反病毒技术
浅析网络安全技术——反病毒技术
一、引言
由于Internet的普及，互联网已经成为病毒制作技术扩散、病毒传播的重要途径，病毒开发者之间已经出现了团队合作的趋势，病毒制作技术也在与黑客技术进行融合。他们对现在的病毒对抗技术提出了挑战，因此，病毒防护技术正在发生重大的变化，概括起来说，就是病毒对抗的理论在做从作品对抗到思想对抗的转变，产品形态在从独立软件产品向操作系统的补丁转变。
二、计算机病毒及其特征
1、病毒概述
“计算机病毒”最早是由美国计算机病毒研究专家F.Cohen博士提出的。“计算机病毒”有很多种定义，国外最流行的定义为：计算机病毒，是一段附着在其他程序上的可以实现自我繁殖的程序代码。在《中华人民共和国计算机信息系统安全保护条例》中的定义为：“计算机病毒是指编制或者在计算机程序中插入的破坏计算机功能或者数据，影响计算机使用并且能够自我复制的一组计算机指令或者程序代码”。
世界上第一例被证实的计算机病毒是在1983年，出现了计算机病毒传播的研究报告。同时有人提出了蠕虫病毒程序的设计思想；1984年，美国人Thompson开发出了针对UNIX操作系统的病毒程序。1988年11月2日晚，美国康尔大学研究生罗特·莫里斯将计算机病毒蠕虫投放到网络中。该病毒程序迅速扩展，造成了大批计算机瘫痪，甚至欧洲联网的计算机都受到影响，直接经济损失近亿美元。
计算机病毒在中国的发展情况：在我国，80年代末，有关计算机病毒问题的研究和防范已成为计算机安全方面的重大课题。
计算机病毒按传染方式分为引导型、文件型和混合型病毒；按连接方式分为源码型、入侵型、操作系统型和外壳型病毒；按破坏性可分为良性病毒和恶性病毒.
计算机病毒具有刻意编写，人为破坏、自我复制能力、隐蔽性、潜伏性、不可预见性等特点，网络计算机病毒具有传染方式多、传染速度快、清除难度大、破坏性强等特点。
解说病毒和反病毒日益尖锐的斗争，让人们认识到反病毒技术的重要性和严峻性。近年来，互联网安全环境日益严峻。科技在发展，病毒也在不断演变，病毒的破坏力不仅给业界和用户带来无尽的烦恼，而且对国家信息安全构成了严重威胁。计算机病毒异常活跃，木马、蠕虫、黑客后门等轮番攻击互联网，从熊猫烧香、灰鸽子到艾妮、AV终结者，重大恶性病毒频繁发作，危害程度也在逐步加大，而此时的杀毒软件却显得应对乏力。如何准确地把握反计算机病毒的发展趋势，在与计算机病毒的斗争中占得上风，为信息安全保驾护航？业界专家及杀毒软件厂商在思索、在行动。
2、病毒的发展史
3、计算机病毒的危害
（1）计算机病毒造成巨大的社会经济损失。（2）影响政府职能部门正常工作的开展。（3）计算机病毒被赋予越来越多的政治意义。（4）利用计算机病毒犯罪现象越来越严重。
4、计算机病毒的特征
寄生性
隐蔽性
传染性
潜伏性
破坏性和表现性
主动通过网络和邮件系统传播
传播速度极快
变种多
具有黑客程序的功能
5、病毒对计算机造成的破坏
破坏文件分配表
删除文件
修改或破坏重要数据
减少磁盘空间
显示非正常信息和图像
系统不能正常存储
造成写错误
破坏磁盘文件目录
降低计算机工作速度
非法格式化
打印机故障
文件增长
改变系统正常运行过程
造成屏幕和键盘死锁
6、典型病毒介绍
（1）木马病毒
“特洛伊木马”简称木马（Trojan house ），是一种基于远程控制的黑客工具，木马通常寄生于用户的计算机系统中，盗窃用户信息，并通过网络发送给黑客。在黑客进行的各种攻击行为中，木马都起到了开路先锋的作用.
木马也采工用客户机/服务器作模式。它一般包括一个客户端和一个服务器端，客户端放在木马控制者的计算机中，服务器端放置在被入侵的计算机中，木马控制者通过客户端与被入侵计算机的服务器端建立远程连接。一旦连接建立，木马控制者就可以通过对被入侵计算机发送指令来传输和修改文件。
攻击者利用一种称为绑定程序的工具将服务器部分绑定到某个合法软件上，诱使用户运行合法软件。只要用户一运行该软件，木马的服务器部分就在用户毫无知觉的情况下完成了安装过程。
通常木马的服务器部分都是可以定制的，攻击者可以定制的项目一般包括：服务器运行的IP端口号、程序启动时机、如何发出调用、如何隐身、是否加密等。另外攻击者还可以设置登录服务器的密码，确定通信方式。服务器向
攻击者通知的方式可能是发送一个E-mail，宣告自己当前已成功接管的机器。
木马病毒的危害可以读、写、存、删除文件，可以得到你的隐私、密码，甚至你在计算机上鼠标的每一下移动，他都可以尽收眼底。而且还能够控制你的鼠标和键盘去做他想做的任何事。
木马主要以网络为依托进行传播，偷取用户隐私资料是其主要目的。而且这些木马病毒多具有引诱性与欺骗性，是病毒新的危害趋势。
(2)蠕虫病毒
作为对互联网危害严重的一种计算机程序，其破坏力和传染性不容忽视。
与传统的病毒不同，蠕虫病毒以计算机为载体，以网络为攻击对象。
根据使用者情况的不同蠕虫可分为2类：面向企业用户的蠕虫和面向个人用户的蠕虫。
按其传播和攻击特征蠕虫可分为3类：漏洞蠕虫69%，邮件蠕虫27%传统蠕虫4%。
企业类蠕虫病毒需要通过加强网络管理员安全管理水平，提高安全意识，建立病毒检测系统、建立应急响应系统，将风险减少到最低、建立备份和容灾系统等方式进行防范。对于个人用户而言，威胁大的蠕虫病毒一般通过电子邮件和恶意网页传播方式。
计算机病毒将会变得网络化、功能综合化、传播途径多样化、多平台化。
三、反病毒技术
1、反病毒技术的基本原则
（1）不存在这样一种反病毒软硬件，能够防治未来产生的所有病毒。
（2）不存在这样的病毒软件，能够让未来的所有反病毒软硬件都无法检测。
（3）目前的反病毒软件和硬件以及安全产品是易耗品，必须经常进行更新、升级。
（4）病毒产生在前，反病毒手段滞后将是长期的过程。
2、用户病毒防治实用方法
（1）学习电脑知识，增强安全意识。
（2）经常对电脑内容进行备份。
（3）开机时打开实时监控，定时对电脑文件进行扫描。
（4）经常对操作系统打补丁，对反病毒软件进行升级。
（5）一旦病毒破坏导致数据丢失，通过备份进行修复或者通过专业公司进行灾难恢复。
3、目前广泛应用的反病毒技术
（1）特征码扫描法
特征码扫描法是分析出病毒的特征病毒码并集中存放于病毒代码库文件中，在扫描时将扫描对象与特征代码库比较，如有吻合则判断为染上病毒。该技术实现简单有效，安全彻底；但查杀病毒滞后，并且庞大的特征码库会造成查毒速度下降；
（2）虚拟执行技术
该技术通过虚拟执行方法查杀病毒，可以对付加密、变形、异型及病毒生产机生产的病毒，具有如下特点：
?在查杀病毒时在机器虚拟内存中模拟出一个“指令执行虚拟机器”
?在虚拟机环境中虚拟执行（不会被实际执行）可疑带毒文件
?在执行过程中，从虚拟机环境内截获文件数据，如果含有可疑病毒代码，则杀毒后将其还原到原文件中，从而实现对各类可执行文件内病毒的查杀（3）文件实时监控技术
通过利用操作系统底层接口技术，对系统中的所有类型文件或指定类型的文件进行实时的行为监控，一旦有病毒传染或发作时就及时报警。从而实现了对病毒的实时、永久、自动监控。这种技术能够有效控制病毒的传播途径，但是这种技术的实现难度较大，系统资源的占用率也会有所降低。
病毒学论文
辽宁大学 病毒学课程综述 设计题目：关于禽流感病毒及其概述姓名：邹虎山 学号：121303111 院系：生命科学院 专业：生物技术（1）班 课程号：1330472 教师：郑方亮 2014年6月5日
关于禽流感病毒及其概述 邹虎山 （辽宁大学生命科学院生物技术1班） 摘要：禽流感是禽流行性感冒的简称，这是一种由甲型流感病毒的一种亚型引起的传染性疾病综合征，被国际兽疫局定为Ａ类传染病，又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟。不仅是鸡，其它一些家禽和野鸟都能感染禽流感。按病原体的类型，禽流感可分为高致病性、低致病性和非致病性三大类。非致病性禽流感不会引起明显症状，仅使染病的禽鸟体内产生病毒抗体。低致病性禽流感可使禽类出现轻度呼吸道症状，食量减少、产蛋量下降，出现零星死亡。高致病性禽流感最为严重，发病率和死亡率高，感染的鸡群常常“全军覆没”。最早的禽流感记录在1878年，意大利发生鸡群大量死亡，当时被称为鸡瘟。到1955年，科学家证实其致病病毒为甲型流感病毒。此后，这种疾病更名为禽流感。禽流感被发现100多年来，人类并没有掌握有效的预防和治疗方法，仅能以消毒、隔离、大量宰杀禽畜的方法防止其蔓延。高致病性禽流感暴发的地区，往往蒙受巨大经济损失。 关键词：禽流感；致病性；感染；人流感；免疫 0引言 禽流感病毒（AIV）属甲型流感病毒。流感病毒属于RNA病毒的正黏病毒科，分甲、乙、丙3个型。其中甲型流感病毒多发于禽类，一些甲型也可感染猪、马、海豹和鲸等各种哺乳动物及人类；乙型和丙型流感病毒则分别见于海豹和猪的感染。感染人的禽流感病毒亚型主要为H5N1、H9N2、H7N7，其中感染H5N1的患者病情重，病死率高。 要预防禽流感病毒，除了要勤洗手，减少接触家禽，食用家禽应当彻底煮熟以外，建议可以适当饮用星群夏桑菊。星群夏桑菊含有“夏枯草、桑叶、菊花”三味优质中药，能提高人体对禽流感病毒的抵抗力，被誉为“中药达菲”；在2009年，独家获得了国家防治流感、禽流感的专利号。 1：病原 禽流感是由A型流感病毒引起鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑等家禽的传染病，同时也是一种人畜共患病、我国将其列为一类动物传染病[1]。鸡、火鸡、鸭和鹌鹑等家禽及野鸟、水禽、海鸟等均可感染，发病情况轻重不一，从急性败血性死
病毒载体概述
病毒载体概述 引言 基因导入系统(gene delivery system)就是基因治疗的核心技术,可分为病毒载体系统与非病毒载体系统。本章主要论述用于人类基因治疗的病毒载体系统。 用于基因治疗的病毒载体应具备以下基本条件: 1、携带外源基因并能包装成病毒颗粒; 2、介导外源基因的转移与表达; 3、对机体不致病。 然而,大多数野生型病毒对机体都具有致病性。因此需要对其进行改造后才能用于人体。原则上,各种类型的病毒都能被改造成病毒载体。但就是由于病毒的多样性及与机体复杂的依存关系,人们至今对许多病毒的生活周期、分子生物学、与疾病发生及发展的关系等的认识还很不全面,从而限制了许多病毒发展成为具有实用性的载体。近20年来,只有少数几种病毒如反转录病毒(包括HIV病毒)、腺病毒、腺病毒伴随病毒、疱疹病毒(包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)、甲病毒等被成功地改造成为基因转移载体并开展了不同程度的应用。 第一节病毒载体产生的原理 病毒载体的产生建立在对病毒的生活周期与分子生物学认识的基础之上。研究病毒载体首先要对病毒的基因组结构与功能有充分的了解,最好能获得病毒基因组全序列信息。病毒基因组可分为编码区与非编码区。编码区基因产生病毒的结构蛋白与非结构蛋白;根据其对病毒感染性复制的影响,又可分为必需基因与非必需基因。非编码区中含有病毒进行复制与包装等功能所必需的顺式作用元件。 各种野生型病毒颗粒都具有一定的包装容量,即对所包装的病毒基因组的长度有一定的限制。一般来说,病毒包装容量不超过自身基因组大小的105～110％。
基因重组技术的发展使病毒载体的产生成为可能。最简单的做法就是,将适当长度的外源DNA插入病毒基因组的非必需区,包装成重组病毒颗粒。比如,本实验室曾将4、5kb的lacZ基因表达盒 (CMV-lacZ-polyA)插入HSV1病毒的UL44(糖蛋白C)基因的XbaI位点中,病毒基因组的其余部分不改变,构建成重组病毒HSV1-lacZ100(吴小兵等,1998)。由于UL44基因产物对于HSV病毒在培养细胞中产毒性感染就是非必需的,因此,该重组病毒可以在细胞中增殖传代。用这种重组病毒感染细胞,能将lacZ基因带入细胞并高效表达。用同样的方法,将AAV-2病毒的rep与cap基因片段(4、3kb)插入HSV1病毒的UL2(编码尿嘧啶DNA糖基化酶)或UL44(编码糖蛋白C)基因中,构建成具有提供重组AAV载体复制与包装所需的全部辅助功能的辅助病毒rHSV-rc(伍志坚等,1999)。 然而,这样的重组病毒作为基因转移载体有许多缺点。首先,许多野生型病毒通过在细胞中产毒性复制而导致细胞裂解死亡;或带有病毒癌基因而使细胞发生转化。因此必须经过改造使其成为复制缺陷性病毒并且删除致癌基因后才能用于基因治疗。其次,插入外源DNA的长度受到很大限制,尤其对于基因组本身较小的病毒如腺病毒伴随病毒(AAV,4、7kb)、反转录病毒(8～10kb)、腺病毒(36kb),如果不去除病毒基因,可供外源DNA插入的容量就十分小。因此,必须删除更多的病毒基因以腾出位置插入较大的外源DNA。为了增加病毒载体插入外源DNA的容量,除了可以删除病毒的非必需基因外,还可以进一步删去部分或全部必需基因,这些必需基因的功能由辅助病毒或包装细胞系反式提供。 病毒载体大体上可分为两种类型: 重组型病毒载体:这类载体就是以完整的病毒基因组为改造对象。一般的步骤就是选择性地删除病毒的某些必需基因尤其就是立早基因或早期基因,或控制其表达;缺失的必需基因的功能由互补细胞反式提供;用外源基因表达单位替代病毒非必需基因区;病毒复制与包装所需的顺式作用元件不变。这类载体一般通过同源重组方法将外源基因表达单位插入病毒基因组中。如在传统的重组腺病毒构建方法中,将外源基因表达盒(exogenous gene expression cassette)插入穿梭质粒(如pXCX2或pFGdX1)的腺病毒同源序列中,与辅助
植物病毒检测技术研究进展汇总
植物病毒检测技术研究进展 刘茂炎 摘要：随着现代技术的发展特别是分子技术的发展，鉴定和检测病毒的方法越来越多，也越来越精确快速。以PCR为基础的基因工程技术已经广泛应用于病毒核酸分子的鉴定，其高灵敏度和高特异性是与PCR扩增反应的特异性引物相关联的；于此同时传统的鉴定检测技术依然有其发展优势。不论怎样的方法技术，都是以病毒的理化性质以及侵染性为基础的。在此基础上，甚至出现了某些边缘技术在病毒鉴定检测方面的应用。本文主要综述的是对植物病毒鉴定检测技术的研究进展。 关键词：植物病毒；检测技术；PCR 病毒在生物学上特征（如病毒的理化性质，包括病毒粒子的形态、大小、对理化因子的耐受性等）以及在寄主上的反应（如寄主范围、症状表现、传播方式等）是对病毒最直观的认识。常规的对植物病毒的鉴定检测方法有：生物学测定方法、血清学技术、电子显微镜技术、分子生物学技术等。生物学测定依据病毒的侵染性，观察寄主植株或其它生物的症状表现；血清学技术以病毒外壳蛋白(CP)为基础；电子显微镜技术依据病毒的形状大小的不同；分子生物学鉴定则以病毒核酸为基础。 1.生物学鉴定 最直接的方法是目测法，直接观察病毒对植物的病害症状。如烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV），病害症状为叶上出现花叶症状，生长陷于不良状态，叶常呈畸形；玉米鼠耳病的诊断主要依据田间症状表现[1]。目测法因观察的主观性和症状的不确定性的影响而不精准。1929年美国病毒学家霍姆斯（Holmes）用感病的植物叶片粗提液接种指示植物，2~3天后接种叶片出现圆形枯斑，枯斑数与侵染性病毒的浓度成正比，能测出病毒的相对侵染力，对病毒的定性有着重要的意义，这种人工接种鉴定的方法就是枯斑和指示植物检测法。国内报道的水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf fijivirus，RBSDV)可侵染28属57种禾本科植物，该病毒的主要传毒介体是灰飞虱(Laodelphax striatella)，
病毒防范
病毒防范的新思路 随着IT 技术的不断普及，Internet 网络的高速发展，计算机病毒已经成为了IT 资源使用和互联网的最大威胁，越来越多的新病毒新攻击不断涌现，给公司个人都带来了不可估量的损失，而我们能够采取的防御措施和方法却相对单调，主要是采用各种防病毒产品来疲于应对。另外，对于防病毒软件效用的争论也有愈演愈烈之势。我们知道，目前所有的主流防病毒产品都是以分析病毒特征码为基础, 通过升级安装在用户端的病毒特征码数据库实现对病毒的辨识。只有发现和确认了病毒之后，才能比较准确地完成病毒的清除工作。这种工作模式多年来被证明是成熟和可靠的．但是环境的变化正在对这种可靠性提出严峻的考验, 因为这种模式的最大问题就是病毒的发现和病毒库升级的发布要滞后于病毒感染行为最近几年利用系统漏洞传播的蠕虫病毒成为了病毒世界的主流，其传播速度相当惊人。最新的蠕虫病毒每小时就已经可以感染数万台计算机。一台连接到互联网的存在漏洞的计算机往往在不超过30 分钟的时间就会被感染。在这种情况下，以往非常奏效的特征码识别病毒库升级的防御方式难免显得力不从心。越来越多的网络安全人士认为，滞后于病毒出现的反应方式是一种非常被动的方式，已经越来越难以满足用户的需要。 另外，我们发现最新形式的病毒通常都是以网络病毒的形式出现，并且更多的是以混合攻击的方式存在，例如，包含键盘记录软件、BOT 控制程序等等。而且“病毒”的范畴也从以前的破坏主机信息的定义，扩大为一切对信息有威胁的范围，例如，最新涌现的间谍软件、灰色软件、犯罪软件、欺诈程序、恶作剧程序、诈骗程序等等。不难看出单单从一套单机使用的防病毒软件已经完全无法满足目前以及将来对病毒防范的需要。所以我们需要一些防病毒的新方法和新手段来解决我们目前所面临的困境。 一、联合其他安全产品全方位立体交叉的病毒防范 由于目前病毒的主要形式已经从几年前的单台主机的病毒发展成了现在的以网络病毒、蠕虫为主，相信未来病毒的发展趋势也将会更多地以网络病毒的形式出现。而这些网络病毒存储、传播、感染的方式各异，有利用网页方式进行传播的，有通过系统漏洞进行加载的，还有的可能通过M S N，O u t l o o k 等应用程序进行扩散，因此在构建网络防毒系统时不给病毒留下任何藏身空间，使网络免受病毒的入侵和危害。先进的多层病毒防护策略应具有以下三个特点。第一，层次性。在用户桌面、服务器、邮件服务器以及因特网网关安装适当的防毒部件，以网为本，多层次地最大限度地发挥作用。第二，集成性。所有的保护措施是统一的和相互配合的，支持远程集中式配置和管理。第三，自动化。系统能自动更新病毒特征码数据库和其他相关信息。 1、ISP 的反病毒服务 一直以来防病毒的工作都是由个人和企业自己完成的，而Internet 服务提供商通常由于种种原因并不提供防病毒的服务，但是这个层次的防病毒服务我们还是很需要的。现在已经有各个I C P 提供邮件服务器的防病毒服务，同样, 我们设想将来的ISP 在提供Internet 线路租用的同时也可以提供基本的防病毒功能，至少可以实现40％－60% 的病毒的查杀。而且各个主要的I S P 将可以通过一定的协议，来共同发现攻击型病毒，例如DDoS 的攻击病毒，可以自动地进行屏蔽和限制。 2、在网关处的防范
计算机病毒原理及防范技术(精简版)
《计算机病毒原理及防范技术》----秦志光张凤荔刘峭著 43.8万字 第1章计算机病毒概述 1.1.1计算机病毒的起源----第一种为科学幻想起源说，第二种为恶作剧，第三种为戏程序（70年代，贝尔实验室，Core War）, 第四种为软件商保护软件起源说。 1.计算机病毒的发展历史-----第一代病毒，传统的病毒， 第二代病毒（1989-1991年），混合型病毒（或“超级病毒”），采取了自我保护措施（如加密技术，反跟踪技术）；第三代病毒(1992-1995年)多态性病毒（自我变形病毒）首创者Mark Washburn-----“1260病毒”；最早的多态性的实战病毒----“黑夜复仇者”（Dark Avenger）的变种MutationDark Avenger ；1992年第一个多态性计算机病毒生成器MtE,第一个计算机病毒构造工具集（Virus Construction Sets）----“计算机病毒创建库”（Virus Create Library）, ”幽灵”病毒；第四代病毒（1996-至今），使用文件传输协议（FTP）进行传播的蠕虫病毒，破坏计算机硬件的CIH，远程控制工具“后门”（Bank Orifice）,”网络公共汽车”（NetBus）等。 2.计算机病毒的基本特征----1.程序性（利用计算机软、硬件所固有的弱点所编制的、具有特殊功能的程序），2、传染性，3、隐蔽性（兼容性、程序不可见性）4、潜伏性（“黑色星期五”，“上海一号”，CIH）,5、破坏性，6、可触发性，7、不可预见性，8、针对性，9、非授权可执行性，10、衍生性。 1.2.2.计算机病毒在网络环境下表现的特征------1.电子邮件成主要媒介（QQ，MSN等即时通讯软件，可移动存储设备，网页，网络主动传播，网络，“钓鱼”），2.与黑客技术相融合（“Nimda”,CodeRed,”求职信”），3.采取了诸多的自我保护机制（逃避、甚至主动抑制杀毒软件），4.采用压缩技术（压缩变形----特征码改变，压缩算法，“程序捆绑器”），5.影响面广，后果严重，6.病毒编写越来越简单，7.摆脱平台依赖性的“恶意网页”。 1.2.3.计算机病毒的生命周期----1.孕育期（程序设计，传播），2.潜伏感染期，3.发病期，4.发现期，5.消化期，6.消亡期。 第2章计算机病毒的工作机制 2.1.1计算机病毒的典型组成三大模块-----1.引导模块（将病毒引入计算机内存，为传染模块和表现模块设置相应的启动条件），2.感染模块（两大功能-----1.依据引导模块设置的传染条件，做判断；2启动传染功能）， 3.表现模块（两大功能----依据引导模块设置的触发条件，做判断；或者说表现条件判断子模块 2.1启动病毒，即表现功能实现子模块） 2.2.1计算机病毒的寄生方式-----1.替代法（寄生在磁盘引导扇区）；2.链接法（链接在正常程序的首部、尾部、或中间）。 2.2.2．计算病毒的引导过程-----1。驻留内存，2.获得系统控制权， 3.恢复系统功能。 2.4.1.计算机病毒的触发机制----1.日期，2.时间， 3.键盘 4.感染触发， 5.启动， 6.访问磁盘次数， 7.调用中断功能触发， 8.CPU型号/主板型号触发。 第三章计算机病毒的表现 3.1.计算机病毒发作前的表现----1.经常无故死机，操作系统无法正常启动，运行速度异常， 4.内存不足的错误， 5.打印、通信及主机接口发生异常， 6.无意中要求对软盘进行写操作， 7.以前能正常运行的应用程序经常死机或者出现非法错误， 8.系统文件的时、日期和大小发生变化， 9.宏病毒的表现现象，10、磁盘空间迅速减少，11.网络驱动器卷或者共享目录无法调用，陌生人发来的电子邮件，13.自动链接到一些陌生的网站。
植物的病毒检测技术
植物的病毒检测技术 植物病毒病害是一类重要病害,几乎在各类作物上都有发生,严重影响农作物的产量和质量,用一般的方法难以防治,是生产上的一大难题。种植无病毒种子、苗木是一种非常有效的防治措施。因而如何对种子、苗木等无性繁殖材料以及在发病早期对植株进行快速准确地检测诊断就显得尤为重要。最初植物病毒检测主要依靠生物学性状,但生物学方法费时费力,检测周期长,而且易受环境条件的影响,反应不稳定、重复性差。目前植物病毒检测主要是血清学检测(以病毒外壳蛋白为基础)和核酸检测,前者主要包括ELISA、快速免疫滤纸测定、免疫胶体金技术、免疫毛细管区带电泳、免疫PCR 等;后者主要有PCR、分子信标、实时RT-PCR和核酸杂交等。 1 血清学检测方法 1．1 酶联免疫吸附测定(ELISA) 酶联免疫吸附测定是一种采用固相(主要为聚苯乙烯酶联板) 吸附,将免疫反应和酶的高效催化反应有机结合的方法,其基本原理是以酶催化的颜色反应指示抗原抗体的结合。该方法首先将同源特异抗体吸附在反应器皿底部，加入欲测试的含病毒的样品，病毒与抗体结合，病毒颗粒被固定，再加入标记的特异抗体和酶的底物，酶与底物反应后会出现有颜色的溶液其强度与病毒浓度成正比，用此方法可测定出病毒的浓度。ELISA方法简单,灵敏度高,特异性强,适于大量样品的检测,目前该方法已被广泛用于植物病毒检测。在此基础上加以改进又发展了一些新的检测方法,如A 蛋白酶联吸附(SPA-ELISA)、斑点免疫吸附(DIBA)、直接组织斑免疫测定( IDDTB) 、伏安酶联免疫分析[1]、快速ELISA 等。 1．2 快速免疫滤纸测定法(Rapid immuno-filter paper assay , RIPA) 快速免疫滤纸测定类似乳胶凝集反应,其原理是把待测病毒的抗体吸附在乳胶颗粒上,通过大颗粒乳胶间接反应小颗粒病毒的存在。所不同的是RIPA使用了一种红色乳胶,从而使检测更加简单和直观。RIPA[2]目测检测提纯TMV 的灵敏度分别可达 5ng/ml～50ng/ml 。 1.3 免疫胶体金技术( Immunogold2label as2say) 免疫胶体金技术最早起源于电镜方面的研究,由于金在生物学上是惰性的,且有良好的电荷分布,可以和蛋白质(如抗体、A 蛋白等)紧密结合,因此广泛应用于生物学和微生物学的各个领域。其原理是用柠蒙酸钠将氯金酸金离子还原为胶体金。胶体金颗粒在适当的条件下,以静电、非共价键方式吸附抗体IgG(或A蛋白)分子,从而形成稳定的IgG(或A蛋白) - 胶体金复合物。通过抗原抗体特异性结合,抗体(或A蛋白)胶体金复合物就可以结合在抗原上。金颗粒吸附在病毒粒体周围,从而得到明显的鉴别性和可见度[3] 。 随着技术的发展,1971年Taylor 等报道了免疫金染色技术( Immunogold staining) ,1981年Danscher又创建了免疫金- 银染色技术( Immunogold-silver staining) 。自1983年首次成功使用胶体金标记的抗体检测植物病毒以来,该技术逐渐被应用于植物病毒的检测。20 世纪80年代发展起来的斑点免疫金渗滤试验(Dot immunogold fitration assay) 是一种快速免疫胶体金诊断技术,该技术以硝酸纤维素膜为载体,利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用,使抗体抗原反应和洗涤在一特殊的渗滤装置中迅速完成,从而大大缩短了检测时间。在此基础上,又建立了更为简
病毒及其疫苗的生产制备技术
第25章病毒及其疫苗的生产制备技术 第一节病毒的生产制备 病毒需在活的敏感细胞中才能增殖，在细胞培养技术不成熟之前，人们为研究病毒，往往采用鸡胚接种或动物接种的方法来分离、鉴定病毒或制备一定量的病毒液，但这种方法因个体和种属差异，不仅许多病毒难以找到合适的敏感动物，而且即使在敏感动物中繁殖，往往个体差异大而影响结果的判定，随着细胞培养技术的发展，首先在病毒学研究方面获得了广泛的应用，为病毒的繁殖、鉴定提供了来自不同动物（包括人）、不同组织的细胞来源，通过敏感性筛选，目前绝大多数病毒均可有相应的敏感细胞，为病毒的分离、鉴定和增殖创造了条件。同时也为病毒的大量生产提供了细胞来源，随着细胞大量生产技术的发展，因此对病毒来说只要有敏感的细胞，就可以进行大规模生产。 一、病毒生产的目的和用途 1、为了制备大量的病毒抗原，以制备病毒的亚单位疫苗或表面抗原疫苗，或用病毒抗原制备免疫血清（抗体）。 2、为了制备病毒的减毒活疫苗或灭活的死疫苗，以用于预防接种。 3、为了生产基因改造后或重组有其它多肽因子的病毒，以用于基因治疗或杀肿瘤治疗及基因疫苗的预防接种。 4、为了制备干扰素的病毒诱生剂（NDV、仙台病毒等），用于干扰素的生产。 5、生物战用的病毒生物战剂。常选用毒力强、抵抗力强、对不同国家人群最敏感的病毒，又能通过气溶胶或昆虫和污染的水土进行传播的病毒。这是战争狂们正在开展的研究，应警惕。 二、病毒生产制备的方法 1、动物接种，如狂犬病毒、脑炎虫媒病毒采用鼠、兔脑内接种后收取脑组织制成悬液。 2、鸡胚、鸭胚接种：如流感病毒、副流感病毒（NDV-F）、仙台病毒等，目前尚无敏感细胞，常采用9～10日胚龄的尿囊腔接种，37℃孵育72小时收获尿液，用鸡红血球测定血凝效价。Q热用7日龄鸭胚进行卵黄囊接种收获卵黄囊，马脑炎病毒常采用10日龄鸡胚体接种，收获全胚体液等。 3、细胞培养法（详见第二篇第18章） 不同的病毒选用相应的敏感细胞，采用转瓶培养、多层培养、微载体培养或悬浮搅拌培养等方法,先大量增殖细胞，然后接种一定量的病毒,继续培养适当时间时，冻融细胞后，离心收获上清。 以上病毒大量生产后可制作病毒疫苗（死疫苗或减毒活疫苗），也可用来作干扰素诱生剂或提取病毒表面抗原成分，但反对用作生物战剂，危害人类健康和生命。 第二节病毒疫苗的生产制备 病毒疫苗的生产制备与病毒的生产制备基本相同，目前进行人工主动免疫，用于病毒病预防的疫苗有灭活疫苗（Killed Vaccine）,又称死疫苗，减毒活疫苗（Live Vaccine）,亚单位疫苗，多肽疫苗、基因缺失的减毒活疫苗，基因工程亚单位疫苗，重组牛痘多价疫苗。
LAMP技术在病毒检测中的应用
LAMP技术在病毒检测中的应用 发表时间：2013-01-31T16:04:31.107Z 来源：《医药前沿》2012年第31期供稿作者：吴昊1 孙立新2 叶松1 陆军1 杨庆贵2 [导读] LAMP（Loop-mediated Isothermal Amplification）环介导等温扩增技术，是近年来新兴的分子生物学检测技术 吴昊1 孙立新2 叶松1 陆军1 杨庆贵2 （1安徽理工大学医学院病原生物教研室安徽淮南 232001） （2江苏出入境检验检疫局医学媒介生物监测实验室江苏南京 210001） 【摘要】LAMP（Loop-mediated Isothermal Amplification）环介导等温扩增技术，是近年来新兴的分子生物学检测技术。因其特异性强、等温扩增，反应灵敏、操作简单、产物易检测，此项技术已被用于多种病原微生物的检测。本文综述了LAMP技术的原理以及其在几种常见病毒检测项目中的应用。 【关键词】 LAMP 技术原理病毒检测 【中图分类号】R319 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）31-0064-02 病原微生物带来的卫生问题时常出现，各种检测手段也不断更新。但由于非特异性扩增、反应操作程序复杂、及仪器昂贵等问题，很多方法在疾病爆发时筛查现场和监测站点的应用受到限制。 LAMP技术是由日本学者Notomi等[1]在2000年开发的一种新型快速的扩增技术，它能在一定温度范围内，通过一个步骤在短时间内对目的片段进行大量有效扩增。其具有高特异性、高效性、快速、低成本、易检测、结果易观察等特点，被广泛用于各种病原体检测和研究中并取得了一定的成就。 1 LAMP技术原理 1.1 扩增机制 LAMP技术利用能够特异性识别靶序列上的6个独立区域的两对内、外引物，及具有链置换活性的BstDNA聚合酶启动循环链置换反应来进行靶序列的扩增[1]。反应中，先由外部引物将内部引物扩增所需要的模板扩增出来，然后由内部引物对靶基因片段进行引导合成。由于内部引物所扩增出的片段含有与该引物5’端DNA片段的反相互补序列，因此这些反相互补序列之间形成茎-环结构，同时，另外一条内部引物与也可形成茎-环结构，片段的两端形成哑铃状结构，如此循环往复的过程最后形成花椰菜形状的茎-环结构，可在15min-60min之内实现109-1010倍的括增[2]。 1.2 结果观察 扩增后可以通过琼脂糖电泳后染色进行观察，更可通过扩增衍生物焦磷酸镁进行观察：阳性的样本会出现白色浑浊沉淀，而阴性则无此现象。同时也可以应用SYBR Green I染色，呈现绿色的为阳性，橙色的为阴性[2]。 2 病毒检测 2.1 日本脑炎病毒 日本脑炎又称乙脑，是由日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus)引起的一种常见的蚊媒传染病。JEV的检测方式很多，如血清学，病毒分离等，但耗时繁琐、敏感性特异性都较低。TORINIWA等[3]利用LAMP技术原理建立了快速Real-time RT-LAMP方法，该方法通过扩增JEV病毒的包膜（E）蛋白基因来定量检测JEV病毒，可将检测用时缩短至1h，检测下限为1PFU并与常规RT-PCR具有相似的敏感性。且不需特殊设备、操作方便，有利于推广其在基层的应用。 2.2 西尼罗河病毒 西尼罗河病毒（West Nile Virus，WNV）是引起西尼罗河热的病原体，近年来在世界部分地区的流行并造成了重大的损失。PARIDA 等[4]创立了一种一步法来检测WNV，通过凝胶电泳或者浊度仪来对扩增结果进行判定。结果显示其敏感性比常规RT-PCR高10倍。 2.3 甲型流感病毒 甲型流感病毒（AIV)具有高度传染性，致病性，以及致死率。对甲流病毒的检测方法主要为病毒分离，抗原和抗体检测以及PCR方法，但是过程费时繁琐。POON等[5]设计了特异性引物，利用LAMP技术成功的检测了H1-H3型的AIV，与PCR方法比较阳性符合率为100%，敏感度可达传统方法的100倍。LAMP技术由于其检测的简便快速且高度敏感，可更多的用于现场检测。 2.4 禽流感病毒的检测 禽流感是由禽类A型流感病毒引起的一种急性、高接触性的传染病，可带来重大损失。禽流感检测方法有各类血清学试验以及免疫学实验等。这些方法都存在着如试验周期较长，操作繁琐，检测材料受限制等不足。国内李启明等[8]对H5N1亚型禽流感病毒进行了RT-LAMP检测，验证和分析后证明其特异性与常规方法一致，并且其灵敏度可达到10个拷贝。侯佳蕾等[6]根据H5亚型禽流感病毒血凝素基因序列设计了引物，并建立了一种针对性的检测诊断方法。结果表明，该方法的灵敏度高于一步RT-PCR法。 2.5 口蹄疫病毒的检测 口蹄疫是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一种急性，热性，高度接触性传染病，主要侵害偶蹄兽并给经济带来极大威胁。血清学检测不足以确定整群动物是否带毒而PCR方法由于需要专门的仪器。吴绍强等[7]以灭活的亚洲I型口蹄疫细胞培养病毒为材料，设计引物并建立了口蹄疫病毒RT-LAMP检测法，为口蹄疫现场快速检测提供了有效的方法。 2.6 丙型肝炎病毒（HCV）的检测 HCV是一种常见的病毒，传播途径为母婴传播和血液传播。目前最常用的方法是ELLSA法检测抗原抗体或PCR法。但是由病毒的抗原量极少，所以常规免疫学方法常无法检测出病毒。PCR方法操作复杂繁琐，特异性较低。李启明等[8]利用LAMP技术的原理，利用特殊引物进行了LAMP扩增，成功的检测HCV基因，实验结果阳性符合率高达98%。这一成果证实了LAMP技术的优势。 2.7 严重急性呼吸窘迫综合征冠状病毒（SARS-CoV）的检测 SARS带来的阴影提醒人们对此类病毒检测的重要性。目前临床上对其检测的方法主要有2种。一是检测SARS-CoV抗体，虽然此法灵敏度较高，但在发病初期不能检出。二是Real-time PCR，这种方法可在发病早期检测出SARS-CoV，但是其需要熟练操作技术以及高成本仪器，不适于常规筛查。POON等[9]利用改良LAMP法对人群的鼻咽分泌物样本进行了检测。结果显示SARS病人中的SARS-CoV检出率为
反病毒技术现状及发展趋势
反病毒技术现状及发展趋势 【背景】 由于Internet的普及，互联网已经成为病毒制作技术扩散、病毒传播的重要途径，计算机病毒已成为当代信息社会的致命杀手，正所谓道高一尺，魔高一丈，病毒像幽灵一样，无处不在。病毒开发者之间已经出现了团队合作的趋势，尤其是病毒与黑客技术相结合，使其对抗反病毒技术的能力越来越强。面对这种严峻形势，人们急需要了解病毒的特征和反病毒技术，做到防杀结合，才能立于不败之地。 一、计算机病毒的产生 1983 年11 月，世界上第一个计算机病毒在美国实验室诞生，1986 年，巴基斯坦两兄弟为追踪非法拷贝自己软件的人，又制造了世界上第一个传染个人电脑兼容机的“巴基斯坦”病毒。1988 年，计算机病毒开始传入我国，在短短几个月之内迅速感染了全国20 多个省、市的计算机。 二、计算机病毒的特点 1．电子邮件已成为病毒快速传播的主要媒介 前期，病毒只能通过软盘或光盘在计算机之间传播，而在网络中则可以通过网络通讯机制迅速扩散。1989 年，FORM 引导区病毒用了整整一年时间才流行起来，而通过电子邮件，Sircam 病毒一周之内就使全球数以万计的计算机用户受到波及，Nimda 更是用了不到30分种。电子邮件在为信息社会提供方便的同时，也使计算机病毒找到了一条新的传播途径和载体。 2．病毒与黑客技术相互融合 病毒结合黑客技术利用系统漏洞进行双重攻击的方式，已经成为病毒编码的新趋势。这类病毒更具伪装性、主动性和破坏性，所造成的威胁不容忽视。2001 年引起轩然大波的“尼姆达”、“红色代码”和“求职信”病毒就是典型的黑客型病毒。 3．病毒采取了诸多自我保护机制 计算机病毒为了能够躲避现有病毒检测技术，争取较长的存活期，进而实现广泛传播的目的，想尽各种办法隐蔽和保护自己，蠕虫病毒更是采取主动抑制杀毒软件的手段，加强对反病毒技术的对抗。 4．大量采用压缩技术 目前的大部份病毒都是在原生病毒的基础上，经压缩变形而成。压缩后的病毒内容虽然同原生病毒一模一样，但病毒特征代码已经完全改变，相当于产生了一个新的变种病毒。 5．影响面广，后果严重 病毒，尤其是蠕虫病毒轻则降低网络速度，影响工作，重则使之崩溃，破坏数据，使多年工作毁于一旦。据Computer Economics 的统计，仅红色代码病毒就吃掉了全球电脑用户26 亿美元，其中11 亿美元用于对100 万台以上的受感染服务器进行清理和对800 万台以上的其它服务器进行检查。 6．病毒编写越来越简单 传统病毒的编程技术比较复杂，往往需要编程者对系统有深入的了解才行，但是病毒自动生产技术的产生，使得对计算机病毒一无所知的用户，也能随心所欲地组合出算法不同、功能各异的计算机病毒。 7．恶意网页给传统的病毒定义带来了新的挑战 随着Internet 的逐步普及，又出现了能够摆脱平台依赖性的“恶意网页”，它们以ActiveX 技术和java Applet 为载体，潜伏在HTML 网页里面，用户只要浏览这类网页，恶意程序就会悄然自动下载到硬盘中。
网络安全中蠕虫病毒技术与防范措施研究概要
网络安全中蠕虫病毒技术与防范措施研究 摘要：蠕虫的大规模爆发，引起的Internet 安全威胁事件每年以指数增长，近年来的增长态势变得的尤为迅猛。所以对蠕虫病毒的检测防范有着重要的意义。 关键词：蠕虫网络安全病毒异常检测 1引言 随着信息化的发展，网络已经渗入到人们生活的各个领域。人们可以在Internet上享用大量的信息资源，但与此同时，人们也受到一些恶意代码的攻击。自1988年第一个蠕虫病毒开始在局域网内活动到1998年底的第一个Internet网上传播的蠕虫病毒(appy99)，就向人们展示了他的巨大破坏力。所谓网络蠕虫是一种能够独立运行，并能通过寻找和攻击远方主机的漏洞进行自主传播的恶意代码。他不同于病毒。具有他自己独特的传播方式和巨大的破坏力。进入２１世纪蠕虫病毒先后在全世界引起了几次很大轰动。像我们熟悉的“冲击波”蠕虫、Nimda蠕虫、狮子蠕虫等等。都给人们留下了深刻的印象。这些都引起了网络安全人员的广泛关注。 2网络蠕虫的特性 网络蠕虫的传播与生物中蠕虫病毒的传播存在相似性，因此对于网络蠕虫的传播同样可以套用生物病毒传播的模型来表示：其中I(t)表示中已经被感染的计算机的数量，S(t)表示网络中存在漏洞、可以被蠕虫感染计算机的数量，表示影响蠕虫传播的因素。公式左边是被感染的计算机数量的增量与单位时间的比值，也就蠕虫传播的速度。从公式中很直观的看出，公式右边三个因子中任何一个因子的减小都会降蠕虫的传播速度。 所以从蠕虫的传播模式和特征行为，我们可以得出蠕虫在传播过程中所共有的一些特征： （1）单一性：大量相同的数据包在蠕虫爆发初期出现，这是由于蠕虫发出的扫描包大多数是相同的，另外蠕虫在进行复制时传输的文件也是相同的。 （2）自主性：网络上感染规模不断增大这是由于蠕虫是自主传播，不受管理员的干涉，被感染主机数量以及扫描都呈指数级迅速增长。这个可以有上边的模型看出。 （3）随机性：被感染主机会随机探测某个地址的固定端口，网络上会出现大量目标地址不可达或连接请求失败。 （4）利用软件漏洞，造成网络拥塞，系统消耗资源，留下安全隐患的特性。 3蠕虫的运行技术介绍 2003年8月12日爆发的“冲击波”蠕虫是利用RPC(remote procedure call)漏洞攻击计算机。RPC是Windows操作系统使用的一个应用层协议，它提供了一种进程间通信机制。而“冲击波”蠕虫就是利用RPC存在的漏洞对计算机进行攻击的，它会不断的扫描网络中存在RPC漏洞的计算机进行攻击，一旦攻击成功，蠕虫就会传输到该计算机上并运行。感染的主机可能造成RPC服务终
病毒检测技术复习题含答案
病毒检测技术复习题含 答案 Standardization of sany group #QS8QHH-HHGX8Q8-GNHHJ8-HHMHGN#
一、填空 1.程序性决定了计算机病毒的可防治性、可清除性，反病毒技术就是要提前取得计算机系统的控制权，识别出计算机病毒的代码和行为，阻止其取得系统控制权，并及时将其清除。 2.是否具有传染性，是判别一个程序是否为计算机病毒的首要条件。 3.计算机病毒因某个事件或数值的出现，诱使病毒实施感染或进行攻击的特性称为可触发性 4.病毒程序嵌入到宿主程序中，依赖于宿主程序的执行而生存，这就是计算机病毒的寄生性、病毒的最大特点是其传染性，而传染性的原因是其自身程序不断复制的结果，即程序本身复制到其他程序中或简单地在某一系统中不断地复制自己 5.计算机病毒按寄生对象分为引导型病毒文件型病毒混合型病毒 6.蠕虫(Worm)是一种独立的可执行程序，主要由主程序和引导程序两部分组成 7.蠕虫程序的工作流程可以分为漏洞扫描、攻击、传染、现场处理四个阶段 8.特洛伊木马(Trojan house，简称木马)是指表面上是有用的软件、实际目的却是危害计算机安全并导致严重破坏的计算机程序，是一种在远程计算机之间建立连接，使远程计算机能通过网络控制本地计算机的非法程序 9.一般的木马都有客户端和服务器端两个程序 10.客户端是用于攻击者远程控制已植入木马的计算机的程序 11.服务器端程序就是在用户计算机中的木马程序
12.计算机病毒英文命名规则也就是国际上对病毒命名的一般惯例为“前缀+病毒名+后缀”，即三元组命名规则 13.计算机病毒的产生过程可分为：程序设计→传播→潜伏→触发、运行→实施攻击 14.计算机病毒是一类特殊的程序，也有生命周期开发期传染期潜伏期发作期发现期消化期消亡期 15.在学习、研究计算机病毒的过程中，在遵守相关法律法规的前提下，应严格遵守以下“八字原则”——自尊自爱、自强自律 16.BIOS INT 13H 调用是BIOS 提供的磁盘基本输入输出中断调用，它可以完成磁盘( 包括硬盘和软盘) 的复位、读写、校验、定位、诊断、格式化等功能，完全不用考虑被操作硬盘安装的是什么操作系统 17.现代大容量硬盘一般采用LBA(Logic Block Address) 线性地址来寻址，以替代CHS 寻址。 18.高级格式化的目的是在分区内建立分区引导记录DBR(DOS Boot Record)、文件分配表FAT(File Allocation Table)、文件目录表FDT(File Directory Table)和数据区DATA 19.主引导记录(Master Boot Record，MBR) 20.主分区表即磁盘分区表(Disk Partition Table，DPT) 21.引导扇区标记(Boot Record ID/Signature) 22.通过主引导记录定义的硬盘分区表，最多只能描述4个分区 23.FAT32最早是出于FAT16不支持大分区、单位簇容量大以至于空间急剧浪费等缺点设计的
病毒载体
基因导入系统（gene delivery system）是基因治疗的核心技术，可分为病毒载体系统和非病毒载体系统。本章主要论述用于人类基因治疗的病毒载体系统。 用于基因治疗的病毒载体应具备以下基本条件： 1、携带外源基因并能包装成病毒颗粒； 2、介导外源基因的转移和表达； 3、对机体不致病。 然而，大多数野生型病毒对机体都具有致病性。因此需要对其进行改造后才能用于人体。原则上，各种类型的病毒都能被改造成病毒载体。但是由于病毒的多样性及与机体复杂的依存关系，人们至今对许多病毒的生活周期、分子生物学、与疾病发生及发展的关系等的认识还很不全面,从而限制了许多病毒发展成为具有实用性的载体。近20年来，只有少数几种病毒如反转录病毒（包括HIV病毒）、腺病毒、腺病毒伴随病毒、疱疹病毒（包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）、甲病毒等被成功地改造成为基因转移载体并开展了不同程度的应用。 第一节病毒载体产生的原理 病毒载体的产生建立在对病毒的生活周期和分子生物学认识的基础之上。研究病毒载体首先要对病毒的基因组结构和功能有充分的了解，最好能获得病毒基因组全序列信息。病毒基因组可分为编码区和非编码区。编码区基因产生病毒的结构蛋白和非结构蛋白；根据其对病毒感染性复制的影响，又可分为必需基因和非必需基因。非编码区中含有病毒进行复制和包装等功能所必需的顺式作用元件。 各种野生型病毒颗粒都具有一定的包装容量，即对所包装的病毒基因组的长度有一定的限制。一般来说，病毒包装容量不超过自身基因组大小的105～110％。 基因重组技术的发展使病毒载体的产生成为可能。最简单的做法是，将适当长度的外源DNA 插入病毒基因组的非必需区，包装成重组病毒颗粒。比如，本实验室曾将4.5kb的lacZ基因表达盒（CMV-lacZ-polyA）插入HSV1病毒的UL44（糖蛋白C）基因的XbaI位点中，病毒基因组的其余部分不改变，构建成重组病毒HSV1-lacZ100（吴小兵等，1998）。由于UL44基因产物对于HSV病毒在培养细胞中产毒性感染是非必需的，因此，该重组病毒可以在细胞中增殖传代。用这种重组病毒感染细胞，能将lacZ基因带入细胞并高效表达。用同样的方法，将AAV-2病毒的rep和cap基因片段（4.3kb）插入HSV1病毒的UL2（编码尿嘧啶DNA糖基化酶）或UL44（编码糖蛋白C）基因中，构建成具有提供重组AAV载体复制和包装所需的全部辅助功能的辅助病毒rHSV-rc（伍志坚等，1999）。 然而，这样的重组病毒作为基因转移载体有许多缺点。首先，许多野生型病毒通过在细胞中产毒性复制而导致细胞裂解死亡；或带有病毒癌基因而使细胞发生转化。因此必须经过改造使其成为复制缺陷性病毒并且删除致癌基因后才能用于基因治疗。其次，插入外源DNA的长度受到很大限制，尤其对于基因组本身较小的病毒如腺病毒伴随病毒（AAV，4.7kb）、反转录病毒（8～10kb）、腺病毒（36kb），如果不去除病毒基因，可供外源DNA插入的容量就十分小。因此，必须删除更多的病毒基因以腾出位置插入较大的外源DNA。为了增加病毒载体插入外源DNA的容量，除了可以删除病毒的非必需基因外，还可以进一步删去部分或全部必需基因，这些必需基因的功能由辅助病毒或包装细胞系反式提供。 病毒载体大体上可分为两种类型： 重组型病毒载体：这类载体是以完整的病毒基因组为改造对象。一般的步骤是选择性地删除病毒的某些必需基因尤其是立早基因或早期基因，或控制其表达；缺失的必需基因的功能由互补细胞反式提供；用外源基因表达单位替代病毒非必需基因区；病毒复制和包装所需的顺式作用元件不变。这类载体一般通过同源重组方法将外源基因表达单位插入病毒基因组中。
第十二章病毒的培养
第十二章病毒的培养 一、实验动物 二、鸡胚 三、组织培养 (一)组织（块）培养 (二)器官培养 (三)细胞培养 (四)组织和细胞的培养方法 (五)细胞克隆技术 (六)细胞的保存 四、病毒的组织培养 五、病毒蚀斑技术 病毒缺乏完整的酶系统,又无核糖体等细胞器,所以不能在任何无生命的培养液内生长。因此,实验动物、鸡胚以及体外培养的器官和细胞就成为人工增殖病毒的基本工具。而大量病毒的培养,又是病毒学实验研究以及制备疫苗和特异性诊断制剂的先决条件。培养病毒最早应用的方法是实验动物和鸡胚,但从50年代简便适用的细胞培养广泛应用于病毒培养以来,前两种方法已降到次要地位,但至今仍有部分病毒的分离鉴定还离不开实验动物或鸡胚,特别是在免疫血清制备以及病毒致病性、免疫性、发病机理和药物效检等方面。在禽类病毒病和流感、副流感类等病毒病的研究方面,鸡胚(含其它禽胚)仍具有重要的应用价值。 一、实验动物 实验动物是长期以来分离和增殖病毒、制造病毒抗原和病毒疫苗以及病毒病实验研究的常用材料和工具。但是后来发现,实验动物经常自身带有病毒,常常混淆试验结果,并给病毒疫苗的生产带来严重的潜在危险,例如被某些致瘤病毒所污染等等。为了克服这个缺陷,目前已通过微生物控制手段,培育出无菌动物(Germ Free Animal, 简称GF)、已知菌动物或称悉生动物(Gnotobiotics, 简称GN)和无特定病原动物(Specific Pathogen Free Animal,简称SPF)。 GF动物体内和体外均检不出任何微生物、寄生虫或其它生命体。
GN是确知所带微生物的动物。只带一种菌的叫单菌动物,其次为双菌和三菌动物,四菌以上则称多菌动物。 SPF是指体内无特定微生物和寄生虫感染的动物。从微生物控制的程度讲,SPF动物虽是这三类中最低的,但它无人畜共患病,无主要传染病,无对实验研究产生干扰的微生物,所以能满足病毒学一般实验的需要,比应用普通实验动物取得的结果更为科学与可靠。限于条件,某些实验室当前仍常应用普通实验动物,但也必须健康,并使用纯系品种。一次实验使用的动物,在年龄、体重和营养状态等方面要尽量一致。 国外实验动物科学发展迅速,我国已在部分大城市建立实验动物中心,专供应各种经过人工遗传控制和微生物控制而育成的纯系高品位实验动物。为了满足生物学、医学和兽医学研究的需要,国外按遗传控制标准已育成各类实验动物2600余种,其中小鼠就有1700余个品系,而且已经规范化、标准化,从而保证了研究工作的科学性和严密性。 虽然病毒学实验中应用实验动物的比重正在逐步降低,但是乳鼠至今仍是分离某些虫媒披膜病毒、柯萨奇病毒和呼肠孤病毒的主要工具。兽医学上除常应用家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、仓鼠和鸡胚等进行病毒分离、驯化以及疫苗生产以外,还常直接应用自然易感动物,例如羊、猪、狗、鸡甚至马和牛等大动物作各该病毒的实验研究。 但如上述,普通实验动物经常自身带毒,甚至发生病毒病的流行。例如家兔常有乳头状瘤、多型瘤、疱疹、兔痘、脑脊髓炎和传染性口腔炎等病毒感染,小白鼠常有鼠痘(脱脚病)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎、病毒性肺炎、脑脊髓炎、白血病、乳腺瘤、鼠肝炎等病毒感染,仓鼠有唾腺炎等病毒感染,豚鼠有脑膜炎、唾腺炎等病毒感染,实验研究时必须注意。 实验动物主要用于: (1)分离病毒,并借助感染范围试验鉴定病毒; (2)培养病毒,制造抗原和疫苗; (3)测定各毒株之间的抗原关系,例如应用实验动物作中和试验和交叉保护试验; (4)制备免疫血清和单克隆抗体; (5)作病毒感染的实验研究,包括病毒毒力测定,建立病毒病动物模型等。进行动物实验时,首先考虑的是选择对目的病毒最敏感的实验动物品种和系,以及适宜的接种途径和剂量。至于实验动物的饲养管理、接种和采血、剖检等具体方法,请参阅微生物学实验指导或有关专著。 二、鸡胚 鸡胚(包括其它禽胚)是正在发育中的机体,多种动物病毒能在鸡胚中增殖和传代,并可用鸡胚制备某些病毒抗原、疫苗和卵黄抗体等。禽胚的优点在于胚胎的组织分化程度低,又可选择不同的日龄和接种途径,病毒易于增殖,感染病毒的组织和液体中含有大量病毒,容易采集和处理,而且来源充足,设备和操作简便易行。 应用鸡胚需要注意的首要问题是胚内可能污染细菌(如沙门氏菌等),尤其是经母鸡