缺失株构建关键步骤

培养基配制：

1）LB 肉汤：0.5% NaCl，0.5%酵母粉，1%胰蛋白胨

2）LB 琼脂固体培养基：0.5% NaCl，0.5%酵母粉，1%胰蛋白胨，1.5%琼脂粉（氨苄平板、庆大氨苄双抗平板）

3）10%蔗糖LB 琼脂固体培养基：0.5%酵母粉，1%胰蛋白胨，1.5%琼脂粉，10% 蔗糖溶液（注：此培养基中不能加入NaCl； 300ml 培养基中加入225ml 水，高压后加入75ml 40%蔗糖，倒平板）

本步骤可用15%蔗糖筛选，放30度过夜。

缓冲液配制：

X-gal：母液20mg/ml，终浓度20μg/ml 此步构建PWM91菌株时可通过蓝白斑初步筛选。选取白色菌落作PCR

接合转移

1）将鉴定阳性的重组克隆菌SM10λpir（供体菌）、霍乱弧菌株（受体菌）

分别接种于5ml 的LB 肉汤中，37°培养过夜，次日以1:50 的比例接种至另一新鲜LB 中，37°振荡培养3h。

2）供体菌和受体菌各取0.5ml 菌液混合，6000rpm 离心5min，弃上清。取1mlLB 悬菌后再次离心，弃上清。用100μl LB 悬菌。

3）将菌液点到经紫外线照射灭菌并平贴于LB 平板上的0.45μm 的微孔滤膜上，菌液吸收后在37°温箱中培养6h。

4）用LB 冲洗滤膜，收集洗液，离心后沉淀重悬于200μl LB 中，涂庆大/氨苄双抗培养基中，37 度培养过夜。

5）在平板上长出的菌落转接一次庆大/氨苄双抗培养基中，37 度培养过夜。进

行

●本试验所用抗生素为氯霉素5ug/ml；氨苄200ug/ml；庆大霉素0.5U/ml 由于

菌落长的较慢，需要48小时才能长出。

●如果用庆大霉素基础培养基、氯霉素5ug/ml；氨苄200ug/ml 菌落也需要48

小时才能长出，并且此培养基对大肠杆菌有很好的抑制生长作用。只是涂平板时要多涂一些菌。

●摸索后经验，1mlLB洗膜后，取10ul直接涂板，能得到单克隆。

再次筛选。

蔗糖筛选

挑取至少10 个转导成功的转化子混合接种于无抗LB 肉汤(或无抗得LA平板划线,此步骤不能省略,因为二次重组在此步骤发生)中，37℃，200rpm 培养至对数中期，将菌液稀释1000 倍后取150μl涂布于含10﹪蔗糖的LB 平板上，30℃

培养至出现单菌落。挑取单克隆菌落分别涂布于阴性和氨苄抗性的LB 平板上，30℃培养，挑选能在阴性LB 平板生长但不能在氨苄抗性LB 平板上生长的单克隆菌进行PCR 鉴定，引物cpxR-D-F1/ cpxR-D-R2。