免疫固定电泳技术
免疫固定电泳技术(IFE)
免疫固定电泳技术（ IFE ）是一种包括琼脂凝胶蛋白电泳和免疫沉淀两个过程的操作。检测标本可以是血清、尿液、脑脊液或其它体液。免疫固定电泳技术（ IFE ）已在医学研究、法医学、基因诊断和临床实验室操作中得到了广泛的应用。临床主要应用如下疾病的诊断和疗效观察：
1、单克隆免疫球蛋白增殖病：是以单一克隆的浆细胞过度增高为特征，常常导致某种免疫球蛋白或免疫球蛋白亚单位大量合成而其他正常免疫球蛋白水平下降。免疫化学方法能够对异常蛋白定量，而电泳分析能够确定这些蛋白质的单克隆属性。
2、本周氏蛋白和游离轻链病：本周氏蛋白是没有与免疫球蛋白分子中重链结合的单克隆κ或λ轻链。免疫固定电泳来确定本周氏蛋白的存在形式。轻链病是指仅产生κ或λ单克隆轻链，在尿中称为本周氏蛋白的疾病，轻链病包括10％－15％的单克隆免疫球蛋白病，它多出现在IgG骨髓瘤（6 0％）和IgA骨髓瘤（16％）病中。
3、重链病：是以免疫球蛋白重链部分存在的单克隆蛋白为特征。
4、多克隆免疫球蛋白病：主要为γ蛋白区宽的条带，多见于炎症或感染和胶原病。
5、肾脏病变的来源分析：尿免疫蛋白电泳可以很好地协助临床判断肾脏的主要损伤（肾小球和肾小管）及尿蛋白选择程度的估计，选择性和非选择性蛋白尿。指导治疗和判断预后有价值。
免疫电泳实验报告
免疫电泳实验报告 摘要：本实验运用火箭电泳、微量电泳、双向免疫扩散等方法测定抗体的效价。 关键词：抗体效价测定；火箭电泳；微量电泳；双向免疫扩散 1 前言 免疫电泳(immunoelectrophoresis)的方法很多，主要有单向免疫扩散、双向扩散电泳、对流免疫电泳、微量免疫电泳、免疫火箭电泳、免疫固定电泳等几种方法。其中比较常用方法有以下三种。 火箭免疫（rocket immunoelectrophoresis），该方法是在琼脂板内掺入适量的抗体，在电场的作用下定量的在含适量抗体的离子琼脂中泳动，当走在前面的抗原遭到琼脂板内的抗体时，形成抗原体复合物而沉淀出来，走在后面的抗原继续在电场的作用下向正极泳动，在向前泳动过程中，遇到了前面抗原所沉淀的抗原抗体复合物，由于抗原的增加造成抗原过量时复合物沉淀溶解，并一同向正极移动而进入新的琼脂板内与未结合的抗体结合，有形成新的抗原抗体复合物沉淀出来，这样不断地沉淀—溶解—再沉淀，直到全部抗原与抗体结合，当比例合适时，可在短时间内出现锥形沉淀线，此沉淀线形似火箭，故称火箭电泳，抗原含量越高所形成的火箭峰愈长，因此依据火箭峰的长度，与标准抗原比较精确地计算抗原的浓。 微量电泳，该方法的原理是不同蛋白质颗粒所带电荷不同，在同一电场中，因泳动速度不同而发生分离，用于抗原、抗体纯度测定，以及临床诊断。 双向免疫扩散（double immunodiffuison）,根据出现沉淀线时抗体的最高稀释度来计算抗体的效价，或者依据沉淀线的出现定性抗原，检测疾病。 2 材料与方法 2．1 材料抗体，抗原，巴比妥钠-HCl缓冲液（pH8.6，0.4M），1.5%琼脂糖凝胶，7%醋酸，电泳仪，温箱，玻璃板，打孔器等。 2．2 方法 2．2．1 火箭电泳法配制巴比妥钠-HCl缓冲液（pH8.6，0.4M）；制备1.5%琼脂糖凝胶，煮沸至完全溶解；取琼脂糖凝胶约15ml，置55 oC水浴中降温，并加入抗体200μL，共同孵育；将二者混匀，铺火箭电泳板，放置冷凝倍比稀释抗原抗体；电泳板打孔(6孔)，加入已稀释的抗原(约10 μL/孔)；电泳3~4h，电流：30mA/块，电压：100~120V；待火箭电泳结束，用0.1%氨基黑染色10min，7%醋酸脱色至条带清晰。 2．2．2 微量电泳法用移液管取煮沸的琼脂糖凝胶铺板（7.5×2.5cm)，共2块，每块约铺3ml凝胶(双扩同样方法，铺3块)；给微量电泳板打抗圆孔、抗体槽，并在抗原孔内分别加入阳性抗原和阴性抗原(约10μL)；电泳约40~60min ，(电压：4~6V/cm；电流：1~5mA/cm)；电泳结束后，取出抗体槽的凝胶，加入15 μL抗体，置37 oC温箱过夜。 2．2．3 双向免疫扩散法铺2块板，同微量电泳；给双扩板打孔(梅花形)，每板打2组，一块板中央孔加入未稀释的抗原，每组周围6孔加入倍比稀释的抗体；置于37 oC温箱孵育24~48hr，测定抗体效价；另一块板中央孔加入未稀释的抗原，每组周围6孔加入倍比稀释的抗体。置于37 oC温箱孵育24~48hr，测定抗原效价。 3 结果 3．1 火箭电泳法表：抗原浓度对应的电泳峰值（cm） Ag(x) 1 0.5 0.25 0.125 0.06125 0.030625 峰值（cm) 1.75 1.55 1.4 1.35 1 0.87
免疫固定电泳操作规程
免疫固定电泳操作规程 一．项目名称 免疫固定电泳(ＨYDRAGEL ＩＭMＵNOＦＩXATＩＯN) 二．检验方法名称 琼脂糖凝胶免疫固定电泳 三．方法学原理 血清蛋白电泳中出现得异常条带主要存在于β-球蛋白与γ-球蛋白区域,通常疑为单克隆蛋白质并且提示丙球蛋白血症。为鉴别异常条带,可运用免疫固定技术。免疫固定电泳就是一种简单得技术,电泳后得蛋白质与相应抗体形成复合物与被固定在相应得位置上,通过下列四个步骤: １。蛋白质在琼脂糖凝胶内进行电泳分离。 2.电泳后已分离得蛋白质被固定并产生免疫沉淀:应用固定剂与抗血清加于凝胶表面得泳 道上,并让固定剂与抗血清在凝胶内渗透扩散。 3.使用吸水纸与清洗将未沉淀得蛋白质去除,已被沉淀得蛋白质贮留在凝胶内。 4、将蛋白质染色,并将这些免疫沉淀区带得位置与蛋白质经电泳后观察到得异常蛋白区带 进行比较。 为了精确识别单克隆区带,样品同时在六条泳道上进行测试。经电泳后,ＥLP作为参考泳道以显示电泳后得蛋白质。其余五条泳道用于鉴定单克隆成分。通过它(们)与抗血清,γ(IｇＧ)、α(IgＡ)、μ(IgM)重链与κ、λ轻链(游离与非游离)反应与否进行鉴别。该技术简单、快速、图象清晰,易于解释结果、 四．方法学溯源 自１930年由Ｔiseｌius发现了移界电泳(moｖing bｏundaｒy eｅｃtrｏpｈoresis),而后,这种技术得各种局限性已逐渐被区带电泳(zoｎe ｅlecｒrｏｐhoresis)所克服,区带电泳得条件与支持介质得选择就是电泳成败得关键、通过免疫化学手段观察其电泳特性及抗原特性就是鉴定某一蛋白成分最好得方法,免疫固定电泳技术就是目前应用最广泛得方法之一。五．仪器 （一）型号:SEＢIA ＨYDＲASYＳ(ＰN1210) （二）分析与计算参数: 1．处理量:约18个样本/小时 2．所需样本量:１０ul 3．检验时间:约55分钟 4．重复性:有良好得批内与批间重复性 5．电泳参数:电压0-30０V(可选至30０0V) 电流0－500mＡ 功率０－１00W 六．试剂及配套品 （一）试剂 1．HYDＲＡGＥL 1 IF试剂盒 ＨYＤＲAGEＬ２IF试剂盒 HYDRAGEL 4 IF试剂盒 HYDRAＧEL 9 IF试剂盒 （1）商标:SEBIA （2）包装规格:1０测试／20测试/40测试/90测试
免疫固定电泳技术诊断及分型多发性骨髓瘤的临床研究
免疫固定电泳技术诊断及分型多发性骨髓瘤的临床研究 [摘要] 目的研究分析免疫固定电泳技术诊断及分型多发性骨髓瘤的效果。方法回顾性分析我院于2015年5月～2016年5月收治的60例多发性骨髓瘤患者的病历资料，作为观察组，同时选择免疫球蛋白相同的健康体检者作为对照组，共40例，所有研究对象均进行免疫固定电泳技术诊断，同时采用西门子BNII免疫分析仪测定血清免疫球蛋白含量并进行分析。结果①60例多发性骨髓瘤患者经过免疫固定电泳技术诊断之后，其中54例阳性，符合率为90%。②多发性骨髓瘤的IgA、IgG、IgM 与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。轻链型组血清免疫球蛋白含量与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论多发性骨髓瘤应用免疫固定电泳技术有着较高的诊断价值和分型意义，值得临床推广应用。 [关键词] 免疫固定电泳技术；诊断；分型；多发性骨髓瘤；免疫球蛋白 [中图分类号] R733.3 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2016）24-0025-03 Department of Hematology，the First Affiliated Hospital of Gan'nan Medical University， Ganzhou 341000，China
[Abstract] Objective To study and analyze the effects of immunofixation electrophoresis in the diagnosis and typing of multiple myeloma. Methods Medical records of 60 patients with multiple myeloma who were admitted to our hospital from May 2015 to May 2016 were retrospectively analyzed， and were assigned to the observation group. The healthy subjects with the same immunoglobulin were selected at the same time as the control group， with a total of 40 subjects. The patients were all diagnosed by immunofixation electrophoresis，and quantitative immunoglobulin of the two groups was tested at the same time，and was analyzed by Siemens BNII immunoassay analyzer. Results ①Among the 60 patients with multiple myeloma who were diagnosed by immunofixation electrophoresis， 54 patients were positive， with the accordance rate of 90%. ②There were statistically significant differences of IgA，IgG and IgM in the research group compared with those in the control group （P<0.05）. The difference of the content of serum immunoglobulin in the light-chain type compared with that in the control group was not statistically significant （P>0.05）. Conclusion Application of immunofixation
项目五 对流免疫电泳试验
项目五对流免疫电泳试验 (Counter immunoelectrophoresis test) 【实验原理】 在适宜缓冲液和电场条件下，由于琼脂凝胶中的抗原和相应抗体在电泳和电渗作用下能相对移动，所以二者会在加样的两孔之间相遇，并在它们浓度比例合适之处形成白色沉淀线。据此临床常用该方法检测抗原，以诊断某些疾病。 【试剂和器材】 1．AFP阳性血清、待检血清、抗AFP诊断血清。 2．pH8.6 0.05 mol/L巴比妥缓冲液。 巴比妥钠10.3 g 巴比妥 1.84 g 先将巴比妥置于三角烧瓶中，加入200ml蒸馏水，加热溶解后再加入巴比妥钠，最后加蒸馏水至1000ml。 3．琼脂凝胶按需要量称取琼脂粉，加入pH8.6 0.05mol/L巴比妥缓冲液，使琼脂浓度为12g/L，沸水浴中溶解至澄清。 4．电泳仪、电泳槽、万用电表。 5．载玻片、绘图笔尖、吸管、滴管等。 【步骤和方法】 1．制备琼脂凝胶板取溶化的琼脂3~4ml，浇于载玻片上，冷却后打孔。
2．打孔 用绘图笔尖按图1-6打孔，孔径约3mm ，孔距4~5mm ，挑去孔中凝胶。 3．加样 用滴管按图1-6分别加入抗血清、AFP 阳性血清、待检血清，以加满孔为宜，注意不要溢出。 4．电泳 将加好样的琼脂凝胶板置于电泳槽中，抗原孔侧置阴极端，抗体孔侧置阳极端，两端分别以2~3层滤纸或纱布搭桥，使凝胶和槽中缓冲液相接。按通电源，将电压控制在4~6V/cm 长，或电流3~4mA/cm 宽，电泳30~60min 。 【结果判定】 电泳完毕后关闭电源，待15~30min 后取出琼脂凝胶板观察结果，或照相、染色后保存。 阳性对照孔与抗血清孔之间必须出现沉淀线，否则试验须重做。待检血清孔与抗血清孔之间出现白色沉淀线为阳性，不出现者为阴性。 Ag Ag Ab Ab + _ 1 阳性对照孔 2~4 待检血清孔 图1-6 对流免疫电泳 【注意事项】 1．当标本为脂血症、陈旧血标本或由于α2-巨球蛋白可引起假
尿蛋白免疫电泳
尿蛋白电泳 1、所有病人均留取新鲜晨尿送检。 2、检测方法：尿蛋白电泳方法均同于血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳法，尿蛋白定性采用磺基水杨酸法。 3、根据正常人血清醋纤膜电泳分离出来的区带来对照分析尿蛋白电泳区带。血清蛋白电泳可分为A（白蛋白）、α1（球蛋白）、α2（球蛋白）、β（球蛋白）、γ（球蛋白）5条区带，根据尿蛋白电泳所出现的蛋白区带的位置，也可分别给定为以上5条区带，电泳薄膜上仅出现A、α1、β带称选择性蛋白尿，电泳薄膜上除有A、α1、β带外，还出现α2带者或A、α1、α2、β、γ等5条带均显示的为非选择性蛋白尿，尿蛋白定性根据形成的浑浊度以“＋”表示蛋白含量的多少。 结果：肾炎组以中量蛋白尿为主，呈选择性。定性多为“+~++”. 肾综组以大量蛋白尿为主，呈高选择性。定性多为“＋＋~＋＋＋” 肾衰组：初期以中~大量蛋白尿主国，呈非选择性。终末期肾衰因肾小球大部分已毁坏，尿蛋白反而减少，甚至为阴性。为选择性蛋白尿，定性为“－~＋” 讨论：正常健康人，每24h尿中只有80－150mg蛋白排除体外，用磺基水杨酸尿蛋白定性检查法不可检出，尿蛋白电泳无区带显示，30例健康人尿蛋白定性均为阴性，尿蛋白电泳无区带显示，由结果出可以看出，随着肾小球基底膜损害不断加重，尿中排汇的蛋白量不断增加。然而终末期肾衰患者肾小球绝大部分已毁坏，尿蛋白反而减少，说明尿蛋白含量的多少不一定能完全反映肾脏损害程度。在这三组病例中显示尿蛋白电泳的选择性，肾综组高于肾炎组高于肾衰组，尿蛋白由选择性变为非选择性，终末期肾衰尿蛋白减少或无尿蛋白，当肾小球受到免疫反应损害后，肾小球基底膜滤孔变大，使肾小球对血浆蛋白的通透性增加，在疾病早期只有20万以下的小分子蛋白透过而排泄于尿中，这种蛋白尿称为“选择性蛋白尿”，病变进一步加重时，基底膜滤孔进一步增大，致使大、中分子的蛋白质也能滤出，即血浆中的所有蛋白质均无选择性的滤到尿中，称“非选择性蛋白尿”。此尿蛋白的选择性变化可以反映病情的变化，我们认为利用尿蛋白电泳确定是否选择性蛋白尿有助于临床了解肾脏的损害程度，有助于对肾脏疾患的分类、治疗及判断预后。
免疫固定电泳操作规程
免疫固定电泳操作规程 项目名称 免疫固定电泳( HYDRAGEL IMMUNOFIXATION) 检验方法名称 琼脂糖凝胶免疫固定电泳 方法学原理 血清蛋白电泳中岀现的异常条带主要存在于B -球蛋白和丫 -球蛋白区域，通常疑为单克隆蛋 白质并且提示丙球蛋白血症。为鉴别异常条带，可运用免疫固定技术。免疫固定电泳是一种简单的技术，电泳后的蛋白质与相应抗体形成复合物和被固定在相应的位置上，通过下列四个步骤： 1．蛋白质在琼脂糖凝胶内进行电泳分离。 2．电泳后已分离的蛋白质被固定并产生免疫沉淀：应用固定剂和抗血清加于凝胶表面的泳道上，并让固定剂和抗血清在凝胶内渗透扩散。 3．使用吸水纸和清洗将未沉淀的蛋白质去除，已被沉淀的蛋白质贮留在凝胶内。 4．将蛋白质染色，并将这些免疫沉淀区带的位置与蛋白质经电泳后观察到的异常蛋白区带进行比较。 为了精确识别单克隆区带，样品同时在六条泳道上进行测试。经电泳后，ELP作为参考泳道 以显示电泳后的蛋白质。其余五条泳道用于鉴定单克隆成分。通过它(们)与抗血清，丫 (IgG)、 a (IgA)、卩(IgM)重链和K、入轻链(游离和非游离)反应与否进行鉴别。该技术简单、快速、图象清晰，易于解释结果。 方法学溯源 自 1930 年由 Tiselius 发现了移界电泳( moving boundary eectrophoresis )，而后，这种技术的各种局限性已逐渐被区带电泳( zone elecrrophoresis )所克服，区带电泳的条件和支持介质的选择是电泳成败的关键。通过免疫化学手段观察其电泳特性及抗原特性是鉴定某一蛋白成分最好的方法，免疫固定电泳技术是目前应用最广泛的方法之一。 仪器 型号： SEBIA HYDRASYS (PN1210) 分析和计算参数： 处理量：约 18 个样本 / 小时 所需样本量： 10ul 检验时间：约 55 分钟 重复性：有良好的批内和批间重复性 电泳参数：电压 0 — 300V (可选至 3000V) 电流 0－ 500mA 功率 0— 100W
对流免疫电泳
对流免疫电泳 （一）原理 将抗原和抗体分别加入半固体琼脂孔内，在碱性缓冲液中进行电泳时，蛋白质抗原带负电荷，在电场中由阴极向阳极移动。抗体等电点较抗原高，在此缓冲液中带阴离子少，分子量大，泳动较慢，同时因电渗作用（电渗是电场中溶液对于固体的相对移动，琼脂是酸性物质含有较多的硫酸根，在碱性缓冲液中带负电，而与它接触的溶液带正电，因此液体向阴极移动，产生电渗），反而向阴极泳动，这样就使抗原、抗体在电场中相对移动，而形成对流。经过一定泳动时间后，在比例最适处，形成肉眼可见的白色沉淀线。由于电场作用，限制了抗原和抗体多方向的自由扩散，加速了泳动的速度，缩短了反应时间，提高了灵敏度。 （二）器材与试剂 1．器材 （1）电泳仪、电泳槽（2）载玻片（3）刻度吸量管（4）打孔器和图形卡 （5）毛细管（6）吸耳球（7）煮沸消毒水浴箱 2．试剂 （1）1.2％琼脂凝胶（2）生理盐水（3）抗原（4）抗体（5）pH8.6 0.1M巴比妥缓冲液
（三）操作步骤： 1．取热熔的1.2％琼脂凝胶3.5ml，立即浇于载波片上，使琼脂平铺于整个玻片。待自然冷却凝固。 2．用打孔器按图形打孔，再用针尖挑去孔内琼脂。 3．将抗原和抗体用生理盐水分别稀释成1:8浓度。 4．用毛细管按顺序将抗原加入第1孔中。将抗体加入第2孔中。每孔加满为止，（注意防止溢出孔外）。 5．将琼脂凝胶玻片放人pH8.6 0.1M巴比妥缓冲液的电泳槽中，抗原端接负极，抗体端接正极，琼脂两端用四层纱布搭桥。 6．电泳，电压为110V，泳动时间30－45分钟。 7．关闭电源。 8．观察结果：从电泳槽内取出琼脂板，对光观察抗原与抗体之间有否白色沉淀线，出现沉淀线最佳比例和最高稀释度是多少，并绘出沉淀线的位置、数量、形态。 （四）注意事项 1．浇板时，琼脂面要铺平。 2．加样时避免样品溢出孔外。
免疫固定电泳操作SOP
免疫固定电泳操作规程 一、项目名称 免疫固定电泳（HYDRAGEL IMMUNOFIXATION） 二、检验方法名称 琼脂糖凝胶免疫固定电泳 三、方法学原理 血清蛋白电泳中出现的异常条带主要存在于β-球蛋白和γ-球蛋白区域，通常疑为单克隆蛋白质并且提示丙球蛋白血症。为鉴别异常条带，可运用免疫固定技术。免疫固定电泳是一种简单的技术，电泳后的蛋白质与相应抗体形成复合物和被固定在相应的位置上，通过下列四个步骤： 1、蛋白质在琼脂糖凝胶内进行电泳分离。 2、电泳后已分离的蛋白质被固定并产生免疫沉淀：应用固定剂和抗血清加于凝胶表面的泳道上，并让固定剂和抗血清在凝胶内渗透扩散。 3、使用吸水纸和清洗将未沉淀的蛋白质去除，已被沉淀的蛋白质贮留在凝胶内。 4、将蛋白质染色，并将这些免疫沉淀区带的位置与蛋白质经电泳后观察到的异常蛋白区带进行比较。 为了精确识别单克隆区带，样品同时在六条泳道上进行测试。经电泳后，ELP 作为参考泳道以显示电泳后的蛋白质。其余五条泳道用于鉴定单克隆成分。通过它（们）与抗血清，γ(IgG)、α(IgA)、μ(IgM)重链和κ、λ轻链（游离和非游离）反应与否进行鉴别。该技术简单、快速、图象清晰，易于解释结果。 四、方法学溯源 自1930年由Tiselius发现了移界电泳（moving boundary eectrophoresis），而后，这种技术的各种局限性已逐渐被区带电泳（zone elecrrophoresis）所克服，区带电泳的条件和支持介质的选择是电泳成败的关键。通过免疫化学手段观察其电泳特性及抗原特性是鉴定某一蛋白成分最好的方法，免疫固定电泳技术是目前应用最广泛的方法之一。 五、仪器 （一）型号：SEBIA HYDRASYS (PN1210)
项目五对流免疫电泳试验
项目五 对流免疫电泳试验 (Counter immunoelectrophoresis test) 【实验原理】 在适宜缓冲液和电场条件下，由于琼脂凝胶中的抗原和相应抗体在电泳和电渗作用下能相对移动，所以二者会在加样的两孔之间相遇，并在它们浓度比例合适之处形成白色沉淀线。据此临床常用该方法检测抗原，以诊断某些疾病。 【试剂和器材】 1．AFP 阳性血清、待检血清、抗AFP 诊断血清。 2． mol/L 巴比妥缓冲液。 巴比妥钠 10.3 g 巴比妥 1.84 g 先将巴比妥置于三角烧瓶中，加入200ml 蒸馏水，加热溶解后再加入巴比妥钠， 最后加蒸馏水至1000ml 。 3．琼脂凝胶 按需要量称取琼脂粉，加入 L 巴比妥缓冲液，使琼脂浓度为12g/L ，沸水浴中溶解至澄清。 4．电泳仪、电泳槽、万用电表。 5．载玻片、绘图笔尖、吸管、滴管等。 【步骤和方法】 1．制备琼脂凝胶板 取溶化的琼脂3~4ml ，浇于载玻片上，冷却后打孔。 2．打孔 用绘图笔尖按图1-6打孔，孔径约3mm ，孔距4~5mm ，挑去孔中凝胶。 3．加样 用滴管按图1-6分别加入抗血清、AFP 阳性血清、待检血清，以加满孔为宜，注意不要溢出。 4．电泳 将加好样的琼脂凝胶板置于电泳槽中，抗原孔侧置阴极端，抗体孔侧置阳极端，两端分别以2~3层滤纸或纱布搭桥，使凝胶和槽中缓冲液相接。按通电源，将电压控制在4~6V/cm 长，或电流3~4mA/cm 宽，电泳30~60min 。 【结果判定】 电泳完毕后关闭电源，待15~30min 后取出琼脂凝胶板观察结果，或照相、染色后保存。 阳性对照孔与抗血清孔之间必须出现沉淀线，否则试验须重做。待检血清孔与抗血清孔之间出现白色沉淀线为阳性，不出现者为阴性。 Ag Ag Ab Ab +_ 1 阳性对照孔 2~4 待检血清孔 图1-6 对流免疫电泳 【注意事项】 1．当标本为脂血症、陈旧血标本或由于α2-巨球蛋白可引起假阳性，它靠近阳极呈弧状。为排除这种假阳性可用参比电泳鉴别，即阳性对照孔与待检孔间距为0.2cm ，在两孔中间相距0.4cm 处打抗血清孔，加样后电泳，两沉淀线吻合为阳性，相交为阴性，其它试验条件与以上试验相同。
免疫电泳技术
免疫电泳技术 （一）原理 免疫电泳是琼脂平板电泳和双相免疫扩散两种方法的结合。将抗原样品在琼脂平板上先进行电泳，使其中的各种成分因电泳迁移率的不同而彼此分开，然后加入抗体做双相免疫扩散，把已分离的各抗原成分与抗体在琼脂中扩散而相遇，在二者比例适当的地方，形成肉眼可见的沉淀弧。 该方法可以用来研究：①抗原和抗体的相对应性；②测定样品的各成分以及它们的电泳迁移率；③根据蛋白质的电泳迁移率，免疫特性及其它特性，可以确定该复合物中含有某种蛋白质；④鉴定抗原或抗体的纯度。 （二）试剂与器材 同琼脂平板电泳。 （三）操作方法 1．在玻璃板的中央放置一小玻棒（d=2mm~3mm），然后用0.05mol/L pH8.6巴比妥缓 冲液配制1％琼脂，制成琼脂板，板厚2mm.。 2．在玻棒的两侧，板中央或1／3处，距玻棒4mm～8mm各打直径3mm～6mm的孔。 3．在孔内加满血清。 4．将玻璃板置电泳槽上进行电泳。电流为2mA/cm～3mA/cm（或电压3V/cm～6V/cm）， 电泳时间4h～6h。 5．停止电泳，用小刀片在玻璃板两侧切开，取出玻璃棒，加抗血清样品。 6．于湿盒内37℃（或常温）扩散24h，取出观察。 7．于生理盐水中浸泡24h，中间换液数次，取出后，加0.05％氨基黑染色5min～10min，然后以1mol/L冰醋酸脱色至背景无色为止。 8．制膜、观察、保存标本。 （四）免疫电泳结果分析 1．常见的沉淀弧由于经电泳已分离的各抗原成分在琼脂中呈放射状扩散，而相应的抗体呈直线扩散，因此生成的沉淀一般多呈弧形，常见的弧形如下：①交叉弧：表示两个抗原成分的迁移率相近，但抗原性不同；②平行弧：表示两个不同的抗原成分，它们的迁移率相同，但扩散率不同；③加宽弧：一般是由于抗原过量所致；④分枝弧：一般是由于抗体过量；⑤沉淀线中间逐渐加宽并接近抗体槽，一般由于抗原过量，在白蛋白位置处形成；⑥其它还有弯曲弧、平坦弧、半弧等。
多克隆抗体的免疫电泳实验
多克隆抗体的免疫电泳实验 【实验原理】 免疫电泳又称为γ球蛋白电泳或免疫球蛋白电泳技术，这是一种能够判断血液中三种免疫球蛋白IgM’’ IgG’’ IgA含量水平的实验方法。在这项实验技术中，首先利用蛋白质的分子量和所带电荷的比值运用水平琼脂糖凝胶电泳技术将蛋白质进行分离，然后将特异性的抗体引入到与电泳方向平行的凹槽中，在抗原和抗体的扩散过程中，抗原和抗体适当比例的结合会导致沉淀的产生(如图)。0.85%盐不仅可以终止扩散过程也可用于洗去未结合的蛋白，抗原和抗体结合所形成的沉淀线即可以肉眼观察也可利用染色方法观察。 免疫电泳技术不仅可用于血清或尿样中单克隆抗体的鉴定，也可用于其它方面，比如免疫复合物的筛选、各种异常丙种球蛋白血症的识别和鉴定等。免疫电泳技术也是进行蛋白质常规评价的一种可靠，精确的实验方法，可观察蛋白质结构的变化和浓度的改变。 【实验材料】 ⒈实验器材 水平电泳仪;打孔器;滴管;刀片;电源;水浴(55°C);蒸馏水;烧杯(400-600ml); 加样枪(5-100ul)。 ⒉实验试剂 ⑴纯化的抗体;蛋白质混合物;1%琼脂。 ⑵ Tris-巴比妥缓冲溶液：2.24g 巴比妥酸，4.43g Tris，0.053g 乳酸钙及0.065g 叠氮化钠溶于100ml 蒸馏水中。 ⑶电泳缓冲溶液：将Tris-巴比妥缓冲溶液与蒸馏水按1：4的比例混合。 【实验方法】 ⒈准备琼脂糖凝胶 将琼脂和电泳缓冲溶液混合放入90°C水浴加热至溶化，制成1%琼脂，将琼脂在冷却前铺在水平玻璃板上，待冷却至室温后，按图用内径4毫米的打孔器打孔及制作凹槽。 ⒉电泳 将用电泳缓冲溶液稀释的4%-5%的抗原用滴管小心放入小孔中，将胶板放入电泳槽
免疫电泳技术
免疫电泳技术 一、概念 免疫电泳技术是将凝胶内的沉淀反应与蛋白质电泳相结合的一项免疫检测技术，其实质是在直流电场中让抗原与抗体在凝胶中快速定向扩散，根据沉淀线（环）的有无，判断样品中有无与诊断抗体（或抗原）对应的抗原（或抗体）。免疫电泳技术具有灵敏度高、分辨力强、反应快速和操作简便等特点。 二、基本原理 将抗原抗体凝胶扩散系统置于直流电场中，在电流作用下，抗原及抗体向异相电荷的电极快速泳动，缩短了两者结合时间，加快了沉淀现象的产生。 免疫电泳的主要影响因素如下。 1、抗原与抗体特性：抗原或抗体的泳动速度与其所带静电荷量、分子量几物理形状等 有关，静电荷量越多、颗粒越小，电泳速度越快，反之越慢。在同一电场中，单位时间内个种带电粒子的移动距离称电泳迁移率。当有多种带电荷的蛋白电泳时，由于静电荷量不同而区分成不同区带，得以区分不同的抗原抗体复合物。 2、电场因素：电场强度、溶液PH、离子强度、电渗现象（是指在电场中水对固相介质 的相对移动，不影响蛋白质的分离，但影响其原点位置）等。 三、免疫电泳技术（双向） 1、对流免疫电泳是将双向琼脂扩散试验与电泳相结合的定向免疫扩散技术。 在琼脂板上打两排孔，在负电极侧的各孔内加入待检抗原溶液，在正电极侧的各孔内加入诊断抗体溶液。 在电场中，在缓冲液为PH8.6中，蛋白质抗原与抗体IgG均带负电荷，应都向正极泳动，与受电渗作用影响的水流方向（向负极流动）相反。但由于抗原等电点较低（pI4~5），在电场中带净负电荷数量较多且分子量相对较小，能克服逆向水流作用保持向正极泳动；而IgG由于等电点较高（pI位6~7）带净负电荷较少且分子量大，不能克服逆向水流作用，因而顺水流方向朝负极泳动，致使抗原和抗体在电场中相向泳动。如果抗原与IgG对应，可在相遇的最适比例处形成沉淀线。 对流免疫电泳敏感度比双向扩散试验高8~16倍，可测出ug/L量的蛋白质。
7第七章 免疫电泳技术
第七章免疫电泳技术 本章考点 1.概述 2.免疫电泳技术 3.应用 免疫电泳技术是根据抗原及抗体反应的高度特异性，电泳技术的高分辨力和具有微量、快速的特点，将凝胶内电泳与免疫扩散相结合的一项免疫学技术。 第一节基本原理 一、原理 免疫电泳技术实质上是在直流电场作用下的凝胶扩散试验。它的原理是将凝胶扩散置于直流电场中，在一定的条件下，抗原及抗体离解成为带正电或负电的电子，在电场中向异相电荷的电极移动，所带净电荷量越多、颗粒越小，泳动速度越快，反之则慢。由于电流加速了抗原、抗体的运行速度，缩短了两者结合的时间，加快了沉淀现象的产生。当有多种带电荷的物质电泳时，由于静电荷不同，而区分成不同区带，使抗原决定簇不同的成分得以区分。 影响因素有：①电场强度；②溶液pH；③离子强度；④电渗等。 二、电解质和蛋白质的电离特性、电泳迁移率、电渗 蛋白质的基本单位是氨基酸，在水溶液中具有两性电离特性，当缓冲液pH与蛋白质等电点（PI）相当时呈电中性，无电泳迁移性；缓冲液pH大于蛋白质等电点（PI）时带正电荷，向阴极端移动；缓冲液pH 小于蛋白质等电点（PI）时带负电荷，向阳极端移动。 在同一电场条件下，各种带电粒子在单位时间内的移动距离称电泳迁移率。 在电场中液体对固体可出现相对移动，产生电渗现象。电渗不影响蛋白质的分离，但影响其原点位置。 影响因素有：①电场强度；②溶液pH；③离子强度；④电渗。 三、常用载体 有琼脂和琼脂糖凝胶。其特点是提高了敏感性及反应速度，并可将带电性不同的组分区分开。 第二节常用技术 免疫电泳常用技术有： 1.对流免疫电泳：对流免疫电泳原理是将双向扩散试验与电泳相结合的定向加速的免疫扩散技术。 在琼脂板上打两排孔，左侧各加入待测抗原，右侧孔内加入相应抗体，抗原在阴极侧，抗体在阳极侧。通电后，在pH8.4缓冲液中带负电荷的蛋白质抗原泳向阳极抗体侧，而抗体借电渗作用流向阴极侧，在两者之间或抗体侧形成沉淀线。本法敏感度比双向扩散试验高8～16倍。
免疫固定电泳与交又免疫电泳
免疫固定电泳与交又免疫电泳 免疫固定电泳(immuno fixationel ectrophoresis，IFE)是Alper和Johnson于1969年推荐的一项具有实用价值的电泳加沉淀反应技术，可用于各种蛋白质的鉴定。该方法原理是先将待检样品在凝胶板上作区带电泳，将蛋白质分离成不同区带，然后在其上覆盖抗血清!当抗血清与某区带中的单克隆免疫球蛋白结合，便形成抗原抗体复合物而沉淀。最后通过漂洗和染色，并与蛋白质参考泳道对照分析，可对各类免疫球蛋白及其轻链进行分型。 免疫固定电泳图 左图为IgGκ型；右图为IgGλ型 免疫固定电泳最常用于M蛋白的鉴定。方法是：①先将患者血清或血浆在醋酸纤维膜或琼脂上作区带电泳(6孔)，根据血清蛋白质的电荷不同将其分开；②将IgG、IgA、IgM、κ轻链和λ轻链的抗血清加于分离的蛋白质泳道上，参考泳道加抗正常人全血清用于区带对照；③作用30min后，洗去游离蛋白质，待干燥后用氨基黑染色；④结果判新，M蛋白被固定，形成窄而致密的沉淀带。 本法可用于鉴定迁移率近似的蛋白和M蛋白，免疫球蛋白轻链，尿液、脑脊液等微量蛋白，游离轻链，补体裂解产物等。免疫固定电泳最大的优势是分辨率强，敏感度高，操作周期短，仅需数小时，结果易于分析，目前已作为常规检测。
交叉免疫电泳(crossed immuunoelectrophoresis，CIEP)是将区带电泳和火箭免疫电泳相结合的免疫电泳分析技术。 CIEP是一种有效的抗原蛋白定量技术，可一次同时对多种抗原定量。分辨率较高，有利于各种蛋白组分的比较，对于蛋白质遗传多态性、微小异质性、蛋白质裂解产物和不正常片段等进行定性分析。 上海越研生物科技有限公司提供 +86-021-******** 55785281
免疫固定电泳操作规程资料
免疫固定电泳操作规 程
免疫固定电泳操作规程 一．项目名称 免疫固定电泳（HYDRAGEL IMMUNOFIXATION） 二．检验方法名称 琼脂糖凝胶免疫固定电泳 三．方法学原理 血清蛋白电泳中出现的异常条带主要存在于β-球蛋白和γ-球蛋白区域，通常疑为单克隆蛋白质并且提示丙球蛋白血症。为鉴别异常条带，可运用免疫固定技术。免疫固定电泳是一种简单的技术，电泳后的蛋白质与相应抗体形成复合物和被固定在相应的位置上，通过下列四个步骤： 1．蛋白质在琼脂糖凝胶内进行电泳分离。 2．电泳后已分离的蛋白质被固定并产生免疫沉淀：应用固定剂和抗血清加于凝胶表面的泳道上，并让固定剂和抗血清在凝胶内渗透扩散。 3．使用吸水纸和清洗将未沉淀的蛋白质去除，已被沉淀的蛋白质贮留在凝胶内。 4．将蛋白质染色，并将这些免疫沉淀区带的位置与蛋白质经电泳后观察到的异常蛋白区带进行比较。 为了精确识别单克隆区带，样品同时在六条泳道上进行测试。经电泳后，ELP作为参考泳道以显示电泳后的蛋白质。其余五条泳道用于鉴定单克隆成分。通过它（们）与抗血清，γ(IgG)、α(IgA)、μ(IgM)重链和κ、λ轻链（游离和非游离）反应与否进行鉴别。该技术简单、快速、图象清晰，易于解释结果。
四．方法学溯源 自1930年由Tiselius发现了移界电泳（moving boundary eectrophoresis），而后，这种技术的各种局限性已逐渐被区带电泳（zone elecrrophoresis）所克服，区带电泳的条件和支持介质的选择是电泳成败的关键。通过免疫化学手段观察其电泳特性及抗原特性是鉴定某一蛋白成分最好的方法，免疫固定电泳技术是目前应用最广泛的方法之一。 五．仪器 （一）型号：SEBIA HYDRASYS (PN1210) （二）分析和计算参数： 1．处理量：约18个样本/小时 2．所需样本量：10ul 3．检验时间：约55分钟 4．重复性：有良好的批内和批间重复性 5．电泳参数：电压0－300V（可选至3000V） 电流0－500mA 功率0－100W 六．试剂及配套品 （一）试剂 1．HYDRAGEL 1 IF试剂盒 HYDRAGEL 2 IF试剂盒
项目五 对流免疫电泳试验
项目五 对流免疫电泳试验 (Counter immunoelectrophoresis test) 【实验原理】 在适宜缓冲液与电场条件下,由于琼脂凝胶中的抗原与相应抗体在电泳与电渗作用下能相对移动,所以二者会在加样的两孔之间相遇,并在它们浓度比例合适之处形成白色沉淀线。据此临床常用该方法检测抗原,以诊断某些疾病。 【试剂与器材】 1.AFP 阳性血清、待检血清、抗AFP 诊断血清。 2.pH8、6 0、05 mol/L 巴比妥缓冲液。 巴比妥钠 10、3 g 巴比妥 1、84 g 先将巴比妥置于三角烧瓶中,加入200ml 蒸馏水,加热溶解后再加入巴比妥钠, 最后加蒸馏水至1000ml 。 3.琼脂凝胶 按需要量称取琼脂粉,加入pH8、6 0、05mol/L 巴比妥缓冲液,使琼脂浓度为12g/L,沸水浴中溶解至澄清。 4.电泳仪、电泳槽、万用电表。 5.载玻片、绘图笔尖、吸管、滴管等。 【步骤与方法】 1.制备琼脂凝胶板 取溶化的琼脂3~4ml,浇于载玻片上,冷却后打孔。 2.打孔 用绘图笔尖按图1-6打孔,孔径约3mm,孔距4~5mm,挑去孔中凝胶。 3.加样 用滴管按图1-6分别加入抗血清、AFP 阳性血清、待检血清,以加满孔为宜,注意不要溢出。 4.电泳 将加好样的琼脂凝胶板置于电泳槽中,抗原孔侧置阴极端,抗体孔侧置阳极端,两端分别以2~3层滤纸或纱布搭桥,使凝胶与槽中缓冲液相接。按通电源,将电压控制在4~6V/cm 长,或电流3~4mA/cm 宽,电泳30~60min 。 【结果判定】 电泳完毕后关闭电源,待15~30min 后取出琼脂凝胶板观察结果,或照相、染色后保存。 阳性对照孔与抗血清孔之间必须出现沉淀线,否则试验须重做。待检血清孔与抗血清孔之间出现白色沉淀线为阳性,不出现者为阴性。 Ag Ag Ab Ab + _ 1 阳性对照孔 2~4 待检血清孔 图1-6 对流免疫电泳 【注意事项】 1.当标本为脂血症、陈旧血标本或由于α2-巨球蛋白可引起假阳性,它靠近阳极呈弧状。为排除这种假阳性可用参比电泳鉴别,即阳性对照孔与待检孔间距为0、2cm,在两孔中间相距0、4cm 处打抗血清孔,加样后电泳,两沉淀线吻合为阳性,相交为阴性,其它试验条件与以上试验相同。 2.电泳缓冲液的pH 值、离子强度、电压与电泳时间对检测结果均有影响,应注意控制。