抗体工程技术制备人-鼠嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。

糖基化修饰是生物体中最普遍的蛋白质翻译后修饰,对蛋白质

自然科学奖公示内容 项目名称硼亲和分子印迹技术及其在生命分析中的应用提名单位南京大学 项目简介糖基化修饰是生物体中最普遍的蛋白质翻译后修饰，对蛋白质的结构和功能具有重要影响，与许多重大疾病的发生和发展密切相关。抗体和凝集素是识别糖蛋白和糖基化修饰的核心手段，但抗体和凝集素存在着难以制备、识别性能不足和稳定性差等瓶颈问题。分子印迹技术是制备仿生识别材料的重要方法，但项目实施前国际上缺乏能识别蛋白质的通用和高效的分子印迹技术。自2011年以来，项目团队将前期自主发展的硼亲和识别技术与分子印迹技术相结合，创新地发展出“硼亲和光刻分子印迹法”和“硼亲和可控定向表面印迹法”等通用、便捷、高效的分子印迹技术，突破了抗体和凝集素的局限，制备出了系列高效识别糖蛋白、糖肽、聚糖和单糖的分子印迹材料，为生命分析和生物医学应用中的糖蛋白质和糖基化修饰识别奠定了重要物质基础。项目团队还将所得分子印迹聚合物与表面增强拉曼光谱相结合，发展出专一、灵敏和快速的免疫分析新方法—“硼亲和夹心法（BASA）”和单细胞分析新方法—“等离激元免疫夹心法（PISA）”等生命分析新方法，为精准疾病诊断和个性化药物筛选重要应用提供强有力的分析工具。 主要完成人情况刘震，排名1，工作单位：南京大学 完成单位：南京大学 贡献：负责项目的整体构思、方案设计、研究内容指 导、经费申请、论文和专利的撰写。 刘佳，排名2，工作单位：南京大学 完成单位：南京大学 贡献：作为主要完成人之一，发展出基于活体免疫微 萃取和表面等离激元光学检测相结合的，称为“等离 激元免疫夹心法（PISA）”的新颖单细胞分析方法， 实现了单个活细胞和活体动物中的低拷贝数蛋白的 定性及定量分析。该部分工作是本项目硼亲和分子印 迹技术的重要应用，为癌症诊断与预后、细胞质量控 制、个性化药物筛选等多个重要应用领域提供了强有 力的分析工具。 李澧，排名3，工作单位：江苏省农业科学院 完成单位：南京大学 贡献：作为主要完成人，建立了“硼亲和光刻分子印 迹法”，成功制备了能识别甲胎蛋白等糖蛋白的高性 能分子印迹材料，并构建了利用分子印迹材料替代抗 体的新颖免疫分析方法，开辟了以硼亲和作为核心作

天然产物糖基化修饰及应用

天然产物糖基化修饰及应用 摘要：天然产物广泛存在于自然界中，其数量种类繁多且结构复杂多样，具有许多生理与药理活性。糖基化修饰能增加天然产物结构和功能的多样性，已成为当今新药开发的研究热点。本文简单介绍了天然产物糖基化的基本概念，以及天然产物糖基化修饰的研究方法和在各方面的应用。 关键词：天然产物，糖基化，修饰方法，应用 天然产物广泛存在于自然界中，其数量种类繁多且结构复杂多样，许多天然产物活性成分现在已经作为治疗各类疾病的药物，还有一些作为潜在的药物，具有抗炎抑菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、抗辐射和免疫调节等诸多活性，已成为国内外天然药物开发利用研究的热点。糖基化反应可以使许多外源化合物的理化性质与生物活性发生较大的变化，例如将不溶于水的化合物转变为水溶性化合物，降低化合物的毒性，增强稳定性等[1]。本文对天然产物糖基化修饰和应用作简单综述。 糖基化是生物细胞中最重要的反应之一，与多种生理病理过程有直接关系。在微生物和植物的次级代谢过程中，糖基化也是重要的反应，即生物为了使有机分子更有效地发挥作用而进行的一种结构修饰[2]。这种天然的修饰存在于多种生物学活性不一样的天然化合物中，包括抗生素、抗癌药物、激素、甜料、生物碱以及黄酮等多种代谢产物[3]。 1 天然产物简介 天然产物是指动物、植物、、海洋生物和体内的组成成分或其代谢产物以及人和动物体内许许多多内源性的化学成分统称作天然产物，其中主要包括、、、、各种酶类、、寡糖、、、、、木质素、维生素、、、蜡、、挥发油、、糖苷类、萜类、、、、醌类、、、鞣酸类、抗生素类等天然存在的化学成分。 1.1植物源天然产物成分 来源于植物界的有效成分主要有黄酮类、类、多糖类、挥发油类、醌类、萜类、木脂素类、香豆素类、皂苷类、强心苷类、酚酸类及氨基酸与酶等。 1.2微生物及其发酵液天然产物成分 微生物是包括细菌、病毒、以及一些小型的原生动物等在内的一大类生物群体，它个体微小，却与人类生活密切相关。能够提供有效成分的主要是真核生物中的真菌与藻类，以及其他（发酵）产物。来源于微生物及发酵液的有效成分主要有、酶类、抗生素类、色素类、氨基酸类、有机酸类、醇酮类、维生素类、核酸类等等。 1.3海洋天然产物有效成分 海洋占地球表面积的71%，生物量约占地球生物总量的87%，生物种类20多万种，是地球上最大的资源能源宝库，目前人们对海洋生物的认识仍相当有限，利用率仅1%左右。到目前为止海洋天然产物有效成分主要有甾醇、萜类、、不饱和脂肪酸、多糖和糖苷、大环、聚醚类化合物和多肽等。

蛋白质修饰位点预测详解

蛋白质修饰位点分析 目录 实验目的 (2) 实验平台 (2) 实验过程 (3) 一、“人类connexin43”蛋白质磷酸化位点修饰 (3) 1、“人类connexin43”蛋白质序列下载 (3) 2、uniprot数据库查看蛋白磷酸化位点 (4) 3、在线软件预测指定蛋白磷酸化位点 (6)

（1）DISPHOS 1.3预测未知蛋白磷酸化位点 (6) （2）PhosphoSitePlus预测指定蛋白磷酸化位点 (11) 4、“人类connexin43”蛋白质磷酸修饰结论 (14) 二、“人类血红蛋白”糖基化位点修饰 (15) 1、N型糖基化位点预测 (15) 2、O型糖基化位点预测 (18) （1）哺乳动物O型糖基化位点预测 (18) （2）真核生物O型糖基化位点预测 (20) 3、uniprot数据库查看蛋白质糖基化修饰位点 (22) 4、“人类血红蛋白”糖基化位点修饰结论 (22) 实验结论 (23) （特别提示:ctrl+单击目录下的标题链接，可以跟踪标题；ctrl+单击标题后的图标可以返回目录） 实验目的 ●找出“人类connexin43”蛋白质上面的所有可能磷酸化位点， 并说明为什么（注释） ●找出“人类血红蛋白”上面的糖基化位点，注释结果 实验平台 ●uniprot数据库: https://www.360docs.net/doc/605994662.html,/(查看蛋白的修饰 情况) ●预测未知蛋白磷酸化位点 DISPHOS:https://www.360docs.net/doc/605994662.html,/disphos/

PhosphoSitePlus:https://www.360docs.net/doc/605994662.html, 预测未知蛋白的糖基化修饰位点 N型糖基化位点预测：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/ O型糖基化位点预测：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/ http://www.cbs.dtu.dk/services/YinOY ang/ 实验过程 一、“人类connexin43”蛋白质磷酸化位点修饰 1、“人类connexin43”蛋白质序列下载 蛋白序列：fasta.txt

单克隆抗体的研究进展

单克隆抗体的研究进展 姓名：学号： 摘要：1976年德国学者Kohler和英国学者Milstein创建杂交瘤技术而使鼠源单克隆抗体被广泛用于生物学和医学研究领域，建立了治疗性抗体的第一个飞跃。自此抗体分子成为了生物及医学领域中用途最为广泛的蛋白质分子。随着对抗体的理化性质以及对免疫球蛋白分子结构与功能的阐明应用DNA重组技术和抗体库技术对鼠单抗进行人源化改造，先后出现了嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体，它们从不同方面补充了鼠单抗临床应用的缺陷，使抗体制备技术得到了全新发展。 关键词：单克隆抗体；鼠单抗；人源化 鼠源性单克隆抗体开始了多克隆抗体走向单克隆抗体的新时代。与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有特异性高、效价高、纯度高、理化性状均一、重复性强、成本低并可大量生产等无可比拟的优点。目前比较成熟的制备方法有（1）抗原特异性的B淋巴细胞杂交瘤技术；（2）人–鼠嵌合抗体制备技术；（3）噬菌体展示技术获得的抗原特异性人源性抗体；（4）转基因小鼠制备的人mAbs；（5）核糖体展示技术。随着对各类抗体结构和氨基酸序列及其变异的种属和功能之间关系的深入了解，而能够利用抗体工程技术对抗体结构进行改造从而达到预防、治疗疾病的目的，促进生物学及医学的发展。一下主要是对抗体制备技术的及其应用研究进展进行综述。 1杂交瘤技术 杂交瘤的制备是制备抗原特异性的单克隆抗体，所以融合一方必须是经过抗原免疫的B细胞，通常选用被免疫动物的脾细胞，脾淋巴细胞的主要特征是抗体分泌功能。融合细胞另一方则要求在培养条件下的永生性，只有肿瘤细胞才是具备这一条件，所以选择同一体系的骨髓瘤细胞，因多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，其特点是稳定易培养、自身不分泌免疫球蛋白及细胞因子、融合率高、是次黄嘌呤鸟嘌呤核苷酸转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（TK）的缺陷性，是理想的脾细胞融合对象。再用HAT培养基筛选只有能长期生存与繁殖的是具有亲带双方遗传性能的融合细胞。 杂交瘤技术操作主要流程示意图

综述-单克隆抗体的研究报告进展

单克隆抗体的研究进展 摘要：单克隆抗体近年来发展迅速，并广泛应用于医学，生物学，免疫学等多种学科。单抗药物可用于治疗肿瘤、病毒性感染、心血管病以及其它疾病，尤其是用于治疗肿瘤，已显示出良好的前景。本文参阅近10年国外相关文献，并进行整理，综述单克隆抗体的研究进展，着重阐述用于治疗肿瘤的单克隆抗体应用中存在的问题、解决方法以及研究的展望。 关键词：单克隆抗体；抗肿瘤药物；治疗 单抗药物治疗疾病具有明确的靶向性，作用机制明确，因而具有起效快、疗效好、副作用小等优点。尤其是对肿瘤的治疗，能克服化疗药物不能有效区分正常细胞和肿瘤细胞、副作用大等缺点。同时，单克隆抗体体积小，能更有效地透入肿瘤；分子小、消除快、累积毒性小；所携带的弹头脱离后，可较快被清除；循环中免疫靶向结合物对靶细胞的竞争作用小；半衰期短；穿透性好；能穿过血脑屏障，因而还可以作为新一代靶向载体。与化学药物、毒素、放射性核素、生物因子、基因、分化诱导剂、光敏剂、酶等物质构成单克隆抗体靶向药物，把杀伤肿瘤细胞的活性物质特异的输送到肿瘤部位，利用单抗对肿瘤表面相关抗原或特定的受体特异性识别，从而把药物直接导向肿瘤细胞，提高药物疗效，降低药物对循环系统及其他部位的毒性[1]。 1作用机制 目前，单抗的作用机制并不十分明确，通过研究，目前认为有阻断作用、信号传导作用以及靶向作用等三种作用机制[1]。 1.1阻断作用 现用于临床的大部分未偶联单抗主要用于自身免疫和免疫抑制，是通过阻断和调节作用完成的。几乎在所有的单抗应用中，通常是通过阻断免疫系统的一种重要的胞桨或受体-配体相互作用而实现的。另一种相类似的阻断活性可能存在于单抗的抗病毒感染中，通过阻断和抵消病原体的进入和扩散表现出对机体的防御功能，短期给予单抗后可取得长期疗效。肿瘤细胞生长、扩增和分化，需要各种生长因子的持续性刺激，而这些生长因子也参与肿瘤的侵润、转移和血管生成，单克隆抗体与其受体结合，可抑制配体-受体的相互作用，从而使得这些肿瘤细胞得不到生长因子的刺激而自行死亡。贝伐单抗通过结合VEGF受体，阻断VEGR与受体的结合，抑制皮细胞增殖或者血管生成，抑制病灶转移[2]。 1.2信号传导作用 许多抗癌单抗是通过恢复效应因子，直接启动信号机制而获得细胞毒效应的。对Trastuzumab而言，单抗结合可诱导一系列在肿瘤生长控制中起作用的信号传递，该抗原是生长因子受体家族的一个成员，能