诺如病毒标本处理和室检测技术方案
附件4
诺如病毒标本处理和实验室检测技术方案
诺如病毒完整的检测及分型流程包括标本前处理、RNA提取、Real-time RT-PCR检测、传统RT-PCR检测、测序和基因分型6个步骤。Real-time RT-PCR方法灵敏度和准确度高，是检测诺如病毒的金标准。用传统RT-PCR可对Real-time RT-PCR阳性标本的PCR 产物进行测序，通过序列分析确定诺如病毒的基因群和基因型。在发生聚集或暴发时，ELISA方法可作为辅助的手段快速检测诺如病毒抗原。食品、水、环境涂抹样检测方法的灵敏度不稳定，仅作为参考方法。
一、标本前处理
1.粪便、呕吐物
1.1设备和材料
微量移液器、无菌过滤器、漩涡振荡器、微量离心机、1.5 ml无菌离心管、10 mM pH 值为7.0－7.4的PBS。
1.2 操作方法
（1）离心管每管分装0.5 mlPBS。用一次性移液管（或无菌棒）添加豌豆大小的粪便（约0.1 g），稀释成约10％至20％（重量/体积）的粪便悬浮液。当粪便样品是液态时，不必在PBS中稀释，直接使用500 μl的样品。
（2）漩涡振荡每个样品1 min。在2 400 g下离心5 min，使得固体沉淀。澄清上清液可以直接用于病毒核酸提取或贮存于－70℃。
（3）取澄清的上清液200 μl进行RNA提取。
2.水
通过阴离子滤膜过滤水样品。用牛肉膏（1.5%w/v）含0.05 M甘氨酸（pH9.0）缓冲液洗脱附在膜上的病毒。使用Microsep 100TM 或 CentriconTM columns离心管进一步浓缩洗脱液。
2.1设备和材料
DEPC水、新配置次氯酸盐（至少1%）或等效消毒剂、Millipore HA filter（孔径0.45um、）、换膜过滤器、真空泵、计时器、PH值酸度计、磁力搅拌器及转子、低温冰箱（-20℃、-70℃）、Microsep 100 K columns（PALL公司）、Centriprep YM-50（Millipore公司）、洗脱液（BE-0.05Gly pH7.0）、PBS (pH7.2)、离心机、氯仿、丁醇。
2.2操作方法
2.2.1过滤装置准备
（1）使用无菌的镊子将滤膜放在滤器架上，滤膜有3层，型号分别为Millipore HA filter、AP15和AP20，放置顺序为Millipore HA filter →AP15 →AP20。
注意：暴露出滤膜表面使其能与水样接触，请将滤膜光滑表面的那边向下。所有的玻璃器皿应干净无菌。每批水样使用不同的漏斗。
（2）将滤膜置中，将有刻度的漏斗放在滤器的上边。
（3）使用不锈钢滤器夹进行水的密封。
（4）真空泵连接1 000 ml的锥形瓶。
注意：为防止气溶胶的污染，应在无菌的环境中过滤，在生物安全柜进行操作。
（5）向滤器中倒入20 ml无菌水（DEPC水）检查滤膜的密封情况。
（6）打开泵，调整水的流速至形成缓慢的细流。
2.2.2 水样品的过滤
（1）向玻璃漏斗里倒水样，当水样完全滤过立刻关闭真空泵。
（2）用不锈钢的滤器夹，小心移开滤膜上的刻度漏斗。
2.2.3 用酸漂洗滤膜
将膜用无菌的镊子夹放在有200 ml0.05 mM H2SO4（pH3.0）的无菌500 ml烧杯中进行漂洗滤膜去除Mg2+。
2.2.4 洗脱
（1）将膜夹出放在无菌的60mm培养皿中，加5ml 洗脱液。盖上铝箔。
注意：要将滤膜的上边向下（倒置）放在锥形瓶里。
（2）将锥形瓶放在恒温摇床上，转速0.01g（45rpm），室温（23℃± 3℃），15min。
（3）关闭摇床，将洗脱液（大约5ml）转移到管子里。
2.2.5 中和洗脱液
用1 N HCl或1 N NaOH调整洗脱液的pH到7.0－7.4。检测前，洗脱液在－70℃储藏。
2.2.6 二次浓缩
方法一：用Microsep 100 K columns或Centriprep YM-50浓缩病毒
（1）为防止病毒的附着，先用无病毒粒子的洗脱液浸湿过滤器。
（2）将水标本滤膜洗脱液（大约5 ml）加入到浓缩柱中，2 400 g离心5 min。
（3）吸取浓缩液（约150 μl），转移至1.5 ml离心管中。
方法二：PEG沉淀
（1）向标本洗脱液中加入NaCl终浓度是0.3 mol/L（若洗脱液为5ml加0.08775g的NaCl）, 有助于病毒的沉淀，再等量加入PEG-6000终浓度为12.5％（w/v）（若洗脱液为5 ml，加0.0625g的PEG-6000。4 ℃过夜。
（2）4 ℃，9 600 g离心30 min，收集沉淀；
（3）Millipore HA filter，倾倒并弃掉上清液。每个离心管添加150－500 μl pH7.2（±0.2）PBS重悬沉淀物。将离心管放置在离心管架上，为更好的让缓冲液与沉淀物接触，将离心管架成一定角度放置。室温放置30 min。
注意：如果沉淀物没有溶解，可用缓冲液反复的轻轻吹打沉淀物。吹打过力会产生气泡。
（4）向悬液中加入等体积的氯仿/丁醇（1:1 vol/vol）混合。去除病毒悬液中的抑制剂。
（5）4 ℃，9 600 g，离心20 min。
（6）分离出水相（上清液），－80℃储藏。
（7）取200 μl上清液进行核酸提取。
3.环境涂抹样
将棉签在PBS里蘸湿，用力涂抹待测表面（最大面积100 cm2）后，立即浸入核酸提取试剂盒裂解缓冲液中，将棉签用力压EP管的侧壁，释放棉签中的液体。重复浸入和压侧壁的步骤3~4次，确保病毒最大释放量，直接进入核酸提取步骤。
4.食品
4.1贝类
4.1.1设备和材料:诺如病毒质控样（中国食品药品检定研究院）、高速离心机（可离心15ml~50 ml体积）、台式离心机、碎花制冰机、生物安全柜、实时荧光定量PCR检测系统、眼科剪、眼科镊、一次性无菌培养皿、恒温摇床、高压灭菌器、电磨均质器（LX134MO）、一次性研磨杵（上海生工）、15 ml去RNAase离心管、1.5 ml 去RNAaseEppendorf 管、20 μl、200 μl、1 000 μl微量移液器、PBS溶液pH7.2 （Gebico）、蛋白酶K（PCR级 Roche）。
4.1.2 贝类样品处理程序
采集贝类样品，进行解剖，剪取消化腺和肠道后均质，最后提取RNA。
4.1.3 解剖方法
5个贝类个体作为一件样品，分别解剖，取其消化腺和肠道，用于检测。如果一件样品的消化腺和肠道的总质量不够 2.0 g，应适当增加取样量，使得每件样品检验的总质量达到2.0 g。
（1）牡蛎的解剖方法
使用灭菌的刀具将牡蛎壳撬开，使用灭菌的眼科剪和眼科镊，先将牡蛎的内脏部分剪取下来放到一个灭菌的平皿里，沿肠道将牡蛎软体部分剪开，暴露出肠道和消化腺，将多余的组织去掉，取其消化腺和肠道用于检测。牡蛎的解刨过程及解剖结构见（2）海虹
用灭菌刀具将双壳撬开，将消化腺用镊子直接夹下，同时尽量将肠道取下。由于海虹的消化腺相对牡蛎较小，所以需要增加取样的海虹个体数，以使得总质量达到 2.0 g，用于后续的检测。
（3）扇贝、毛蚶与文蛤
扇贝与毛蚶的解剖结构与海虹相似，参照海虹的方法将壳打开后，直接判断消化腺所处的位置，用眼科镊和眼科剪，将其消化腺和肠道取下用于诺如病毒的检测。文蛤的消化腺包在内脏团里，在解剖时可以直接用镊子在内脏团消化腺位置撕开，将消化腺取下，同时将肠道取出，用于检测，文蛤的消化腺体积较小，需要适当增加取样量以满足检验的要求。
4.1.4均质
将上述解剖下的消化腺和肠道放到50 ml灭菌的小烧杯内，用电磨均质器（LX134MO）将消化腺仔细打碎，成糊状。
4.1.5蛋白酶K消化
将上述均质的消化腺，分别称取2.0±0.1 g，加入15 ml的离心管，然后每管加入2 ml的PBS溶液，加入20 mg/ml蛋白酶K（Roche）溶液10 μl进行消化，另外取1件样品加入诺如病毒的阳性质控球，作为外部质控阳性对照。
4.1.6将上述样品于摇床37℃，0.57g（320rpm）振荡1h。恒温水浴60℃，保持
15min；将15ml离心管，3000g离心5min，取200μl用于RNA的提取，剩余部分冷冻保存，用于复检。
4.2三文鱼
4.2.1设备和材料
诺如病毒质控样（中国食品药品检定研究院）、恒温振荡器、食品均值器、天平：感量0.1 g、高速低温离心机（4 ℃，10000 g）、5×PEG8000/NaCl溶液（PEG8000 500±2g，NaCl 87±1g,先用450ml蒸馏水溶解，稍微加热，待溶解后定容至1000ml，121℃，15min灭菌）、磷酸盐缓冲液（PBS pH 7.2）、Tris/甘氨酸/牛肉膏缓冲液（TGBE）( Tris base 12.1±0.2g,甘氨酸 3.8±0.1g，牛肉膏10±1.0g，蒸馏水1000±1ml，121℃，15min灭菌)、氯仿/正丁醇（1:1体积比）溶液。
4.2.2 样品处理程序及方法
（1）取三文鱼样品25 g，剪碎后置于带滤网的均质袋中，加人TGBE缓冲液40 ml，均质均匀，于室温60 r/min震荡20 min。
（2）取滤液至50 ml新的离心管中，4 ℃，10000 g离心30 min。
（3）取上清液（小心避开液体表面的油脂层），加入上清液1/4体积的5×PEG/NaCl 溶液，颠倒60 s，4 ℃，60 r/min震荡60 min。
（4）将上述溶液于 4 ℃，10000 g离心30 min，弃去上清液。向沉淀物中加入PBS 溶液700 μl，震荡重悬。
（5）加入与上述重悬液等体积的氯仿/正丁醇（1:1）溶液，充分振荡，室温孵育 5 min。于4 ℃，10000 g离心15 min。
（6）取上层水相液体200 μl用于提取病毒RNA。
4.3草莓、蓝莓
4.3.1 设备和材料
诺如病毒质控样（中国食品药品检定研究院）、PEG8000（Polyethylene glycol）、氯化钠（NaCl）、氯化钾（KCl）、碳酸氢钠（NaHCO3）、磷酸二氢钾（KH2PO3）、磷酸氢二钠（Na2HPO3）、NaOH溶液（5M）、HCl溶液（1M）、纯水（Milli Q系统净化）、氯仿（Methenyl trichoride）、丁醇（1-Butanol）、牛肉膏（Beef Extract）、甘氨酸（Glycine）、蛋白酶K（Proteinase K）、果胶酶（Pectinase from Aspergilus niger，Sigma）、5×PEG/NaCl缓冲液（PEG8000 500±2 g，NaCl 87±1 g,先用450ml蒸馏水溶解，稍微加热，待溶解后定容至1000ml，121℃，15min灭菌）、TGBE缓冲液( Tris base 12.1±0.2 g,甘氨酸 3.8±0.1 g，牛肉膏10±1.0 g，蒸馏水1000±1 ml，121 ℃，15 min灭菌)、DHZ-D型冷冻恒温振荡器、FE20K型酸度计、小型高速离心机、CR22E型高速冷冻离心机。
4.3.2样品处理程序及方法
（1）取样称取25 g草莓（蓝莓）样本放入滤膜均质袋中，加入40 ml TGBE缓冲液，（取一份样本作为阳性对照，可在这步加入诺如病毒的阳性质控球），以及30单位果胶酶（Pectinase from Aspergilus niger, Sigma）
（2）样品提取室温振荡孵育10 min，测量pH值。若pH<9.0，用NaOH(5M)溶液小心调节至9.5，再振荡孵育10 min。每调节一次pH值后，孵育10 min，直至 pH>9.0；将流出液倒至离心管中（必要情况下使用2个离心管），4 ℃，10 000 g离心30 min；上清移至一新管或瓶，用HCl(1 M)调节pH至7.0±0.5；
（3）样品富集浓缩加入1/4体积的5×PEG/NaCl缓冲液，在4 ℃条件下，于振荡孵育器孵育60 min；4 ℃，10 000 g离心30 min（必要情况下将液体分装于2只离心管）；
弃去上层溶液，4 ℃，再次10 000 g离心5 min以使颗粒紧凑；
弃去上层溶液，用500 μl PBS重悬沉淀。如果一个样品分两管离心，则用同样体积PBS依次重悬；
将重悬液移至新的EP管中，加入等体积的氯仿/丁醇溶液，涡旋混匀，室温孵育 5 min。4 ℃，10 000 g离心15 min，小心将水相转移至新管待提取RNA。
4.4生菜和苗芽菜
4.4.1设备和材料
食品均质器（可拆卸、可清洗、可高压灭菌）、电子天平（感量0.01 g）、台式离心机（最高转速15 000 g）、微型离心机、电热恒温水浴锅（0-100℃）、涡旋振荡器、实时荧光PCR仪、Roche，LightCycler 480。
4.4.2样品处理程序及方法
（1）同一批次的生菜或苗芽菜样品，随机抽取样品数不少于5件，并用灭菌处理的剪刀剪碎至2.5 cm×2.5cm×2.5 cm大小的形状，称量25g放入带有滤膜均质袋一侧中，作为待试样品。另称取200 g样品放入50ml离心管中，－80 ℃保存，留作备样，并做好标记。
（2）向上述均质袋中加入40 ml TGBE buffer，均质器拍打混匀，尼龙扎带封口后，室温振荡约20 min。
（3）将均质袋滤膜一侧液体倾入50 ml 离心管，4 ℃条件下10 000×g离心30 min。
（4）离心结束后，将上清转移至另一50 ml 离心管，加入1/4倍体积的5×PEG/NaCl 溶液，室温条件振荡60 min。
（5）振荡完毕，4 ℃条件下10 000×g离心30 min。
（6）离心结束，弃上清，继续4℃条件下10 000×g离心5 min压实沉淀。
（7）向沉淀加入500 μl PBS溶液以溶解沉淀。吸取溶解沉淀后的PBS溶液200 μl转移至无菌离心管中，作为试样。剩余的溶液分装到离心管中标记作为备样，－80℃冻存。
二、核酸提取
各类样品经前处理后，每个样品分别取200 μl，下面表格中提供的RNA提取试剂盒供参考，按试剂盒说明书操作提取RNA。
样品种类试剂盒
粪便或呕吐物QIAGEN病毒核酸提取试剂盒（QIAamp? viral RNA min i kit ）或
Geneaid 病毒核酸提取试剂盒（Viral Nucleic Acid Extraction
Kit II）
水和环境标本NucliSENS Lysis Buffer和NucliSENS Magnetic试剂盒（梅里埃公
司）
食品标本High Pure Viral RNA Kit（罗氏公司）
三、诺如病毒核酸检测方法
1.方法：（1）样本类型：粪便、呕吐物、肛拭子、水、环境涂抹样；（2）分析方法：采用诺如病毒双重Real-time （TaqMan?）RT-PCR分析：（3）使用范围：ABI 7500 realtime PCR、Smartcycler (Cepheid), Mx3005P, Mx3000P (Stratagene)和ICycler iQTM Real-Time PCR检测系统(BioRad)等。
本设计应用QuantiTect Multiplex RT-PCR Kits (Qiagen)，引物和探针浓度分别被优化为终浓度400 nM和200 nM。每个试剂盒特异的RT最适环境和活化步骤，需要遵循制造说明书使用。该试验方法来自美国CDC诺如病毒暴发网络（CaliciNet USA）双重Real-time RT-PCR操作标准，引物设计参考文献[59]。
2.设备和材料
涡流混合器、微量离心机、移液器（量程为P20、P200和P1000）、Real-time PCR仪可以是ABI 7500 (ABI)、Smartcycler (Cepheid)、Mx3005P or Mx3000P (Strategene)或BioRad iCycler iQTM Real-Time PCR检测系统(BioRad)。一次性手套、带滤芯枪头、无菌1.5ml 微量离心管、RNA酶去除剂、96-孔反应板、盖子或薄膜。
3.诺如病毒寡核苷酸引物/探针
表1多重荧光定量RT-PCR扩增诺如病毒的引物和探针
基因型引物/
探针
序列（5’-3’）工作浓度nM）
GI Cog 1F CGYTGGATGCGITTYCATGA 400 Cog 1R CTTAGACGCCATCATCATTYAC 400 Ring 1A FAM–AGATYGCGATCYCCTGTCCA–BHQ a200 Ring 1B FAM–AGATCGCGGTCTCCTGTCCA–BHQ a200
GII Cog 2F CARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG 400 Cog 2R TCGACGCCATCTTCATTCACA 400 Ring 2 JOE–TGGGAGGGCGATCGCAATCT–BHQ b200
注：a GI TaqMan?探针：5’端用FAM荧光素标记，3’端用BHQ淬灭基团标记；BHQ淬灭基团1更好；b GII TaqMan?探针：5’端用JOE（HEX或VIC等）荧光素标记，3’端用BHQ淬灭基团标记
4.操作方法
（1）实验准备
用RNA酶去除剂擦拭工作台表面、移液器和离心机除去潜在的RNA酶污染。Real time PCR仪开机预热15 min。
（2）试剂准备
所有试剂冰浴；轻弹管壁混合2×QuantiTect Multiplex RT-PCR Master Mix反应液；涡旋所有引物和探针5 s；
QuantiTect Multiplex RT Mix、引物、探针置于冰上。
（3）对照设立
每一次实验都要包括无模板对照(NC)（第一个和最后一个孔各设一个）和阳性对照(PC) （GI和GII诺如病毒核酸或标准品）。
（4）检测
注意：请在PCR清洁区准备、配制反应体系（master mix）。
①在1.5 ml离心管中准备master mix；
②确定每次分析的反应数(N)，需要多配反应数来弥补重复移液中的小量丢失：
如果样本数(n)（包括NC和VC对照）=1-14,做n+1个反应的mix。
如果样本数(n)（包括NC和VC对照）>15,做n+2个反应的mix。
③配制Real-time RT-PCR反应混合液22.5μl（表2）
表2诺如病毒双重反应体系配制方案
组成成分体积（μl）终浓度（nM）RNase-free water 4.25
Cog 1F（10μM） 1 400
Cog 1R（10μM） 1 400
Ring 1A（10μM）0.5 200
Ring 1B（10μM）0.5 200
Cog 2F（10μM） 1 400
Cog 2R（10μM） 1 400
Ring 2（10μM）0.5 200
RNase-free water 4.25
QuantiTect Multiplex RT Mix 0.25
2×QuantiTect Multiplex RT-PCR Master
Mix
12.5 1×
④吸打混匀Master Mix。
⑤按如下方式排列阴性对照、阳性对照和样品，在每孔中加入22.5μl Master Mix。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A NC S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 NC PC
(GI)
PC (GII)
B C D E F
G
H
*阴性模板对照(NC) 加入第一列，样本加入后面的11列，检查加入样本时可能的交叉污染。病毒模板对照(PC在所有样本和NC密封后加入到最后。
⑥加入2.5μl DEPC水到第一个NC孔，盖好。
⑦将反应平板转移到核酸处理区域或清洁区外面。
⑧将RNA样本从－70°C冰箱转移在冰上融化;漩涡振荡5 s之后快速离心5 s，移液2.5 μl RNA样本到标记好的孔。例如, 加样本1 (S1)到平板位置A2和B2。如果样本体积小于2.5 μl, 加DEPC水至反应管使总反应体积达到25 μl。
⑨加2.5 μl水到最后的NC孔，盖好。
⑩最后, 移液GI和GII诺如病毒阳性对照各2.5 μl到适当的PC孔，盖好。
?小心混合平板。
?4℃离心平板0.02 g（500 rpm） 1 min，以移除孔中可能存在的气泡和液滴。
? RT-PCR扩增条件：按照ABI 7500 (or other platform) 的说明书放置好平板。终反应体积为25 μl。根据QuantiTect Multiplex RT-PCR Kits说明书，RT-PCR热循环程序为：
循环数温度（℃）时间
1 50 20min
1 95 15min
45 94 45S
60 45S
5.结果解释
（1）阴性对照（NC）
如果一个或更多NC反应出现假阳性,则可能发生了污染。这种情况下,检测无效，需重复检测。
（2）阳性对照（PC）
阳性对照产生超过阈值的荧光曲线或扩增图像。
（3）检测样本
只有在所有质量控制严格准确时，如果曲线在Ct值为≤40，则认为检测样本为阳性。
四、诺如病毒传统RT-PCR分析
原理：人诺如病毒分为5个基因组（Genogroup，G），其中GI、GII和GIV型可感染人。本方案利用衣壳蛋白的部分区域（region C）来对诺如病毒进行分型。本方案由四个引物组成，扩增ORF2的5’末端，编码主要外壳蛋白VP1。引物G1SKF和G1SKR用于GI的检测，扩增片段330 bp。引物和CoG2F和G2SKR用于GII的监测，扩增片段387 bp。
1.设备与材料
涡流混合器、微量离心机、移液器、PCR仪、微波炉、电泳仪和制胶器。一次性手套、带滤芯枪头、无菌 1.5 ml 微量离心管、RNA酶去除剂、薄壁PCR管（Rnase free，0.5 ml）、Loading Buffer、Qiangen OneStep RT-PCR Kit（货号：210212）
2.诺如病毒寡核苷酸引物/探针（见表3）
表3诺如病毒传统RT-PCR寡核苷酸引物
Region 型别引物名称序列（5’-3’）产物(bp)
C
I
G1SKF (+) CTGCCCGAATTYGTAAATGA
330 G1SKR (+) CCAACCCARCCATTRTACA
II
COG2F (+) CARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG
387 G2SKR (-) CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT
3.操作方法
（1）实验准备
用RNA酶去除剂擦拭工作台表面、移液管和离心机以去掉潜在的RNA酶污染。
（2）试剂准备
①所有试剂冰浴。
②轻弹管壁混合5X缓冲液。
③离心酶、RNA酶抑制剂和dNTPs后将其放在冰上备用
④涡旋所有引物5s，离心5s备用。
（3）对照设立
每次PCR实验都应设置阴性对照和阳性对照，包括诺如病毒GI和GII，阳性对照为阳性粪便样品。
（4）检测
注意：在PCR清洁区配置反应体系。
①用1.5 ml离心管准备反应体系；
②确定每次分析的反应数(N)，在操作需配置过量的反应体系来校正重复移液中的小量丢失；见下面的样本:
?如果样本数(n) （包括NC和VC对照）= 1 - 14, 做 n + 1 个反应的mix。
?如果样本数(n) （包括NC和VC对照）> 15, 做 n + 2 个反应的mix。
③将每个引物对按以下计算量添加到反应混合液中（表4和5）：
表4 诺如病毒Region C反应体系-Genogroup I
成分体积/反应（μl）最终浓度
5XRT-PCR Buffer 5 1 x
dNTP mix 1
Enzyme mix 1
GISKF(50 μM)0.25 500nM
GISKR（50μM)0.25 500nM Rnase Inhibitor (30-40U/
0.50
μl)
Rnase-free water 12
反应体系总体积20
表5 诺如病毒Region C反应体系-Genogroup II
成分体积/反应（μl）最终浓度5x RT-PCR Buffer 5 1 x
dNTP mix 1
Enzyme mix 1
COG2F(50 μM)0.25 500nM
GIISKR（50μM)0.25 500nM
Rnase Inhibitor (30-40U/
0.50
μl)
Rnase-free water 12
反应体系总体积20
④用移液管上下吹打混合液；
⑤向每个反应管中分装20μl混合液；
⑥设立阴性对照，加5μl DEPC水；
⑦将反应管转移到核酸处理区；
预防诺如病毒知识.doc
预防诺如病毒 学校卫生知识普及宣传稿 近期，北京和深圳都发生了诺如病毒疫情，我市疾控中心提醒：目前，正值诺如病毒感染高发季，市民要注意个人卫生，如发现儿童、学生出现聚集性恶心、呕吐、腹泻等症状，要及时就诊并居家隔离治疗，以下知识大家一定要弄懂！ 诺如病毒虽然听起来名字有点唬人，但其实它是一种常见病毒，并不是一种新型病毒。感染后 48 小时内，患者会出现呕吐、腹泻等急性胃肠炎症状，以呕吐症状更多见。冬季又是诺如病毒暴发流行的高发季节，所以诺如病毒感染性腹泻也被称为“冬季呕吐病”。 传播途径：诺如病毒感染性强，通过粪-口途径传播，可通过污染的水源、食物、物品、空气等传播，常在社区、学校、餐馆、医院、托儿所、养老院及军队等处引起集体爆发。 感染原因主要有： 1、食用或饮用诺如病毒污染的食物、水或饮料； 2、接触诺如病毒污染的物体或表面，然后手接触到口； 3、直接接触感染者，如照顾病人、与病人共餐或使用相同的餐具等。 感染性极强： 这是一种感染性极强的病毒，只需要 10 - 100 个病毒粒子就可以致病。要知道，一次呕吐就可以排出数以亿计的病毒粒子。病毒通过气溶胶在空气中弥散，造成聚集性的疫情暴发。如果家中有人感染了诺如病毒，呕吐或腹泻后，记得按照正确的方法及时对被污染的家具、地板和衣服进行消毒——先洒上比如”84”这样含氯的消毒剂，呕吐物最好用消毒粉覆盖30分钟后，再清理。这时候，医用酒精可是无效的。 抗生素无效： 感染诺如病毒之后，是没有特效药物的。感染诺如病毒之后，会腹泻和呕吐，有时候我们会自行服用抗生素，这是错误的方法，抗生素对诺如病毒是无效的，只会造成抗生素的滥用。 好在它是一种自愈性的疾病，和感冒一样。只需要进行对症治疗即可，如果发烧就退烧，腹泻就止泻。值得注意的是，症状消失后的 3 天以内，身上携带的病毒仍然具有强传播力。所以，痊愈后的 3 天，最好不要去人群聚集的地方，以免造成病毒的再次传播。
诺如病毒标本处理和室检测技术方案
附件4 诺如病毒标本处理和实验室检测技术方案 诺如病毒完整的检测及分型流程包括标本前处理、RNA提取、Real-time RT-PCR检测、传统RT-PCR检测、测序和基因分型6个步骤。Real-time RT-PCR方法灵敏度和准确度高，是检测诺如病毒的金标准。用传统RT-PCR可对Real-time RT-PCR阳性标本的PCR产物进行测序，通过序列分析确定诺如病毒的基因群和基因型。在发生聚集或暴发时，ELISA方法可作为辅助的手段快速检测诺如病毒抗原。食品、水、环境涂抹样检测方法的灵敏度不稳定，仅作为参考方法。 一、标本前处理 1.粪便、呕吐物 1.1设备和材料 微量移液器、无菌过滤器、漩涡振荡器、微量离心机、1.5 ml无菌离心管、10 mM pH 值为7.0－7.4的PBS。 1.2 操作方法 （1）离心管每管分装0.5 mlPBS。用一次性移液管（或无菌棒）添加豌豆大小的粪便（约0.1 g），稀释成约10％至20％（重量/体积）的粪便悬浮液。当粪便样品是液态时，不必在PBS中稀释，直接使用500 μl的样品。 （2）漩涡振荡每个样品1 min。在2 400 g下离心5 min，使得固体沉淀。澄清上清液可以直接用于病毒核酸提取或贮存于－70℃。 （3）取澄清的上清液200 μl进行RNA提取。 2.水 通过阴离子滤膜过滤水样品。用牛肉膏（1.5%w/v）含0.05 M甘氨酸（pH9.0）缓冲液洗脱附在膜上的病毒。使用Microsep 100TM 或 CentriconTM columns离心管进一步浓缩洗脱液。 2.1设备和材料 DEPC水、新配置次氯酸盐（至少1%）或等效消毒剂、Millipore HA filter（孔径0.45um、）、换膜过滤器、真空泵、计时器、PH值酸度计、磁力搅拌器及转子、低温冰箱（-20℃、-70℃）、Microsep 100 K columns（PALL公司）、Centriprep YM-50（Millipore公司）、洗脱液（BE-0.05Gly pH7.0）、PBS (pH7.2)、离心机、氯仿、丁醇。 2.2操作方法
植物病毒检测技术研究进展汇总
植物病毒检测技术研究进展 刘茂炎 摘要：随着现代技术的发展特别是分子技术的发展，鉴定和检测病毒的方法越来越多，也越来越精确快速。以PCR为基础的基因工程技术已经广泛应用于病毒核酸分子的鉴定，其高灵敏度和高特异性是与PCR扩增反应的特异性引物相关联的；于此同时传统的鉴定检测技术依然有其发展优势。不论怎样的方法技术，都是以病毒的理化性质以及侵染性为基础的。在此基础上，甚至出现了某些边缘技术在病毒鉴定检测方面的应用。本文主要综述的是对植物病毒鉴定检测技术的研究进展。 关键词：植物病毒；检测技术；PCR 病毒在生物学上特征（如病毒的理化性质，包括病毒粒子的形态、大小、对理化因子的耐受性等）以及在寄主上的反应（如寄主范围、症状表现、传播方式等）是对病毒最直观的认识。常规的对植物病毒的鉴定检测方法有：生物学测定方法、血清学技术、电子显微镜技术、分子生物学技术等。生物学测定依据病毒的侵染性，观察寄主植株或其它生物的症状表现；血清学技术以病毒外壳蛋白(CP)为基础；电子显微镜技术依据病毒的形状大小的不同；分子生物学鉴定则以病毒核酸为基础。 1.生物学鉴定 最直接的方法是目测法，直接观察病毒对植物的病害症状。如烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV），病害症状为叶上出现花叶症状，生长陷于不良状态，叶常呈畸形；玉米鼠耳病的诊断主要依据田间症状表现[1]。目测法因观察的主观性和症状的不确定性的影响而不精准。1929年美国病毒学家霍姆斯（Holmes）用感病的植物叶片粗提液接种指示植物，2~3天后接种叶片出现圆形枯斑，枯斑数与侵染性病毒的浓度成正比，能测出病毒的相对侵染力，对病毒的定性有着重要的意义，这种人工接种鉴定的方法就是枯斑和指示植物检测法。国内报道的水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf fijivirus，RBSDV)可侵染28属57种禾本科植物，该病毒的主要传毒介体是灰飞虱(Laodelphax striatella)，
诺如病毒防治知识宣传
诺如病毒防治知识宣传 一、概述 诺如病毒感染性腹泻是由诺如病毒属病毒引起的腹泻，具有发病急、传播速度快、涉及范围广等特点，是引起非细菌性腹泻暴发的主要病因。诺如病毒感染性强，以肠道传播为主，可通过污染的水源、食物、物品、空气等传播，常在社区、学校、餐馆、医院、托儿所、孤老院及军队等处引起集体暴发。 诺如病毒感染性腹泻在全世界范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童，寒冷季节呈现高发。 二、临床症状 诺如病毒感染主要引起胃肠炎，具有发病急、传播速度快、涉 及范围广等特点。胃肠炎的症状是恶心、呕吐、腹泻等，部分人主诉有头痛、发热、寒战、肌肉疼痛。症状通常持续1-2天。普遍感到病情严重，一日多次剧烈呕吐。症状一般摄入病毒后24-48小时出现, 但是暴露后12小时也可能出现症状。没有证据表明感染者能成为长期病毒携带者，但是从发病到康复后2周感染者的粪便和呕吐物中可以检出病毒。 三、传播途径 诺如病毒主要经消化道传播，传染性强。感染者粪便和呕吐物中 可以发现诺如病毒，可以通过几种方式感染诺如病毒： 食用诺如病毒污染的食物或饮用诺如病毒污染的饮料;
接触诺如病毒污染的物体或表面，然后手接触到口； 直接接触到感染者（如照顾病人，与病人同餐或使用相同的餐具）。 食物和饮料很容易被诺如病毒污染，因为病毒很小，而且摄入不到100个病毒就能使人发病。食物可以被污染的手、呕吐物或粪便污染的物体表面直接污染，或者通过附近呕吐物细小飞沫污染。尽管病毒在人体外很难繁殖，但是一旦存在食品或水中，就能引起疾病。 有些食品在送至饭店或商店前可能被污染。一些暴发是由于食用从污染的水中捕获的牡蛎。其它产品如色拉和冰冻水果也可能在来源地被污染。 四、治疗方法 诺如病毒引起的感染尚无特殊的治疗手段，以对症治疗为主，病 程一般为2~3天，恢复后无后遗症。然而不能喝足够多水来补充呕吐、腹泻丢失的水分，可能出现脱水，需要特殊的医学观察的人包括儿童、年老者和不能自理的所有年龄段人。 五、预防措施 预防诺如病毒感染性腹泻的关键是把好病从口入”这一关，要注意饮食和饮水卫生，养成良好的卫生习惯。 1、保护环境卫生。不乱扔垃圾，不随地大小便，对病人的呕吐物及粪便要及时消毒处理，确保周围环境的清洁；被污染衣物应该用肥皂水彻底清洗； 2、注意饮食卫生，以免病从口入” A、不吃不洁净的食物、不购买街边小店的零食，如：烧烤、串串香、凉
关于计算机病毒检测技术分析
关于计算机病毒检测技术分析 【摘要】计算机的出现改变了人们的生活方式和工作方式，同时也改变了全球经济的结构，逐渐的成为人类物质社会最为重要的组成部分，随着互联网的迅速发展，网络安全问题也日益严重起来。计算机病毒给计算机系统的安全带来了严重的危害，并且造成的损失也比较大，一般认为，计算机网络系统的安全运行来自计算机病毒的攻击，那么研究分析计算机病毒检测技术也就有着极大的现实意义。本文探究了计算机病毒，以及计算机病毒的种类，并且着重分析研究了计算机病毒检测技术，以期提高计算机安全。 【关键词】计算机病毒;检测技术;分析 1.引言 对于计算机的安全广大的安全专家以及用户都是比较担忧的，虽然目前计算机反病毒的技术正在不断的更新，但是反病毒技术仍然是被动的，用户需要应付每一个出现的计算机病毒，并且随着互联网技术的逐渐普及，计算机病毒越来越多的泛滥而出。计算机病毒攻击的方式、传播的方式也在随着社会经济的发展逐渐的变化着，它能够隐形的依附在下载的视频或者资料中，或者利用图片传播等，计算机病毒的传播速度较快，并且危害性也相对较大，那么为了保证计算机的安全使用，就必须要提高计算机病毒检测技术，在计算机没被病毒侵害之前进行检测，并进行杀毒。 2.计算机病毒综述 计算机病毒是一种人为制造的，专门用来破坏或者攻击计算机软件系统，并复制本身传染其他应用程序的代码，随着计算机网络技术的逐渐发展和应用，计算机病毒已经成为信息系统安全的主要威胁之一[1]。计算机病毒能够像生物病毒一样进行繁殖，在程序正常运行的时候，能够进行运行自身复制，也就是说计算机病毒具有繁殖性，再有计算机病毒具有传染性，一旦病毒被复制或者是产生变种，那么它的传播速度是很难预防的，传染性是计算机病毒基本的特征。此外计算机病毒还具有潜伏性，这跟定时炸弹是差不多的，在之前设计好病毒爆发的时间，给人以措手不及，还具有隐蔽性、破坏性等特性。计算机病毒大致上被分为宏病毒、木马病毒、黑客工具、脚本病毒等种类，下面我们将对这些病毒进行系统的分析。 第一，宏病毒，这是脚本病毒中的一种，但是由于其特性故将其分为一类，宏病毒的前缀是Macro，第二前缀是Word、Excel等，较为著名的宏病毒有著名的美丽莎。 第二，脚本病毒，脚本病毒的前缀是Script[2]，脚本病毒的共有特性是使用脚本语言编写的，借助网页进行传播的病毒。
诺如病毒试题及答案
诺如病毒的防控知识培训试题 单位：姓名：成绩： 一、填空 1. 没有证据表明诺如病毒感染者能成为长期病毒携带者，但是从发病到感染者的粪便和呕吐物中可以检出病毒。 2. 诺如病毒属杯状病毒，源于的一所学校引起的一次胃肠炎暴发。 3. 目前，诺如病毒有个种，其中个种能感染人类。在这几个种中已经确认有个型，而新亚型也在不断涌现，这使得疫苗开发变得困难。 二、单选 1.关于诺如病毒感染引起的胃肠炎，说法不正确的是（） A.具有发病急、传播速度快、涉及范围广等特点。 B.症状是恶心、呕吐、腹部痉挛性腹泻。 C.症状通常持续5-7天。 D.症状一般摄入病毒后24-48小时出现，但是暴露后12小 时也可能出现症状。 2.诺如病毒的感染方式，说法不正确的是（） A.食用诺如病毒污染的食物或饮用诺如病毒污染的饮料； B.接触诺如病毒污染的物体或表面，然后手接触到口；
C.照顾病人，与病人同餐或使用相同的餐具)。 D.病毒很小，摄入1000个病毒才能使人发病。 3. 下列说法，错误的是（） A.诺如病毒很难灭活，它们存留在物体表面数天或数周后仍然可以感染人类。 B.可以在冷冻、加热条件下生存，甚至与一些消毒剂共存。 C.诺如病毒携带者粪便和呕吐物中带有数十亿病毒颗粒，少量病毒颗粒即可引起感染。 D.人群对诺如病毒普遍易感，感染后缺乏持久的免疫力,并且产生的免疫力对诺如病毒其他变异株也有保护作用。 三、多选 1. 下列关于诺如病毒急性胃肠炎说法正确的是（） A.诺如病毒可引起急性胃肠炎，主要症状为腹泻、呕吐、恶心和腹痛 B.潜伏期多为48～96小时。 C.儿童患者表现为呕吐为主，成人患者腹泻较多。 D.大多数感染者在1～3天后好转，但小孩、老人和低免疫力低下者可能导致严重脱水。 2. 预防诺如病毒暴发，下列措施正确的是（） A.厨工应保持良好的手部卫生，避免裸手直接接触即食食品。 B.厨工出现腹泻、呕吐等症状时应该避免进入厨房和制作食物。 C.目前尚未有疫苗可以预防诺如病毒感染。 D.呕吐或腹泻后应清洗和消毒被污染的地方和衣物。 四、判断 1.诺如病毒急性胃肠炎潜伏期多在48～96h，最短24h，最长96h。( ) 2. 除符合临床诊断病例条件外，必须在粪便标本或呕吐物中检测出诺如病毒才能成为确诊病例。( )
诺如病毒感染宣传教育知识
诺如病毒感染宣传教育知识 诺如病毒是急性肠胃炎最常见的病原体，该病毒基因多样且高度变异，每隔数年就会出现新变异株，人一生中可多次获得感染。诺如病毒感染通常表现为自限性疾病，预后良好。 临床特征： 最常见的症状是腹泻、呕吐、反胃、恶心和胃痛，其他包括发热、头痛和全身酸痛等。多数患者发病后1-3天即可康复。如频繁呕吐或腹泻，可导致脱水，弓I起严重的健康问题，尤其常见于幼小儿童、老年人和基础性疾病患者。脱水主要表现为少尿、口干、咽干、站立时感头晕目眩，在儿童中可表现为啼哭无泪或少泪、异常瞌睡或烦躁。 传播： 诺如病毒传染性强，所有人群均易感。病人发病前至康复后2周，均可在粪便中检到诺如病毒，但患病期和康复后三天内是传染性最强的时期。通常通过以下途径获得感染： ⑴食用或饮用被诺如病毒污染的食物或水； ⑵触摸被诺如病毒污染的物体或表面，然后将手指放入口 中； ⑶接触过诺如病毒感染患者，如照顾患者、与患者分享食物或共用餐具。
诺如病毒在密闭场所中（如托幼机构、幼儿园、学校、养老院、游船等）传播速度快，易引起暴发。 治疗： 尚无特异的抗病毒药物。患者应补充足够的水分以预防脱 水。轻度脱水时，运动饮料或其他饮品（不含咖啡因或酒精）可起到一定的补水效果，但不能补充重要的营养成分和矿物质，因此，在药店购买口服补水溶液是最有效的治疗方法。严重脱水时应及时住院输液治疗。 预防： ⑴注意洗手卫生，用肥皂和清水认真洗手，尤其在如厕和更换尿布后，以及每次进食、准备和加工食物前。 ⑵水果和蔬菜食用前应认真清洗，牡蛎和其他贝类海产品应深度加工后食用。诺如病毒抵抗力较强，在60C高温或经快速汽蒸仍可存活。 ⑶诺如病毒感染儿童应远离厨房或食物加工场所。 ⑷诺如病毒感染病人患病期至康复后3天内不能准备加工 食物或为其他患者陪护。 ⑸及时用含氯漂白剂或其他有效消毒剂清洗消毒被患者呕 吐物或粪便污染的表面，立即脱掉和清洗被污染的衣物或床单等，清洗时应戴上橡胶或一次性手套，并在清洗后认真洗手。（中国疾
计算机病毒与防范基础知识考试题及答案【最新】
计算机病毒与防范基础知识考试题及答案 (单选);姓名得分: 注:每题5分，满分100分; 1.下面是关于计算机病毒的两种论断，经判断___; (1)计算机病毒也是一种程序，它在某些条件上激活;A)只有(1)正确B)只有 (2)正确;C)(1)和(2)都正确D)(1)和(2)都不正; 2.通常所说的“计算机病毒”是指______; A)细菌感染 B)生物病毒感染; C)被损坏的程序 D)特制的具 计算机病毒知识测试题(单选) 姓名得分: 注: 每题5分，满分100分
1.下面是关于计算机病毒的两种论断，经判断______ (1)计算机病毒也是一种程序，它在某些条件上激活，起干扰破坏作用，并能传染到其他程序中去;(2)计算机病毒只会破坏磁盘上的数据. A)只有(1)正确 B)只有(2)正确 C)(1)和(2)都正确 D)(1)和(2)都不正确 2.通常所说的“计算机病毒”是指______ A)细菌感染 B)生物病毒感染 C)被损坏的程序 D)特制的具有破坏性的程序 3.对于已感染了病毒的U盘，最彻底的清除病毒的方法是_____ A)用酒精将U盘消毒 B)放在高压锅里煮 C)将感染病毒的程序删除 D)对U盘进行格式化
4.计算机病毒造成的危害是_____ A)使磁盘发霉 B)破坏计算机系统 C)使计算机内存芯片损坏 D)使计算机系统突然掉电 5.计算机病毒的危害性表现在______ A)能造成计算机器件永久性失效 B)影响程序的执行，破坏用户数据与程序 C)不影响计算机的运行速度 D)不影响计算机的运算结果，不必采取措施 6.计算机病毒对于操作计算机的人，______ A)只会感染，不会致病 B)会感染致病 C)不会感染 D)会有厄运
病毒分子生物学鉴定常用技术
实验二十三病毒核酸检测常用技术 （Techniques of Detecting Nucleic Acid of Viruses in Common Use ） 近年来随着分子生物学的发展，基因检测技术在微生物学实验室诊断中也取得了长足的进展。由于部分病原微生物的基因组已成功地被克隆并进行了核苷酸序列测定，因此根据病原微生物的基因特点，应用分子生物学技术检测样品中有无相应病原微生物的核酸，从而可以特异、灵敏地判定标本中是否含有相应的病原微生物。在微生物学的研究及感染性疾病的诊断中，最常使用的微生物核酸检测技术有PCR、RT-PCR、核酸杂交等技术，现对病毒核酸（DNA、RNA）的分离、PCR、RT-PCR、核酸杂交等技术的基本原理、操作方法、应用及影响因素等进行概述。 实验 1 PCR 检测传染性喉气管炎病毒核酸 【目的要求】 通过本实验使学生初步了解和熟悉病毒核酸（DNA）的分离与PCR技术的基本原理、操作方法、影响因素和应用。 【基本原理】 鸡传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis, ILT)是由疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科的喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis Virus, ILTV)引起的一种急性上呼吸道传染病, 常表现呼吸困难、产蛋鸡产蛋下降和死亡, 是危害养鸡业发展的重要疫病之一。但在临诊上极易与其它一些呼吸道疾病相混淆, 如禽流感、新城疫、传染性支气管炎、支原体感染等。常规检测IL TV 的方法有病原分离鉴定和血清学试验, 这些方法虽经典，但费时且敏感性差, 不能检测亚临床感染, 而传染性喉气管炎潜伏感染是疾病的一种重要表现形式。聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是目前比较快速、敏感、特异的检测手段，已被广泛应用在病毒核酸检测方面。本实验以PCR方法检测鸡传染性喉气管炎病毒核酸为例，对PCR方法进行介绍。 PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93～94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA 均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍（图23-1）。
诺如病毒知识及预防
病毒简介 显微镜下的诺如病毒诺如病毒感染性腹泻是由诺如病毒属病毒引起的腹泻，具有发病急、传播速度快、涉及范围广等特点，是引起非细菌性腹泻暴发的主要病因。诺如病毒感染性强，以肠道传播为主，可通过污染的水源、食物、物品、空气等传播，常在社区、学校、餐馆、医院、托儿所、孤老院及军队等处引起集体暴发。 传播途径 诺如病毒感染性强，以肠道传播为主，可通过污染的水源、食物、物品、空气等传播，常在社区、学校、餐馆、医院、托儿所、孤老院及军队等处引起集体暴发。疾控专家称，病程为自限性，一般2～3天即可恢复。 诺如病毒的各种传播途径，如牲畜等感染者粪便和呕吐物中可以发现诺如病毒，可以通过几种方式感染诺如病毒： 1、食用诺如病毒污染的食物或饮用诺如病毒污染的饮料；因为病毒很小，而且摄入不到100个病毒就能使人发病。接触诺如病毒污染的物体或表面，然后手接触到口。 2、直接接触感染者，如照顾病人、与病人共餐或使用相同的餐具也可引起传播。直接接触到感染者(如照顾病人，与病人同餐或使用相同的餐具)。 3、食物可以被污染的手、呕吐物或粪便污染的物体表面直接污染，或者通过附近呕吐物细小飞沫污染。尽管病毒在人体外很难繁殖，但是一旦存在食品或水中，就能引起疾病。 4、有些食品在送至饭店或商店前可能被污染。一些暴发是由于食用从污染的水中捕获的牡蛎。其它产品如色拉和冰冻水果也可能在来源地被污染。 临床表现 潜伏期多在24～48h，最短12h，最长72h。感染者发病突然，主要症状为恶心、呕吐、发热、腹痛和腹泻。儿童患者呕吐普遍，成人患者腹泻为多，24h内腹泻4～8次，粪便为稀水便或水样便，无粘液脓血。大便常规镜检WBC<15，未见RBC。原发感染患者的呕吐症状明显多于续发感染者，有些感染者仅表现出呕吐症状。此外，也可见头痛、寒颤和肌肉痛等症状，严重者可出现脱水症状。 诺如病毒会引起胃肠道感染。主要症状为恶心、呕吐、腹部痉挛性腹泻，通常持续1-2天，一般在感染病毒后12-48小时出现症状。
计算机病毒行为特征的检测方法
2012.4 37 计算机病毒行为特征的 检测分析方法 谢辰 国际关系学院 北京 100091 摘要：在研究计算机病毒之前，如果我们能先对被研究病毒的行为特征有足够的了解，那么对于之后的反汇编代码分析以及查杀工作都会起到事半功倍的效果。本文先介绍了计算机病毒行为特征，然后通过实验的方法，利用虚拟机和软件分析技术，从动态和静态两个角度，以new orz.exe 病毒为例，来阐述和总结检测分析计算机病毒行为特征的方法。 关键词：计算机病毒；行为特征；虚拟机；软件分析技术 0 引言 随着互联网技术的日渐普及和高速发展，全球化通信网络已经成为大势所趋。但网络在提供巨大便利的同时，也存在种种安全隐患和威胁，其中危害最大影响最广的莫过于计算机病毒。在网络带宽不断升级的今天，计算机病毒的传播速度和变种速度也随之加快，问题也越来越严重，引起了人们的广泛关注，并成为当前计算机安全技术研究的热点。据国内外各大反病毒公司统计，2008 年截获的各类新病毒样本数已经超过1000万，日均截获病毒样本数万。对于现如今计算机病毒变种的不断增加，反计算机病毒的一个研究方向便是怎样在不对病毒汇编代码分析的前提下，分析出已知或未知的计算机病毒的全部行为特征。 1 计算机病毒行为特征 (1) 传染性 传染性是计算机病毒最重要的特征，是判断一段程序代码是否为计算机病毒的依据。计算机病毒是一段人为编制的计算机程序代码，这段程序代码一旦进入计算机并得以执行，它会搜寻其他符合其传染条件的程序或存储介质，确定目标后再将自身代码插入其中，达到自我繁殖的目的。是否具有传染性是判别一个程序是否为计算机病毒的重要条件。 (2) 非授权性 病毒隐藏在合法程序中，当用户调用合法程序时窃取到系统的控制权，先于合法程序执行，病毒的动作、目的对用户是未知的，是未经用户允许的。 (3) 隐蔽性 病毒一般是具有很高编程技巧、短小精悍的程序，它们一般附着在合法程序之中，也有个别的以隐含文件形式出现，目的是不让用户发现它的存在。如果不经过代码分析，病毒程序与合法程序是不容易区别开来的。 (4) 潜伏性 大部分的病毒传染系统之后一般不会马上发作，它可长期隐藏在系统中，只有在满足其特定条件时才启动破坏模块。如著名的在每月26日发作的CIH 病毒。 (5) 破坏性 病毒可分为良性病毒与恶性病毒。良性病毒多数都是编制者的恶作剧，它对文件、数据不具有破坏性，但会浪费系统资源。而恶性病毒则会破坏数据、删除文件或加密磁盘、格式化磁盘等。 (6) 不可预见性 从对病毒检测方面看，病毒还有不可预见性。不同种类的病毒，它们的代码千差万别。虽然反病毒技术在不断发展，但是病毒的制作技术也在不断的提高，病毒总是先于相应反病毒技术出现。 (7) 可触发性 计算机病毒一般都有一个或者几个触发条件。如果满足其触发条件，将激活病毒的传染机制进行传染，或者激活病毒的表现部分或破坏部分。病毒的触发条件越多，则传染性越强。
上海市诺如病毒感染性腹泻防控方案(试行)
上海市诺如病毒感染性腹泻防控方案 （试行） 为做好本市诺如病毒感染性腹泻防治工作，依据《中华人民共和国传染病防治法》、《突发公共卫生事件与传染病疫情监测信息报告管理办法》、《学校和托幼机构传染病疫情报告工作规范（试行）》和《诺如病毒感染性腹泻防治方案（试行）》等，特制订本方案。 一、目的 及时发现本市诺如病毒感染性腹泻聚集性及暴发疫情，规范进行报告和处置，防范诺如病毒感染性腹泻在本市流行。 二、病例定义 （一）临床表现 潜伏期多在24～48小时，最短12小时，最长72小时。发病突然，主要症状为呕吐和腹泻，可伴有恶心、发热和腹痛。儿童病例以呕吐为主，成人病例腹泻为多，24小时内腹泻4～8次，粪便为稀水便或水样便，无粘液脓血。大便常规镜检通常无炎性细胞，白细胞计数<10/HP，未见红细胞。原发感染患者的呕吐症状明显多于续发感染者，有些感染者仅表现出呕吐症状。此外，有些感染者也可见头痛、寒颤和肌肉痛等症状，严重者可出现脱水症状。 （二）诊断 1.临床诊断病例 主要依据流行季节、地区、发病年龄等流行病学资料、临床表现以及实验室常规检测结果进行诊断。符合以下标准者,可初步诊断为诺如病毒感染：（1）潜伏期24～48h； （2）主要症状为呕吐和腹泻，可伴有恶心、发热和腹痛，儿童病例以呕吐为主，成人病例腹泻为多； （3）病程12～60h； （4）粪便、血常规检查无特殊发现； （5）排除常见细菌、寄生虫及其它病原感染。 2.确诊病例 除符合临床诊断病例条件外，在粪便标本或呕吐物中检测出诺如病毒。 3.聚集性病例 学校、托幼机构等集体单位内同一班级或同一宿舍，１天内发生３例及以上，或连续３天内发生５例以上，以呕吐和（或）腹泻等为主要症状的病例。 4.暴发疫情 学校、托幼机构等集体单位，3天内出现20例及以上临床诊断为急性胃肠炎的病例为疑似暴发疫情；一周内出现20例及以上的诺如病毒感染性腹泻确诊病例为暴发疫情。 三、疫情监测与报告 （一）各级医疗机构肠道门诊开展诺如病毒感染性腹泻监测，对腹泻病例做好登记、诊治等工作。一旦发现同一所学校、托幼机构等集体单位出现呕吐、腹泻等疑似诺如病毒感染性腹泻病例异常增多，立即向所在辖区疾病预防控制中心报告。
诺如病毒的基本知识
附件： 诺如病毒的基本知识诺如病毒，或称诺罗病毒、诺沃克病毒，又称为小圆结构病毒，是一种能引起非细菌性急性胃肠炎的病毒。临床常表现为起病急骤、恶心、呕吐、腹部绞痛和头疼等不适症状，一般感染人口密度较高。在卫生环境差的地方，该病毒由粪便、口水等传播，人食用被污染的蚌类（如牡蛎）也会感染。 诺如病毒生物特性 诺如病毒是“打不死的小强”，对外界的抵抗力较强。这种病毒不管是冷冻数年,还是以60℃的水加热30分钟都能存活,只有在含较高浓度的氯消毒剂作用30分钟后才被杀死。所以污染物只能用漂白粉消毒，要泡半小时以上。 诺如病毒- 传播途径 诺如病毒的感染全年均可发生，尤以冬季较多。而人类是唯一已知的宿主。 传播途径主要有：生吃海鲜容易感染诺如病毒，如生食海贝类及牡蛎等水生动物。非细菌性急性胃肠炎患者的呕吐物及粪便，或者干燥之后通过尘埃感染。 诺如病毒- 临床表现 潜伏期为24-48小时，一般不超过96小时。 临床表现与其他病毒性胃肠炎相似，起病突然，主要症状为发热、恶心、呕吐、痉挛性腹痛及腹泻。可单有呕吐或腹泻，亦可先吐后泻。成人腹泻较突出，儿童呕吐较多。粪便呈黄色稀水便，每日数次至十数次不等，无脓血与黏液。可伴有低热、咽痛、流涕、咳嗽、头痛、肌痛、乏力及食欲减退。 多呈自限性，恢复后无后遗症，预后较好，少有死亡病例。病程长及病情较重者排毒时间也较长，传染性可持续到症状消失后两日。本病免疫期短暂，可反复感染。 诺如病毒- 易染人群 该疾病多发生在学校、家庭、旅游区、医院、食堂、军队等，饮用被病毒污染的水及生食牡蛎等水生动物是引起爆发流行的主要原因。 诺如病毒性胃肠炎的传染源为该病的患者、隐性感染者及健康携带者。主要传播途径是粪口传播。此外，日常生活接触也可引起该病的传播。 诺如病毒以老人和小孩等体质比较弱的人最容易感染。 诺如病毒- 治疗方法 目前尚无特效的抗病毒药物，以对症或支持治疗为主，使用抗生素是没用的，所以在治疗中不要滥用抗生素，诺如病毒感染的潜伏期只有1至2天，自然病程较短，一般患者3天左右即可自愈。 脱水是诺如病毒感染性腹泻的主要死因，所以补水非常重要。对严重病例尤其是幼儿及体弱者应及时输液或口服补液，以纠正脱水、酸中毒及电解质紊乱。 诺如病毒- 预防控制 预防 健康教育加强以预防肠道传染病为重点的宣传教育，提倡喝开水，不吃生的半生的食物，尤其是禁止生食贝类等水产品，生吃瓜果要洗净，饭前便后要洗手、养成良好的卫生习惯。 免疫接种目前尚无理想的疫苗。 加强饮用水卫生要加快城乡自来水建设。在暂时达不到要求的地区，必须保护水源，改善饮用水条件，实行饮水消毒。 抓好饮食卫生严格执行《中华人民共和国食品卫生法》，特别要加强对饮食行业（包括餐厅、个体饮食店、学校周边饮食摊档等）、农贸集市、集体食堂等的卫生管理。食物加工者要严
植物的病毒检测技术
植物的病毒检测技术 植物病毒病害是一类重要病害,几乎在各类作物上都有发生,严重影响农作物的产量和质量,用一般的方法难以防治,是生产上的一大难题。种植无病毒种子、苗木是一种非常有效的防治措施。因而如何对种子、苗木等无性繁殖材料以及在发病早期对植株进行快速准确地检测诊断就显得尤为重要。最初植物病毒检测主要依靠生物学性状,但生物学方法费时费力,检测周期长,而且易受环境条件的影响,反应不稳定、重复性差。目前植物病毒检测主要是血清学检测(以病毒外壳蛋白为基础)和核酸检测,前者主要包括ELISA、快速免疫滤纸测定、免疫胶体金技术、免疫毛细管区带电泳、免疫PCR 等;后者主要有PCR、分子信标、实时RT-PCR和核酸杂交等。 1 血清学检测方法 1．1 酶联免疫吸附测定(ELISA) 酶联免疫吸附测定是一种采用固相(主要为聚苯乙烯酶联板) 吸附,将免疫反应和酶的高效催化反应有机结合的方法,其基本原理是以酶催化的颜色反应指示抗原抗体的结合。该方法首先将同源特异抗体吸附在反应器皿底部，加入欲测试的含病毒的样品，病毒与抗体结合，病毒颗粒被固定，再加入标记的特异抗体和酶的底物，酶与底物反应后会出现有颜色的溶液其强度与病毒浓度成正比，用此方法可测定出病毒的浓度。ELISA方法简单,灵敏度高,特异性强,适于大量样品的检测,目前该方法已被广泛用于植物病毒检测。在此基础上加以改进又发展了一些新的检测方法,如A 蛋白酶联吸附(SPA-ELISA)、斑点免疫吸附(DIBA)、直接组织斑免疫测定( IDDTB) 、伏安酶联免疫分析[1]、快速ELISA 等。 1．2 快速免疫滤纸测定法(Rapid immuno-filter paper assay , RIPA) 快速免疫滤纸测定类似乳胶凝集反应,其原理是把待测病毒的抗体吸附在乳胶颗粒上,通过大颗粒乳胶间接反应小颗粒病毒的存在。所不同的是RIPA使用了一种红色乳胶,从而使检测更加简单和直观。RIPA[2]目测检测提纯TMV 的灵敏度分别可达 5ng/ml～50ng/ml 。 1.3 免疫胶体金技术( Immunogold2label as2say) 免疫胶体金技术最早起源于电镜方面的研究,由于金在生物学上是惰性的,且有良好的电荷分布,可以和蛋白质(如抗体、A 蛋白等)紧密结合,因此广泛应用于生物学和微生物学的各个领域。其原理是用柠蒙酸钠将氯金酸金离子还原为胶体金。胶体金颗粒在适当的条件下,以静电、非共价键方式吸附抗体IgG(或A蛋白)分子,从而形成稳定的IgG(或A蛋白) - 胶体金复合物。通过抗原抗体特异性结合,抗体(或A蛋白)胶体金复合物就可以结合在抗原上。金颗粒吸附在病毒粒体周围,从而得到明显的鉴别性和可见度[3] 。 随着技术的发展,1971年Taylor 等报道了免疫金染色技术( Immunogold staining) ,1981年Danscher又创建了免疫金- 银染色技术( Immunogold-silver staining) 。自1983年首次成功使用胶体金标记的抗体检测植物病毒以来,该技术逐渐被应用于植物病毒的检测。20 世纪80年代发展起来的斑点免疫金渗滤试验(Dot immunogold fitration assay) 是一种快速免疫胶体金诊断技术,该技术以硝酸纤维素膜为载体,利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用,使抗体抗原反应和洗涤在一特殊的渗滤装置中迅速完成,从而大大缩短了检测时间。在此基础上,又建立了更为简
浅谈计算机病毒的检测技术
浅谈计算机病毒的检测技术 摘要：在互联网高速发展的今天，计算机病传染性越来越强，危害性也越来越大。计算机病毒的检测方法主要有长度检测法、病毒签名检测法、特征代码检测法、检验和法、行为监测法、感染实验法、病毒智能检测法等。本文对其特点以及优缺点逐一进行了叙述。 关键词：计算机病毒检测技术 一、引言 Internet改变了人们的生活方式和工作方式，改变了全球的经济结构、社会结构。它越来越成为人类物质社会的最重要组成部分。但在互联网高速发展的同时，计算机病毒的危害性也越来越大。在与计算机病毒的对抗中，早发现、早处置可以把损失降为最少。因此，本文对计算机病毒的主要检测技术逐一进行了讨论。计算机病毒的检测方法主要有长度检测法、病毒签名检测法、特征代码检测法、检验和法、行为监测法、感染实验法、病毒智能检测法等。这些方法依据原理不同，检测范围不同，各有其优缺点。 二、计算机病毒的检测方法 (1)长度检测法 病毒最基本特征是感染性，感染后的最明显症状是引起宿主程序增长，一般增长几百字节。在现今的计算机中，文件长度莫名其妙地增长是病毒感染的常见症状。长度检测法，就是记录文件的长度，运行中定期监视文件长度，从文件长度的非法增长现象中发现病毒。知道不同病毒使文件增长长度的准确数字后，由染毒文件长度增加大致可断定该程序已受感染，从文件增长的字节数可以大致断定文件感染了何种病毒。但是长度检测法不能区别程序的正常变化和病毒攻击引起的变化，不能识别保持宿主程序长度不变的病毒。 (2)病毒签名检测法 病毒签名(病毒感染标记)是宿主程序己被感染的标记。不同病毒感染宿主程序时，在宿主程序的不同位置放入特殊的感染标记。这些标记是一些数字串或字符串。不同病毒的病毒签名内容不同、位置不同。经过剖析病毒样本，掌握了病毒签名的内容和位置之后，可以在可疑程序的特定位置搜索病毒签名。如果找到了病毒签名，那么可以断定可疑程序中有病毒，是何种病毒。这种方法称为病毒签名检测方法。但是该方法必须预先知道病毒签名的内容和位置，要把握各种病毒的签名，必须解剖病毒。剖析一个病毒样本要花费很多时间，是一笔很大的开销。 (3)特征代码检测法
计算机病毒原理及防范技术(精简版)
《计算机病毒原理及防范技术》----秦志光张凤荔刘峭著 43.8万字 第1章计算机病毒概述 1.1.1计算机病毒的起源----第一种为科学幻想起源说，第二种为恶作剧，第三种为戏程序（70年代，贝尔实验室，Core War）, 第四种为软件商保护软件起源说。 1.计算机病毒的发展历史-----第一代病毒，传统的病毒， 第二代病毒（1989-1991年），混合型病毒（或“超级病毒”），采取了自我保护措施（如加密技术，反跟踪技术）；第三代病毒(1992-1995年)多态性病毒（自我变形病毒）首创者Mark Washburn-----“1260病毒”；最早的多态性的实战病毒----“黑夜复仇者”（Dark Avenger）的变种MutationDark Avenger ；1992年第一个多态性计算机病毒生成器MtE,第一个计算机病毒构造工具集（Virus Construction Sets）----“计算机病毒创建库”（Virus Create Library）, ”幽灵”病毒；第四代病毒（1996-至今），使用文件传输协议（FTP）进行传播的蠕虫病毒，破坏计算机硬件的CIH，远程控制工具“后门”（Bank Orifice）,”网络公共汽车”（NetBus）等。 2.计算机病毒的基本特征----1.程序性（利用计算机软、硬件所固有的弱点所编制的、具有特殊功能的程序），2、传染性，3、隐蔽性（兼容性、程序不可见性）4、潜伏性（“黑色星期五”，“上海一号”，CIH）,5、破坏性，6、可触发性，7、不可预见性，8、针对性，9、非授权可执行性，10、衍生性。 1.2.2.计算机病毒在网络环境下表现的特征------1.电子邮件成主要媒介（QQ，MSN等即时通讯软件，可移动存储设备，网页，网络主动传播，网络，“钓鱼”），2.与黑客技术相融合（“Nimda”,CodeRed,”求职信”），3.采取了诸多的自我保护机制（逃避、甚至主动抑制杀毒软件），4.采用压缩技术（压缩变形----特征码改变，压缩算法，“程序捆绑器”），5.影响面广，后果严重，6.病毒编写越来越简单，7.摆脱平台依赖性的“恶意网页”。 1.2.3.计算机病毒的生命周期----1.孕育期（程序设计，传播），2.潜伏感染期，3.发病期，4.发现期，5.消化期，6.消亡期。 第2章计算机病毒的工作机制 2.1.1计算机病毒的典型组成三大模块-----1.引导模块（将病毒引入计算机内存，为传染模块和表现模块设置相应的启动条件），2.感染模块（两大功能-----1.依据引导模块设置的传染条件，做判断；2启动传染功能）， 3.表现模块（两大功能----依据引导模块设置的触发条件，做判断；或者说表现条件判断子模块 2.1启动病毒，即表现功能实现子模块） 2.2.1计算机病毒的寄生方式-----1.替代法（寄生在磁盘引导扇区）；2.链接法（链接在正常程序的首部、尾部、或中间）。 2.2.2．计算病毒的引导过程-----1。驻留内存，2.获得系统控制权， 3.恢复系统功能。 2.4.1.计算机病毒的触发机制----1.日期，2.时间， 3.键盘 4.感染触发， 5.启动， 6.访问磁盘次数， 7.调用中断功能触发， 8.CPU型号/主板型号触发。 第三章计算机病毒的表现 3.1.计算机病毒发作前的表现----1.经常无故死机，操作系统无法正常启动，运行速度异常， 4.内存不足的错误， 5.打印、通信及主机接口发生异常， 6.无意中要求对软盘进行写操作， 7.以前能正常运行的应用程序经常死机或者出现非法错误， 8.系统文件的时、日期和大小发生变化， 9.宏病毒的表现现象，10、磁盘空间迅速减少，11.网络驱动器卷或者共享目录无法调用，陌生人发来的电子邮件，13.自动链接到一些陌生的网站。
LAMP技术在病毒检测中的应用
LAMP技术在病毒检测中的应用 发表时间：2013-01-31T16:04:31.107Z 来源：《医药前沿》2012年第31期供稿作者：吴昊1 孙立新2 叶松1 陆军1 杨庆贵2 [导读] LAMP（Loop-mediated Isothermal Amplification）环介导等温扩增技术，是近年来新兴的分子生物学检测技术 吴昊1 孙立新2 叶松1 陆军1 杨庆贵2 （1安徽理工大学医学院病原生物教研室安徽淮南 232001） （2江苏出入境检验检疫局医学媒介生物监测实验室江苏南京 210001） 【摘要】LAMP（Loop-mediated Isothermal Amplification）环介导等温扩增技术，是近年来新兴的分子生物学检测技术。因其特异性强、等温扩增，反应灵敏、操作简单、产物易检测，此项技术已被用于多种病原微生物的检测。本文综述了LAMP技术的原理以及其在几种常见病毒检测项目中的应用。 【关键词】 LAMP 技术原理病毒检测 【中图分类号】R319 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）31-0064-02 病原微生物带来的卫生问题时常出现，各种检测手段也不断更新。但由于非特异性扩增、反应操作程序复杂、及仪器昂贵等问题，很多方法在疾病爆发时筛查现场和监测站点的应用受到限制。 LAMP技术是由日本学者Notomi等[1]在2000年开发的一种新型快速的扩增技术，它能在一定温度范围内，通过一个步骤在短时间内对目的片段进行大量有效扩增。其具有高特异性、高效性、快速、低成本、易检测、结果易观察等特点，被广泛用于各种病原体检测和研究中并取得了一定的成就。 1 LAMP技术原理 1.1 扩增机制 LAMP技术利用能够特异性识别靶序列上的6个独立区域的两对内、外引物，及具有链置换活性的BstDNA聚合酶启动循环链置换反应来进行靶序列的扩增[1]。反应中，先由外部引物将内部引物扩增所需要的模板扩增出来，然后由内部引物对靶基因片段进行引导合成。由于内部引物所扩增出的片段含有与该引物5’端DNA片段的反相互补序列，因此这些反相互补序列之间形成茎-环结构，同时，另外一条内部引物与也可形成茎-环结构，片段的两端形成哑铃状结构，如此循环往复的过程最后形成花椰菜形状的茎-环结构，可在15min-60min之内实现109-1010倍的括增[2]。 1.2 结果观察 扩增后可以通过琼脂糖电泳后染色进行观察，更可通过扩增衍生物焦磷酸镁进行观察：阳性的样本会出现白色浑浊沉淀，而阴性则无此现象。同时也可以应用SYBR Green I染色，呈现绿色的为阳性，橙色的为阴性[2]。 2 病毒检测 2.1 日本脑炎病毒 日本脑炎又称乙脑，是由日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus)引起的一种常见的蚊媒传染病。JEV的检测方式很多，如血清学，病毒分离等，但耗时繁琐、敏感性特异性都较低。TORINIWA等[3]利用LAMP技术原理建立了快速Real-time RT-LAMP方法，该方法通过扩增JEV病毒的包膜（E）蛋白基因来定量检测JEV病毒，可将检测用时缩短至1h，检测下限为1PFU并与常规RT-PCR具有相似的敏感性。且不需特殊设备、操作方便，有利于推广其在基层的应用。 2.2 西尼罗河病毒 西尼罗河病毒（West Nile Virus，WNV）是引起西尼罗河热的病原体，近年来在世界部分地区的流行并造成了重大的损失。PARIDA 等[4]创立了一种一步法来检测WNV，通过凝胶电泳或者浊度仪来对扩增结果进行判定。结果显示其敏感性比常规RT-PCR高10倍。 2.3 甲型流感病毒 甲型流感病毒（AIV)具有高度传染性，致病性，以及致死率。对甲流病毒的检测方法主要为病毒分离，抗原和抗体检测以及PCR方法，但是过程费时繁琐。POON等[5]设计了特异性引物，利用LAMP技术成功的检测了H1-H3型的AIV，与PCR方法比较阳性符合率为100%，敏感度可达传统方法的100倍。LAMP技术由于其检测的简便快速且高度敏感，可更多的用于现场检测。 2.4 禽流感病毒的检测 禽流感是由禽类A型流感病毒引起的一种急性、高接触性的传染病，可带来重大损失。禽流感检测方法有各类血清学试验以及免疫学实验等。这些方法都存在着如试验周期较长，操作繁琐，检测材料受限制等不足。国内李启明等[8]对H5N1亚型禽流感病毒进行了RT-LAMP检测，验证和分析后证明其特异性与常规方法一致，并且其灵敏度可达到10个拷贝。侯佳蕾等[6]根据H5亚型禽流感病毒血凝素基因序列设计了引物，并建立了一种针对性的检测诊断方法。结果表明，该方法的灵敏度高于一步RT-PCR法。 2.5 口蹄疫病毒的检测 口蹄疫是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一种急性，热性，高度接触性传染病，主要侵害偶蹄兽并给经济带来极大威胁。血清学检测不足以确定整群动物是否带毒而PCR方法由于需要专门的仪器。吴绍强等[7]以灭活的亚洲I型口蹄疫细胞培养病毒为材料，设计引物并建立了口蹄疫病毒RT-LAMP检测法，为口蹄疫现场快速检测提供了有效的方法。 2.6 丙型肝炎病毒（HCV）的检测 HCV是一种常见的病毒，传播途径为母婴传播和血液传播。目前最常用的方法是ELLSA法检测抗原抗体或PCR法。但是由病毒的抗原量极少，所以常规免疫学方法常无法检测出病毒。PCR方法操作复杂繁琐，特异性较低。李启明等[8]利用LAMP技术的原理，利用特殊引物进行了LAMP扩增，成功的检测HCV基因，实验结果阳性符合率高达98%。这一成果证实了LAMP技术的优势。 2.7 严重急性呼吸窘迫综合征冠状病毒（SARS-CoV）的检测 SARS带来的阴影提醒人们对此类病毒检测的重要性。目前临床上对其检测的方法主要有2种。一是检测SARS-CoV抗体，虽然此法灵敏度较高，但在发病初期不能检出。二是Real-time PCR，这种方法可在发病早期检测出SARS-CoV，但是其需要熟练操作技术以及高成本仪器，不适于常规筛查。POON等[9]利用改良LAMP法对人群的鼻咽分泌物样本进行了检测。结果显示SARS病人中的SARS-CoV检出率为