发酵思考题完整答案

第八章发酵过程

1，发酵过程的定义

发酵过程即细胞的生物反应过程，是指由生长繁殖的细胞所引起的生物反应过程。它不仅包括了以往“发酵”的全部领域，而且还包括固定化细胞的反应过程、生物法废水处理过程和细菌采矿等过程。2，为何要研究发酵过程

微生物发酵的生产水平不仅取决于生产菌种本身的性能，而且要赋以合适的环境条件才能使它的生产能力充分表达出来。为此我们必须通过各种研究方法了解有关生产菌种对环境条件的要求，如培养基、培养温度、pH、氧的需求等，并深入地了解生产菌在合成产物过程中的代谢调控机制以及可能的代谢途径，为设计合理的生产工艺提供理论基础。同时，为了掌握菌种在发酵过程中的代谢变化规律，可以通过各种监测手段如取样测定随时间变化的菌体浓度，糖、氮消耗及产物浓度，以及采用传感器测定发酵罐中的培养温度pH、溶解氧等参数的情况，并予以有效地控制，使生产菌种处于产物合成的优化环境之中。

3，发酵过程的主要控制参数主要分为哪三大类

物理、化学和生物三类

4，发酵过程中通常测定的参数有哪些

目前较常测定的参数有温度、罐压、空气流量、搅拌转速、pH、溶氧、基质浓度、菌体浓度(干重、离心压缩细胞体积%)等。

5，发酵过程中参数测定的方法有哪两种

参数测定方法有：在线测定，取样测定（离线测定）

6，简述发酵过程的代谢变化规律。为什么要了解这一规律。

1）代谢变化就是反映发酵过程中菌体的生长，发酵参数（培养基，培养条件等）和产物形成速率三者间的关系。

2）了解生产菌种在具有合适的培养基、pH、温度和通气搅拌等环境条件下对基质的利用、细胞的生长以及产物合成的代谢变化，有利于人们对生产的控制。

7，分批发酵、补料分批发酵和连续发酵的定义。对这三种发酵方式进行比较。

分批发酵(Batch fermentation)

?是指在一封闭系统内含有初始限量基质的发酵方式。在这一过程中，除了氧气、消泡剂及控制pH的酸或碱外，不再加入任何其它物质。发酵过程中培养基成分减少，微生物得到繁殖。

?特点：微生物所处的环境在发酵过程中不断变化，其物理，化学和生物参数都随时间而变化，是一个不稳定的过程。

?优点：操作简单；操作引起染菌的概率低。不会产生菌种老化和变异等问题

?缺点：非生产时间较长、设备利用率低。

补料分批发酵(Fed-batch fermentation)定义：补料分批发酵又称半连续发酵或流加分批发酵，是指在分批发酵过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方式。

?优点

–使发酵系统中维持很低的基质浓度；

–和连续发酵比、不需要严格的无菌条件；

–不会产生菌种老化和变异等问题。

?缺点

–存在一定的非生产时间；

–和分批发酵比，中途要流加新鲜培养基，增加了染菌的危险。

连续发酵(Continuous fermentation)

定义：培养基料液连续输入发酵罐，并同时放出含有产品的相同体积发酵液，使发酵罐内料液量维持恒定，微生物在近似恒定状态（恒定的基质浓度、恒定的产物浓度、恒定的pH、恒定菌体浓度、恒定的比生长速率）下生长的发酵方式。

?优点

–能维持低基质浓度；

–可以提高设备利用率和单位时间的产量；

–便于自动控制。

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?缺点

–菌种发生变异的可能性较大；

–要求严格的无菌条件。

8，按照产物生成与菌体生长是否同步，可将分批发酵分为哪两种类型，并用公式进行表述。这种分类方法对实际生产有何指导意义

第一类型（生长关联型）

第二类型（部分生长关联型）

第三类型（非生长关联型）

9，代谢变化、代谢曲线

代谢变化就是反映发酵过程中菌体的生长，发酵参数（培养基，培养条件等）和产物形成速率三者间的关系。把它们随时间变化的过程绘制成图，就成为所说的代谢曲线。

10，温度对发酵过程有何影响？

影响各种酶的反应速率和蛋白质性质，影响发酵液的物理性质，影响生物合成的方向。

11，pH值对发酵过程有何影响？

(1)pH影响酶的活性，当pH抑制菌体中某些酶的活性时，使菌体的新陈代谢受阻；

(2)pH影响微生物细胞膜所带电荷的状态，从而改变细胞膜的渗透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的排泄，因此影响代谢的正常进行；

(3)pH影响培养基某些组分和中间代谢产物的离解；从而影响微生物对这些物质的利用；

(4)pH不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变

12，简述发酵过程中引起pH下降和上升的因素

引起pH下降的因素：碳源过量，消泡油添加过量，生理酸性物质的存在。

引起pH上升的因素：氮源过多；生理碱性物质的存在；中间补料，碱性物质添加过多

13，发酵过程中pH的控制方式。

调节基础培养基的配方，调节碳氮比（C/N），添加缓冲剂，补料控制，直接加酸加碱，补加碳源或氮源。

14，发酵过程中泡沫产生的原因

由外界引进的气流被机械地分散形成（通风、搅拌）；发酵过程中产生的气体聚结生成（发泡性物质）。15，发酵过程中泡沫的产生有何不利的影响

降低发酵设备的利用率

增加了菌群的非均一性

增加了染菌的机会

导致产物的损失

消泡剂会给后提取工序带来困难

16，在发酵过程中影响泡沫稳定性的因素有哪些

通气与搅拌的强度

培养基的配比及原材料组成

培养基的破坏程度

接种量的大小

培养液本身性质的变化

培养基灭菌的方法和操作

染菌

17，发酵过程中泡沫控制的方法。

?物理消沫法

?化学消沫法

18，化学消泡的机理。

当泡沫的表层存在着由极性的表面活性物质形成双电层时，可以加入另一种具有相反电荷的表面活性剂，以降低泡沫的机械强曲或加入某些具有强极性的物质与发泡剂争夺液膜上的空间，降低液膜强度，使泡沫破裂。

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当泡沫的液膜具有较大的表面粘度时，可以加入某些分子内聚力较小的物质，以降低液膜的表面粘度，使液膜的液体流失，导致泡沫破裂。

19，发酵过程中补料控制的目的，所补的物料包括哪些类型，补料的原则及控制策略

目的：解除基质过浓的抑制；解除产物的反馈抑制；解除葡萄糖分解代谢阻遏效应

类型：补充微生物能源和碳源的需要；补充菌体所需要的氮源；补充微量元素或无机盐。

原则：

1，控制微生物的中间代谢，使之向着有利于产物积累的方向发展。

2，为实现这一目标，在中间补料控制时，必须选择恰当的反馈控制参数和补料速率。

控制策略：大多数补料分批发酵均补加生长限制性基质

以经验数据或预测数据控制流加；

以pH、尾气、溶氧、产物浓度等参数间接控制流加；

以物料平衡方程，通过传感器在线测定的一些参数计算限制性基质的浓度，间接控制流加；

用传感器直接测定限制性基质的浓度，直接控制流加。

20，临界氧浓度

临界氧浓度（C临）：指不影响菌体呼吸所允许的最低氧浓度，或微生物对发酵液中溶解氧浓度的最低要求。

21，请叙述发酵过程中溶解氧的一般变化规律。

发酵前期：由于微生物大量繁殖，需氧量不断大幅度增加，此时需氧超过供氧，溶氧明显下降

发酵中后期：溶氧浓度明显地受工艺控制手段的影响，如补料的数量、时机和方式等

发酵后期：由于菌体衰老，呼吸减弱，溶氧浓度也会逐步上升，一旦菌体自溶，溶氧就会明显地上升22，二氧化碳对发酵的影响及其机理，发酵过程如何控制二氧化碳

CO2是微生物的代谢产物，同时也是某些合成代谢的基质。它是细胞代谢的重要指标。在发酵过程中，CO2有可能对发酵有促进作用，也有可能有抑制作用。

CO2对菌体具有抑制作用，当排气中CO2的浓度高于4%时，微生物的糖代谢和呼吸速率下降

CO2对发酵也有影响

对发酵促进。如牛链球菌发酵生产多糖，最重要的发酵条件是提供的空气中要含5%的CO2。

对发酵抑制。如对肌苷、异亮氨酸、组氨酸、抗生素等发酵的抑制

影响发酵液的酸碱平衡

23，发酵过程的基本自控系统包括哪些

前馈控制(feedforward control) ，后（反）馈控制(feedback control )，自适应控制(adaptive control)

24，发酵动力学的定义，研究发酵动力学的目的。

发酵动力学：研究各种发酵过程变量在活细胞的作用下变化的规律，以及各种发酵条件对这些变量变化速度的影响，并以数学，工程学的原理，定量描述。

目的：通过动力学研究，优化发酵的工艺条件及调控方式；（研究各种物理，化学因素的影响，为调控提供依据）

?建立反应过程的动力学模型来模拟最适当的工艺流程和工艺参数，预测反应的趋势；

?控制发酵过程，甚至用计算机来进行控制。

25，研究发酵动力学方法有哪两种？

宏观处理法：

?结构动力学模型（通过研究微观反应机制建立）

?非结构动力学模型（不考虑微观反应机制，只考虑宏观变量之间的关系）

?质量平衡法（根据质量守恒定律）

物质在系统中的积累速度=物质进入系统速度+物质在系统中生成的速度-物质在系统中排除的速

度-物质在系统中消耗的速度

26，简述Monod方程与米氏方程的区别与联系。根据实验结果计算Monod方程的参数

Monod方程是对实验现象的总结，是经验方程（empirical model）

米氏方程是根据酶反应极力推导得出，是机理方程（mechanistic model ）

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衷心感谢曹剑磊、赵常红、赵西云、薛峰、高亦豹、洪晨江、唐波、武Monod 方程与米氏方程的相似性。

27，恒化器和恒浊器的定义。

恒化器：以某种必需营养作为生长限制基质，通过控制流加速率造成适应这种条件的细胞生长密度和生长速率，培养液中限制性底物浓度保持恒定。

恒浊器：通过控制生长限制性基质的流量维持恒定的菌体密度。

28，在连续培养过程中，其实际结果为何会和理论推导的结果发生偏差

? 限制性基质为碳源时，部分消耗的碳源作为能量供生命活动，X 偏低；

? N ，S 为限制性基质，D 较小时会积累多糖，脂肪等，X 偏高；

? Mg, P,K 为限制性基质时，同上，但细胞内这些物质下降，YX/S 增大，细胞浓度偏高； ? 复合培养基时，情况复杂，随着μ变化，限制性基质会改变，X 下降。

29，宏观产率系数

宏观产率系数(或称得率系数)Yi/j 是化学计量学中一种非常重要的参数，常用于对碳源等底物形成菌体或产物的潜力进行评价，其中i 表示菌体或产物，j 表示底物

? 例如，菌体对底物的产率系数可表示为：

30，理论代谢产物产率的计算

假设发酵过程中完全没有菌体生成，则YP/S 可达理论最高值，称为理论代谢产物产率 31，分批发酵、补料分批发酵和连续发酵动力学方程的推导

32，研究连续培养动力学有何用途

确定最佳培养条件

富集，选育特殊形状菌种

建立选择性的培养环境

生长速率不同的菌种在连续培养中的“去”“留”。

第九章 厌氧发酵设备

1、酒精发酵设备的基本要求

答：1）满足酒精发酵的工艺要求 即满足酒精酵母生长和代谢的必要工艺条件及能将发酵产生的热量及时移走

2）有利于发酵液的排出，设备的清洗、维修以及设备制造安装方便等问题。

2、酒精发酵罐的冷却装置有哪三种形式？

1）中小型发酵罐：多采用罐顶喷水淋于罐外壁表面进行膜状冷却；

2）大型发酵罐：由于罐外壁冷却面积不能满足冷却要求，所以，罐内装有冷却蛇管或罐内蛇管和罐外壁喷洒联合冷却装置。

3）此外，也有采用罐外列管式喷琳冷却的方法，此法具有冷却发酵液均匀、冷却效率高等优点。

3、微生物在厌氧发酵过程中总的发酵热

答：微生物在厌氧发酵过程中总的发酵热，一般由生物合成热Q1，蒸发热损失Q2， 罐壁向周围散失的热损失Q3等三部分热量所组成。即： Q= Q1 -（ Q2 + Q3 ）

4、酒精发酵罐罐数的计算

答：对于间歇发酵，发酵罐罐数可按下式计算：

式中 N ：发酵罐个数（个） n ：每24小时内进行加料的发酵罐t ：发酵周期（小时）

5、啤酒圆筒体锥底发酵罐的优缺点

答：优点：1）加速发酵，C.C.T （圆筒体锥底发酵罐）发酵和传统发酵相比，由于发酵基质(麦汁)和酵母对流获得强化，可加速发酵。2）厂房投资节省。 3）冷耗节省。 4）酵可依赖CIP 自动程序清洗消毒，工艺卫生更易得到保证。

缺点：1）由于罐体比较高，酵母沉降层厚度大，酵母泥使用代数一般比传统低(只能使用5～6代)；

2）贮酒时，澄清比较困难(特别在使用非凝聚性酵母)，过滤必须强化；

3）若采用单酿发酵，罐壁温度和罐中心温度一致，一般要5~7d以上，短期贮酒不能保证温度一致

第十章通风发酵设备

1，常用的通风发酵罐有哪几种类型

答：共五种机械搅拌发酵罐，气升式发酵罐，自吸式发酵罐，伍式发酵罐和文氏管发酵罐。

2，械搅拌发酵罐的基本要求

答：1,机发酵罐应具有适宜的径高比;2发酵罐能承受一定压力;3发酵罐的搅拌通风装置能使气液充分混合，保证发酵液必须的溶解氧;4发酵罐应具有足够的冷却面积;5发酵罐内应尽量减少死角，避免藏垢积污，灭菌能彻底，避免染菌;6搅拌器的轴封应严密，尽量减少泄漏。

3，机械搅拌发酵罐的搅拌器的作用和种类

答：搅拌器的作用是打碎气泡，使空气与溶液均匀接触，使氧溶解于发酵液中。搅拌器有轴向式（桨叶式、螺旋桨式）和径向式（涡轮式）两种。

4，挡板的作用

答：挡板的作用是改变液流的方向，由径向流改为轴向流，促使液体剧烈翻动，增加溶解氧。

5，全挡板条件

答：全挡板条件：是指在一定转数下再增加罐内附件而轴功率仍保持不变。要达到全挡板条件必须满足下式要求：

6，消泡器的作用和种类

答：消泡器的作用是将泡沫打破。消泡器常用的形式有锯齿式、梳状式及孔板式。孔板式的孔径约10~20毫米。消泡器的长度约为罐径的0．65倍。

7，发酵罐上常用的轴封有哪两种，比较其优缺点

答：（1），常用的轴封有填料函和端面轴封两种。填料函式轴封是由填料箱体，填料底衬套，填料压盖和压紧螺栓等零件构成，使旋转轴达到密封的效果。端面式轴封又称机械轴封。密封作用是靠弹性元件（弹簧、波纹管等）的压力使垂直于轴线的动环和静环光滑表面紧密地相互贴合，并作相对转动而达到密封。

（2），填料函式轴封的优点是结构简单。主要缺点是：死角多，很难彻底灭菌，容易渗漏及染菌；轴的磨损情况较严重；填料压紧后摩擦功率消耗大；寿命短，经常维修，耗工时多。端面式轴封的优点：清洁；密封可靠；无死角，可以防止杂菌污染；使用寿命长；摩擦功率耗损小；轴或轴套不受磨损；它对轴的精度和光洁度没有填料密封要求那么严格，对轴的震动敏感性小。端面式轴封的缺点：结构比填料密封复杂，装拆不便；对动环及静环的表面光洁度及平直度要求高。

8，机械搅拌发酵罐的冷却装置有哪三种？各适用于什么场合？比较其优缺点？

答：（1），夹套式换热装置这种装置多应用于容积较小的发酵罐、种子罐；夹套的高度比静止液面高度稍高即可，无须进行冷却面积的设计。这种装置的优点是：结构简单；加工容易，罐内无冷却设备，死角少，容易进行清洁灭菌工作，有利于发酵。其缺点是：传热壁较厚，冷却水流速低，发酵时降温效果差。

（2），竖式蛇管换热装置这种装置是竖式的蛇管分组安装于发酵罐内，有四组、六组或八组不等，根据管的直径大小而定，容积5米3以上的发酵罐多用这种换热装置。这种装置的优点是：冷却水在管内的流速大；传热系数高。这种冷却装置适用于冷却用水温度较低的地区，水的用量较少。但是气温高的地区，冷却用水温度较高，则发酵时降温困难，发酵温度经常超过40?C，影响发酵产率，因此应采用冷冻盐水或冷冻水冷却，这样就增加了设备投资及生产成本。此外，弯曲位置比较容易蚀穿。

（3），竖式列管(排管)换热装置这种装置是以列管形式分组对称装于发酵罐内。其优点是：加工方便，适用于气温较高，水源充足的地区。这种装置的缺点是：传热系数较蛇管低，用水量较大。

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9，自吸式发酵罐的充气原理

答：

10，气升式发酵罐的工作（充气）原理

答：自吸式发酵罐的主要的构件是自吸搅拌器及导轮，简称为转子及定子。转子由箱底向上升入的主轴带动，当转子转动时空气则由导气管吸入。转子的形式有九叶轮、六叶轮、三叶轮、十字形叶轮等，叶轮均为空心形。

11，搅拌器的轴功率

答：搅拌器输入搅拌液体的功率：是指搅拌器以既定的速度旋转时，用以克服介质的阻力所需的功率，简称轴功率。它不包括机械传动的摩擦所消耗的功率，因此它不是电动机的轴功率或耗用功率。发酵罐液体中的溶氧速率以及气液固相的混合强度与单位体积液体中输入的搅拌功率有很大关系。

12，影响搅拌器输入搅拌液体的功率的因素

答：一个具体的搅拌器所输入搅拌液体的功率取决于下列因素：叶轮和罐的相对尺寸，搅拌器的转速，流体的性质和挡板的尺寸和数目。

13，功率准数

答：功率准数表征着机械搅拌所施与单位体积被搅拌液体的外力与单位体积被搅拌液体的惯性之比。

式中ω：涡轮线速度 a：加速度 V：液体体积 m：液体质量

14，根据功率准数所表征的意义推导

答：

15，机械搅拌发酵罐主要由哪三个部分组成及各自的作用

答：机械搅拌发酵罐主要由搅拌装置、轴封和罐体三部分组成。三个组成部分各起如下的作用:搅拌装置：由传动装置、搅拌轴、搅拌器组成 ,由电动机和皮带传动驱动搅拌轴使搅拌器按照一定的转速旋转 ,以实现搅拌的目的。轴封：为搅拌罐和搅拌轴之间的动密封 ,以封住罐内的流体不致泄漏。罐体：罐体、加热装置及附件。它是盛放反应物料和提供传热量的部件。第十章通风发酵设备

15，机械搅拌发酵罐主要由哪三个部分组成及各自的作用

机械搅拌发酵罐主要由搅拌装置、轴封和罐体三部分组成。三个组成部分各起如下的作用:

搅拌装置：由传动装置、搅拌轴、搅拌器组成 ,由电动机和皮带传动驱动搅拌轴使搅拌器

按照一定的转速旋转 ,以实现搅拌的目的。

轴封：为搅拌罐和搅拌轴之间的动密封 ,以封住罐内的流体不致泄漏。

衷心感谢曹剑磊、赵常红、赵西云、薛峰、高亦豹、洪晨江、唐波、武

衷心感谢曹剑磊、赵常红、赵西云、薛峰、高亦豹、洪晨江、唐波、武罐体：罐体、加热装置及附件。它是盛放反应物料和提供传热量的部件。

16，根据产品的年产量计算所需发酵罐的数量，并计算发酵罐的结构尺寸

?

例如，一年产5万柠檬酸的发酵厂，发酵产酸水平平均为14%，提取总收率90%，年生产日期为300天，发酵周期为96小时。 ?

每日的产量=50000/300=166.7 吨 ?

每日所需发酵液的量=166.7/（0.14×0.9）=1322.8 米3 ?

假定发酵罐的装液系数为85% ?

则每日所需发酵罐容积=1322.8/0.85=1556米3 ?

取发酵罐的公称容积为250米3 ?

则每日需要6个发酵罐 ?

发酵周期为4天(96小时)，考虑放罐洗罐等辅助时间，整个周期为5天。 ?

则所需发酵罐的总数=5×6+1=31 个 ?

计算发酵罐的结构尺寸： ? 圆柱体容积＋封头的容积＝罐的全容积：

发酵罐总高度： 17，了解机械搅拌发酵罐的结构

好气性机械搅拌发酵罐是密封式受压设备，主要部件包括：

罐身 轴封 消泡器 搅拌器 联轴器 中间轴承 挡板 空气分布管 换热装置 人孔以及管路等

第十一章 发酵染菌的防治

1，何谓“杂菌”？

答：所谓“杂菌”， 是指在发酵培养中侵入了有碍生产的其他微生物。

2，不同染菌途径对发酵的影响

答：种子带菌：种子带菌可使发酵染菌具有延续性

空气带菌：空气带菌也使发酵染菌具有延续性，导致染菌范围扩大至所有发酵罐（延续性，扩大性） 培养基或设备灭菌不彻底：一般为孤立事件，不具有延续性

设备渗漏：这种途径造成染菌的危害性较大

3，染菌是如何影响产物提取和产品质量的

答：对过滤的影响

①菌体自溶，发酵液的粘度加大

②由于发酵不彻底，基质的残留浓度增加

造成的后果

)

(2b 0h h H H a ++=

①过滤时间拉长，影响设备的周转使用，破坏生产平衡

②大幅度降低过滤收率

对提取的影响

①有机溶剂萃取工艺：染菌的发酵液含有更多的水溶性蛋白质，易发生乳化，使水相和溶剂相难以分开

②离子交换工艺：杂菌易粘附在离子交换树脂表面或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换量

对产品质量的影响

①对内在质量的影响：染菌的发酵液含有较多的蛋白质和其它杂质。对产品的纯度有较大影响。

②对产品外观的影响：一些染菌的发酵液经处理过滤后得到澄清的发酵液，放置后会出现混浊，影响产品的外观。

4，无菌试验的目的

答：①监测培养基、发酵罐及附属设备灭菌是否彻底

②监测发酵过程中是否有杂菌从外界侵入

③了解整个生产过程中是否存在染菌的隐患和死角

判断发酵是否染菌应以无菌试验结果为根据

5，杂菌的检查方法有哪几种？各种检查方法的比较？

答：目前生产上常用的杂菌检查方法

①显微镜检查：染色——镜检

②平板划线检查：

倒平板——空培养——待测样品划线——培养观察

③酚红肉汤培养检查：

无菌肉汤培养基空培养——接入样品——培养观察

NOTE(其中后两种为无菌试验，镜检只能作为参考)

各种检查方法的比较

显微镜检查

优：简便、快速，及时发现杂菌

缺：但由于镜检取样少，视野的观察面也小，因此不易检出早期杂菌。

平板划线法和肉汤培养方法

优：比显微镜能检出更少的杂菌，而且结果也更为准确

缺：需经较长时间培养(一般要过夜)才能判断结果，且操作较繁琐

6，总染菌率

答：指一年内发酵染菌的批次与总投料批次数之比乘以100得到的百分率

7，试从不同染菌规模分析各自引起染菌的原因

答：大批发酵罐染菌：空气系统

部分发酵罐(或罐组)染菌：前期可能是种子带杂菌，或灭菌不彻底；中后期则可能是中间补料系统或油管路系统发生问题所造成的

个别发酵罐连续染菌：设备问题(如阀门的渗漏或罐体腐蚀磨损)，设备的腐蚀磨损所引起的染菌会出现每批发酵的染菌时间向前推移的现象

个别发酵罐偶然染菌：原因比较复杂，因为各种染菌途径都可能引起。

8，试从染菌分析染菌的可能原因有哪几种？

答：从染菌规模上看

衷心感谢曹剑磊、赵常红、赵西云、薛峰、高亦豹、洪晨江、唐波、武

大批发酵罐染菌：空气系统

部分发酵罐(或罐组)染菌：前期可能是种子带杂菌，或灭菌不彻底；中后期则可能是中间补料系统或油管路系统发生问题所造成的

个别发酵罐连续染菌：设备问题(如阀门的渗漏或罐体腐蚀磨损)，设备的腐蚀磨损所引起的染菌会出现每批发酵的染菌时间向前推移的现象

个别发酵罐偶然染菌：原因比较复杂，因为各种染菌途径都可能引起。

从染菌的时间来分析

发酵早期染菌：种子带菌、培养基和设备灭菌不彻底、设备或管道有死角

中、后期染菌：中间补料、设备渗漏、操作不合理

从染菌的类型来分析

耐热性芽抱杆菌：死角或灭菌不彻底

球菌、酵母：可能是从蒸汽的冷凝水或空气中带来的

浅绿色菌落(革兰氏阴性杆菌) ：发酵罐的冷却管或夹套渗漏（自来水中大量）

霉菌：灭菌不彻底或无菌操作不严格

9，种子带菌的原因可能有哪几种

答：①无菌室的无菌条件不符合要求

②培养基灭菌不彻底

③操作不当

10，无菌室的基本要求及其所要求的无菌程度

答：无菌室的基本要求

①无菌室面积不宜过大，一般约4—6米2高约2．6米。

②为了减少外界空气的侵入，无菌室要有1—3个套间(缓冲过道)

③无菌室内部的墙壁、天花板要涂白漆或采用磨光石子，要求无裂缝，墙角最好做成圆弧形（无死角）

④室内布置应尽量简单，最好能安装空气调节装置，通入无菌空气并调节室内的温湿度。

⑤无菌室的每个套间一般都用紫外线灭菌。

无菌室内无菌度的要求

把无菌培养皿平板打开盖子在无菌室内放置30分钟，根据一般工厂的经验，长出的菌落在3个以下为好。

11，造成设备泄漏可能有哪些原因

答：设备渗漏的原因

①腐蚀

发酵液中腐蚀性物质对设备的腐蚀

②磨蚀

发酵液中固体物料因搅拌桨的搅动与冷却管摩擦而引起管外壁磨损

冷却介质和加热时蒸汽的冲击，引起管内壁的磨损

③设备加工不良

弯管时，弯头处管壁变薄

焊接不良

12，盘管试漏方法有哪两种？

答：①气压试验：先在发酵罐内放满清水，用压缩空气通入管子，观察水面有无气泡产生以确定管子有否渗漏和渗漏的部位。气压法快速方便，但管子下部弯曲处积水不易排尽，有漏孔时不产生气泡就难以发现。

②水压试验：用手动泵或试压齿轮泵将水逐渐压入冷却管，泵到一定压力时，观察管子有否渗漏现象

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13，发酵罐管路的连接方式有哪三种，并对这三种连接方式进行比较

答：①螺纹连接：螺纹连接简单，但装拆较麻烦，为了便于装拆，要在管路上适当位置安装活接头(亦称“由宁”)，接头平面用石棉橡胶板或橡皮等作垫圈。由于管路受冷热和震动的影响，活接头的接口易松动，使密封面不能严密而容易造成渗漏。如在接种输液时，因液体快速流动造成局部真空，在渗漏处将外界空气吸入、空气中的菌就被带入发酵罐中而造成危害。所以，重要的管路连接大多采用法兰连接。

②法兰连接：法兰连接密封可靠，压力、温度和管径的适用范围大，但费用较高。

③焊接：焊接的方法比其他方法简便，而且密封可靠。所以空气灭菌系统、培养液灭菌系统和其他物料管路以焊接连接为好。但需经常拆卸的管路则不宜用焊接连接。

14，何谓死角

答：所谓死角是指灭菌时因某些原因使灭菌温度达不到或不易达到的局部地区。

发酵罐及其管路如有死角存在，则死角内潜伏的杂菌不易杀死，会造成连续染菌，影响生产的正常进行。

15，发酵工厂的管路采用法兰连接时，如安装或操作不当有可能会形成哪些死角

答：①法兰与管子焊接时受热不匀使法兰翘曲密封面发生凹凸不平现象就会造成死角

②垫片的内圆比法兰内径大或比较小以及安装时没有对准中心也会造成死角

16，请问下图中的管道连接方式有何不合理之处，为什么？请画出正确的连接方式

采用种子罐接种时是利用压力差将种子罐中培养好的种子输入发酵罐内，种子罐与发酵罐的一段连接管路的灭菌是与发酵罐的灭菌同时进行的。上图所示有一小段管路存在蒸汽不流通的死角，所以应在阀1的半截上装设旁通，焊上一个小的放气阀，如下图所示，此段管路即可得到蒸汽的充分灭菌。（5

分，要求适当展开论述，否则酌情扣分）

衷心感谢曹剑磊、赵常红、赵西云、薛峰、高亦豹、洪晨江、唐波、武

17，预防噬菌体感染的措施有哪些

答：①发酵罐的排气管要用汽封或引入药液(如高锰酸钾、漂白粉或石灰水等溶液)槽中。

②取样、洗罐或倒罐的带菌液体要处理后才允许排入下水道（！）。

③把好种子关，实现严格的无菌操作。

④搞好生产场地的环境卫生。车间四周要经常进行检查，如发现噬菌体即时用药液喷洒。

NOTE:（前两点最重要，及不可把活菌体排入周围环境）

18，在实际生产过程中，如何从过程检查结果分析判断染菌的原因，并提出解决的措施。

答：分析判断方法

从染菌规模上看

大批发酵罐染菌：空气系统

部分发酵罐(或罐组)染菌：前期可能是种子带杂菌，或灭菌不彻底；中后期则可能是中间补料系统或油管路系统发生问题所造成的

个别发酵罐连续染菌：设备问题(如阀门的渗漏或罐体腐蚀磨损)，设备的腐蚀磨损所引起的染菌会出现每批发酵的染菌时间向前推移的现象

个别发酵罐偶然染菌：原因比较复杂，因为各种染菌途径都可能引起。

从染菌的时间来分析

发酵早期染菌：种子带菌、培养基和设备灭菌不彻底、设备或管道有死角

中、后期染菌：中间补料、设备渗漏、操作不合理

从染菌的类型来分析

耐热性芽抱杆菌：死角或灭菌不彻底

球菌、酵母：可能是从蒸汽的冷凝水或空气中带来的

浅绿色菌落(革兰氏阴性杆菌) ：发酵罐的冷却管或夹套渗漏（自来水中大量）

霉菌：灭菌不彻底或无菌操作不严格

解决措施

总之，出现染菌情况后要合理分析，然后一个个排除。

对于设备方面，新设备使用前要先空培养，定期更换空气过滤器，要着重注意设备内有无死角，管道阀门是否泄露，缩小目标，分段排除；

对于操作方面，要对洗罐，接种，取样等操作严格操作。且要定期取样。

发生染菌之后要对染菌发酵罐进行熏罐或煮罐处理，然后通过空培养进一步确证染菌的原因。学会找交集

第十二章下游加工过程

1、下游加工过程的定义

发酵产品系通过微生物发酵过程、酶反应过程或动植物细胞大量培养获得。从上述发酵液、反应液或培养液中分离、精制有关产品的过程称为下游加工过程(Down stream processing)。它由一些化学工程

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的单几操作组成，但由于生物物质的特性，有其特殊要求，而且其中某些单元操作一般化学工业中应用较少。

2、下游加工过程的特点

培养液(或发酵液)是复杂的多相系统，含有细胞、代谢产物和末用完的培养基等。分散在其中的固体和胶状物质，具可压缩性，其密度又和液体相近，加上粘度很大，属非牛顿性液体，使从培养液中分离固体很困难。

培养液中所欲欲提取的生物物质浓度很低，但杂质含量却很高，特别是利用基因工程方法产生的蛋白质常常伴有大量性质相近的杂质蛋白质。

另一个特点是欲提取的生物物质通常很不稳定、遇热、极端pH、有机溶剂会引起失活或分解。

发酵或培养都是分批操作、生物变异性大，各批发酵液不尽相同，要求下游加工有一定的弹性。

3、对一具体发酵产品，在确定其下游加工工艺时应考虑哪些因素

1，物理性质（1）力学性质：重力、离心力、筛分；（2）热力学性质：状态变化、相平衡；（3）传质性质：粘度、扩散、热扩散；（4）电磁性质：电泳、电渗析、磁化；

2，化学性质（1）化学热力学；化学平衡；（2）反应动力学：反应速率；（3）光化学性质：激光激发、离子化；

3，生物学性质（1）分子识别：生物亲和作用、生物学识别；（2）输送性质：生物膜输送；（3）反应、响应、控制：酶反应、免疫系统。

4、发酵产品的下游加工工艺过程可分为哪四个阶段

发酵的下游加工过程可以下过程：

（1）预处理和固液分离：目的是除去发酵液中的菌体细胞和不溶性固体杂质。

（2）初步分离：目的是除去与产物性质差异较大的杂质，为后道精制工序创造有利条件。

（3）高度纯化：去除与产物的物理化学性质比较接近的杂质。

（4）成品制作：成品形式由产品的最终用途决定。

5，发酵液凝聚和絮凝的机理

凝聚是在中性盐作用下，由于双电层排斥电位的降低，而使胶体体系不稳定的现象。絮凝是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团的过程，是一种以物理的集合为主的过程。

机理：解质将胶体粒子表面上的电荷中和，减少存在于胶体粒子间的静电斥力，使伦敦·范德华(London—Vander waals)吸引力占优势，这样胶体就会凝聚成较大、较密实的粒子，或在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团使之更容易过滤。

6，影响絮凝因素有哪些

絮凝效果与絮凝剂的加量、分子量和类型，溶液的pH，搅拌速度和时间等因素有关。

在絮凝过程中，常需加入一定的助凝剂以增加絮凝效果。料液中，絮凝剂浓度增加有助于架桥充分，但是过多的加量反而会引起吸附饱和，在每个胶粒上形成覆盖层而使胶粒产生再次稳定现象。如淀粉酶发酵液的絮凝试验中，絮凝剂加量对絮凝效果(滤速)的影响如下图所示。适宜的加量通常由实验得出，虽然高分子絮凝剂分子量提高，链增长，可使架桥效果明显，但是，分子量不能超过一定的限度，因为随分子量提高，高分子絮凝剂的水溶性降低，因此分子量的选择应适当。

溶液pH的变化常会影响离子型絮凝剂中功能团的电离度，从而影响分子链的伸展形态。电离度增大，由于链节上相邻离子基团间的电排斥作用，而使分子链从卷曲状态变为伸展状态，所以架桥能力提高。例如，采用碱式氯化铝和阴离子聚丙烯酰胺搭配使用的混凝方法处理2709碱性蛋白酶发酵液，发酵液pH对阴离子聚丙烯酰胺絮凝效果的影响如下图所示。可见pH适当提高能增大滤速，这是因为聚丙烯酰胺分子链上的羧基解离程度提高，而使其达到较大的伸展程度，发挥了最佳的架桥能力。

7，在发酵工业中，常用的固液分离设备有哪几种类型

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不同性状约发酵液应选择不同的固-液分离设备。常用于发酵液的分离设备有：板框压滤机、鼓式真空过滤机、离心沉降分离机

8，错流过滤

9，微生物细胞破碎的技术有哪些

?机械方法:球磨机 ,高压匀浆器 ,X-press法 ,超声波破碎 .

非机械方法: 酶解,渗透压冲击,冻结和融化,干燥法,化学法.

10，如何选择细胞破碎的方法

细胞的数量；

所需要的产物对破碎条件(温度、化学试剂、酶等)的敏感性；

要达到的破碎程度及破碎所必要的速度，

尽可能采用最温和的方法；

具有大规模应用潜力的生化产品应选择适合于放大的破碎技术。

11，盐析的定义及其机理和优缺点

定义：在胶体溶液中加入一定量的盐溶液，会有沉淀析出的现象。

原理：在蛋白质溶液中加人中性盐后会压缩扩散双电层、降低ξ电位，即中性盐既会使蛋白质脱水，又会中和蛋白质所带的电荷，使颗粒间的相互排斥力失去，在布朗运动的互相碰撞下，蛋白质分子结合成聚集物而沉淀析出。

优缺点？

12，有机溶剂沉淀的原理和优缺点

原理？

优点：是某些蛋白质沉淀的浓度范围相当宽，所得产品的纯度较高，从沉淀的蛋白质中除去有机溶剂很方便，而且有机溶剂本身可部分地作为蛋白质的杀菌剂。

缺点：是需要耗用大量的溶剂，而溶剂的来源、贮存都比较因难或麻烦，并且沉淀操作需在低温下进行，使用上有一定的局限性，收率也比盐析法低。

13，等电沉淀的原理和优缺点

原理：蛋白质溶液的pH值等于其pI值时，则溶解度最小。蛋白质等电点沉淀法就是基于不同蛋白质离子，具有不同等电点的特性，用依次改变溶液pH值的办法，将杂蛋白沉淀除去，最后获得目标产物。在蛋白质疏水性比较大和结合水比较小时这种类型的沉淀更有效。

缺点：这个技术的最大缺点是无机酸会引起较大的蛋白质不可逆变性的危险。

14，吸附法的原理、优缺点，吸附的类型

原理：吸附法是利用吸附剂与杂质、色素物质、有毒物质、产品之间分子引力的差异，从而起到分离的作用。

优点：可不用或少用有机溶剂；操作简便、安全、设备简单；生产过程中pH变化小，适用于稳定性较差的生化物质。

缺点：可不用或少用有机溶剂；操作简便、安全、设备简单；生产过程中pH变化小，适用于稳定性较差的生化物质。

类型：

物理吸附：吸附剂和吸附物通过分子力(范德华力)产生的吸附。化学吸附：化学吸附是由于吸附剂在吸附物之间的电子转移，发生化学反应而产生的，属于库仑力范围。

交换吸附：吸附剂表面如为极性分子或离子所组成则它会吸引溶液中带相反电荷的离子而形成双电层。这种吸附又称为极性吸附。

15，影响吸附过程的因素有哪些

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衷心感谢曹剑磊、赵常红、赵西云、薛峰、高亦豹、洪晨江、唐波、武吸附剂的性质；吸附物的性质；溶液pH 值的影响；温度的影响；其它组分的影响 20，膜的清洗方法有哪两种

①机械方法：加海绵球，增大流速，逆洗(对中空纤维超滤器)，脉冲流动，超声波等。 ②化学方法

用起溶解作用的物质，如：酸、碱、酶(蛋白酶)，螯合剂，表面活性剂。

用起切断离子结合作用的方法，如改变离子强度、pH 、电位。

起氧化作用的物质，如过氧化氢、次氯酸盐。

用起渗透作用的物质，如磷酸盐、聚磷酸盐

21，纳滤的特点

纳滤（Nanofilitration ，NF ）是一种新型分离技术。水处理中心于20世纪90年代率先在国内研制成功该技术。纳滤膜在其分离应用中表现出两个显著特征：一个是其截流分子量介于反渗透膜和超滤膜之间，为200～2000；另一个是纳滤膜对无机盐有一定的截流率，因为它的表面分离层由聚电介质所构成，对离子有静电相互作用。从结构上看纳滤膜大多是复合型膜，即膜的表面分离层和它的支撑层的化学组成不同。根据第一个特征，推测纳滤膜的表面分离层可能拥有1nm 左右的微孔结构，故称之为“纳滤”。

纳滤技术的特点：

① 膜结构绝大多数是多层疏松结构；

② 分离过程无任何化学反应，无需加热，无相转变，不会破坏生活活性，不会改变风味、香味。 22，反渗透

1.什么是反渗透?

反渗透是60年代发展起来的一项新的膜分离技术,是依靠反渗透膜在压力下使溶液中的溶剂与溶质进行分离的过程.反渗透的英文全名是“REVERSE OSMOSIS”,缩写为“RO”.

2.反渗透的原理:

首先要了解“渗透”的概念.渗透是一种物理现象.当两种含有不同盐类的水,如用一张半渗透性的薄膜分开就会发现,含盐量少的一边的水分会透过膜渗到含盐量高的水中,而所含的盐分并不渗透,这样,逐渐把两边的含盐浓度融合到均等为止.然而,要完成这一过程需要很长时间,这一过程也称为渗透压力.但如果在含盐量高的水侧,试加一个压力,其结果也可以使上述渗透停止,这时的压力称为渗透压力.如果压力再加大,可以使方向相反方向渗透,而盐分剩下.因此,反渗透除盐原理,就是在有盐分的水中(如原水),施以比自然渗透压力更大的压力,使渗透向相反方向进行,把原水中的水分子压力到膜的另一边,变成洁净的水,从而达到除去水中杂质、盐分的目的.

23，萃取的分配定律

在恒温恒压的条件下，一种物质在两种成相的溶剂（A 与B ，或上相与下相）的分配浓度之比是一常数，该常数称为分配系数K 。

K

B A

C C

B A ==）中溶质的浓度下相（）中溶质的浓度

上相（

24，两水相及其优点

双水相系统是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间在水中以适当的浓度溶解会形成互不相溶的两水相或多水相系统。通过溶质在相间的分配系数的差异而进行萃取的方法即为双水相萃取双水相萃取的优点

（1）易于放大；

（2）双水相系统之间的传质过程和平衡过程快速 ,因此能耗较小 , 可以实现快速分离；

（3）易于进行连续化操作；

（4）相分离过程温和 ,生化分子如酶不易受到破坏；

（5）选择性高、收率高；

（6）操作条件温和。

25，超临界流体萃取的原理，其典型流程包括哪三种类型

原理

临界温度(Tc) ：当气体的温度高于某一数值时，任何压缩都不能使它变为液体。

临界压力（Pc）：在临界温度下，气体能被液化的最低压力。

超临界状态：当物质所处的温度高于临界温度、压力大于临界压力时

超临界流体：在临界点(指在临界温度Tc和临界压力Pc状态)附近，可以观察到一些有意义的现象：压力和温度的微小变化都会引起气体密度的很大变化。随着向超临界气体加压，气体密度增大达到液态性质，这种状态的流体称为超临界流体。其性质介于气体和液体之间。

超临界萃取：使用超临界流体作为溶剂的萃取方法，就称为超临界萃取。

超临界流体萃取的流程可分为：等温变压法；等压变温法；吸附法。

第十三章固定化细胞发酵

1，固定化细胞的定义、优缺点、分类

答：固定化细胞就是被限制自由移动的细胞，既细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并具备能被反复或连续使用的活力。是在酶固定化基础上发展起来的一项技术。

固定化细胞的优点：1），与游离细胞相比

?固定化细胞可以将微生物发酵改为连续酶反应

?可以获得更高的细胞浓度；

?细胞可以重复使用；

?在高稀释率时，不会产生洗脱现象；

?单位容积的产率高；

?提高遗传稳定性；

?细胞不会受到剪切效应的影响。

?发酵液中菌体含量少，有利与产品的分离纯化。

2），与固定化酶相比

?免去了破碎细胞提取酶的手续

?酶在细胞内的稳定性较高，完整细胞固定化后酶活性损失少

?固定化细胞制备的成本比固定化酶低

?无需辅酶再生

?固定化细胞的缺点：

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?仅能利用胞内酶；细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用；载体形成的孔隙大小影响高分子底物的通透性；可能有副反应。

?固定化细胞的分类1），按细胞类型分为三类：微生物，动物，植物 2），按生理状态分为两大类死细胞：完整细胞、细胞碎片、细胞器。适用于一种酶催化的反应。活细胞：增殖细胞、静止细胞、饥饿细胞。适用于多酶反应，特别是需要辅酶的反应。

2，细胞固定化的方法及其比较

Adsorption（吸附）covalent bonding（共价结合）Cross linking（交联）Entrapment （包埋）、Encapsulation（微胶囊）

固定化方法的比较：

1，吸附法：条件温和、方法简便、载体可再生。但操作稳定性差。

2，共价法：操作稳定性高。但由于试剂的毒性，易引起细胞的破坏。

3，交联法：可得到高细胞浓度，但机械强度低，无法再生，不适于实际应用。

4，包埋法：细胞和载体间没有束缚，固定化后，细胞仍保持较高活力。但这类方法只适用于小分子底物。

3，固定化细胞反应器的优点，主要有哪些类型答：在固定化细胞反应器中采用高稀释率有以下优点：生产强度、转化率高；与衡化器相比，固定化细胞反应器具有更好的稳定性；节省投资和能耗。

固定化细胞反应器的类型细胞再循环系统（Cell recycle systems ）填充床反应器（Fixed bed reactors ）流化床反应器（Fluidized bed reactors ）絮凝细胞系统

（Flocculated cell systems ）

第十四章基因工程菌发酵

1，基因工程

基因工程是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法，根据人们的意愿，主要是在体外进行基因切割、拼接和重新组合，再转入生物体内，产生出人们所期望的产物，或创造出具有新的遗传特征的生物类型，并能使之稳定地遗传给后代。

基因工程的核心技术是DNA的重组技术

基因工程一般分为4个步骤：

取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”；

将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA；

把重组DNA引人某种细胞；

把目的基因能表达的受体细胞挑选

2，如何获得一个工程菌

?确定目的产物。

?找出产该产物的细胞。

?将细胞破碎后提纯出全部信使RNA。这些信使中包含了该细胞内表达的所有蛋白质的合成信息。

?利用基因扩增技术（PCR），找出所需的目的基因。

?将目的基因连接到设计好的质粒载体，形成了重组DNA分子。

?将重组后DNA分子引入到受体细胞内，然后选择合适的培养条件使细胞繁殖。根据选择性标记，从菌落中筛选出目的基因的重组(工程)菌。

3，一个可用于工业化生产的工程菌必须符合哪些要求

?发酵产品是高浓度、高转化率和高产率的，同时是分泌型菌株。

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?菌株能利用常用的碳源，并可进行连续发酵。

?菌株不是致病株，也不产内毒素。

?代谢控制容易进行。

?能进行适当的DNA重组，并且稳定，重组的DNA不易脱落。

4，物理密封、生物学密封

?物理密封是将重组菌封闭于设备内，以防止传染给实验人员和向外界扩散。实验规模在20L 以下时，物理密封由密封设施、实验室设计和实验注意事项组成。密封程度分为P1、P2、P3和P4级，数字越大，密封水平越高。

?生物学密封要求用只有在特殊培养条件下才能生存的宿主，同时用不能转移至其它活细胞的载体，通过这样组合的宿主载体系统，可以防止重组菌向外扩散。按密封程度分B1和B2级，B2级的密封要求最严格。

5，和天然细胞培养过程相比，工程菌的培养过程有何特点

?工程菌工业化培养中，产物的产率往往比实验室培养规模为低。

?为提高工程菌体表达效率，需采取适当措施，提高重组DNA在受体细胞内的拷贝数及促进表达产物自细胞内向细胞外分泌。

?工程菌体的原宿主通常是某些培养物质(如某种氨基酸或维生素等)的缺陷型，有些基因工程细胞生产过程亦产生某些抑制细胞生长的代谢物。在培养过程中应考虑控制培养液营养成分及其浓度，同时采取措施，消除抑制细胞生长的代谢物，以保证细胞正常生长。

6，在工程菌中，质粒的不稳定性有哪两种类型

?分离性不稳定：这是由于在细胞分裂过程中质粒缺失分配到子细胞中而导致整个质粒丢失。

?结构性不稳定：这是由于重组质粒DNA发生缺失、插入或重排引起的质粒结构变化。

7，影响工程菌中质粒的稳定性的因素有哪些，如何提高工程菌中质粒的稳定性

?与质粒稳定有关的基因及质粒结构自身对其稳定性的影响

?宿主对质粒稳定的影响

?质粒拷贝数

?重组质粒的表达对质粒稳定性的影响

8，质粒保持率

?为考察质粒稳定性，在此引入质粒保持率Fn的概念，Fn表示分批培养中细胞分裂n次后，培养液中基因工程细胞数与总细胞数的比值，即

9，在工程菌体的培养过程中，必须要工程菌的外漏，从工程角度分析，在培养过程中，有哪些方面可能会造成工程菌的外漏

排气，

机械密封，

接种，

取样，

培养后的灭菌(通入湿热蒸气)，

排液(输至下一工序)。

第十五章动植物细胞培养

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1，动植物细胞培养与微生物细胞培养有何区别

动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞附着在固体或半固体的表面才能生长；对营养要求严格，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需有血清。动物细胞对环境敏感，包括pH、溶氧、温度、剪切应力都比微生物有更严的要求，一般须严格的监测和控制。

植物细胞对营养要求较动物细胞简单。但由于植物细胞培养一般要求在高密度下才能得到一定浓度的培养产物，以及植物细胞生长较微生物要缓慢，长时间的培养对无菌要求及反应器的设计也提出特殊的要求

2，常用的动物细胞培养方法有哪些、各自的优点

悬浮培养（批量法、半连续法、连续法）

可连续收集部分细胞进行移植继代培养，传代时无需消化分散，免遭酶类、EDTA及机械损害。

细胞收率高，并可连续测定细胞浓度，还有可能实现大规模直接克隆培养

固定化培养（吸附法、包埋法）

●细胞可维持在较小体积培养液中生长；

●细胞损伤程度低；

●易于更换培养液；

●细胞和培养液易于分离；

●培养液中产物浓度高，简化了产品分离纯化操作。

微载体（Microcarrier）培养法

将动物细胞吸附于微载体表面，在培养液中进行悬浮培养，使细胞在微载体表面长成单层的培养方法称为微载体培养法或微珠培养法

?兼具单层培养和悬浮培养的优势，且是均相培养。

?细胞所处环境均一，放大容易。

?培养操作可系统化、自动化，障低了污染发生的机会。

3，动物细胞悬浮培养法

?动物细胞在培养液中呈悬浮状态生长繁殖的培养方法谓之悬浮培养法。其培养方式有–批量法

–半连续法

–连续法

?适用于培养确立细胞株、杂交瘤细胞、肿瘤细胞、血液细胞及淋巴组织细胞，用于大量生产疫苗、α-干扰素、白介素等药品。

?此法不适于包括二倍体细胞在内的正常组织细胞的培养。

细胞悬浮培养法的优点

?可连续收集部分细胞进行移植继代培养，传代时无需消化分散，免遭酶类、EDTA及机械损害。

?细胞收率高，并可连续测定细胞浓度，还有可能实现大规模直接克隆培养

注意事项

?培养过程中，为确保细胞呈单颗粒均匀悬浮状态，需采用搅拌或气升式反应器，以较低搅拌速度及一定速度通入含5％CO2的无菌空气，保持细胞悬浮态并维持培养液溶解氧。

?此外不同细胞悬浮条件亦异，为使细胞不致凝集、成团或沉淀，在配制培养基的基础盐溶液中不加钙和镁离子。间歇或连续更换部分培养液，可维持pH值，若使用HEPES缓冲盐溶液时尚可不必连续通入含5％CO2空气。

4，动物细胞培养的条件控制有何特殊要求

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?动物细胞生长缓慢，又具有锚地依赖性，培养时为防止污染，除反应器密封性能良好外，尚需添加抗生素，培养过程还要求培养器、管道及接头处所用材质不可释放出对细胞有毒害的物质。

?在分批培养时，随着细胞生长，营养消耗，必然产生乳酸等代谢物的积累，引起细胞衰退死亡，需更换培养液或移植继代培养。

?动物细胞培养过程亦应控制一定的环境条件，如培养温度、溶解氧、pH、罐压及搅拌速度等。

?动物细胞对环境变化适应能力较微生物细胞小得多，故条件控制精密度要求更高。其中特别重要的是溶解氧和pH的控制。

5，培养植物细胞的培养基的主要组成，选择培养基的主要原则

?培养基的成分由无机盐类、碳源、维生素、植物生长激素、有机氮源、有机酸和一些复合物质组成。

?选择培养基的基本原则：

?需要根据不同培养对象、培养目的及培养条件探索适宜培养基。

?选择的培养基在培养过程使细胞总体积倍增时间1天左右为宜。

6，植物细胞大规模培养的方式有哪些

?悬浮培养法

–分批培养法

–半连续培养法

–连续培养法

?固定化培养法

7，影响植物细胞培养的因素

?细胞种质影响

?外界因素影响

–光照影响

–温度影响

–培养基成分的影响

–搅拌方式与通气的影响

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