制药工程原理

1、生物技术制药具有什么特征？

（1）高技术生物技术制药的高技术性主要表现在其高知识层次的人才和高新的技术手段。生物制造是一个知识密集、技术含量高、多学科高度综合互相渗透的新兴产业。

（2）高投入生物制药是一个投入相当大的产业。

（3）长周期生物药物从开始研制到最终转化为产物要经过很多环节:实验室研究阶段，中试生产阶段，临床试验阶段规模化生产阶段市场商品化阶段，药政审批程序。

（4）高风险生物医药是耗资巨大的系统工程，任何一个环节失败都将导致前功尽弃。（5）高收益生物技术可以大量廉价的不易生产的药物，以满足患者治疗的需要，具有巨大的社会经济效益。

2、基因工程制药中，质粒不稳定性如何产生的，如何提高质粒稳定性？

质粒不稳定分分裂不稳定和结构不稳定。质粒的分裂不稳定是工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象，影响因素:一是含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率，质粒丢失率与宿主菌、质粒特性和培养条件有关；二是这两种菌比生长速率差异的大小。质粒的结构不稳定性是dna从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变，质粒的自发缺失与质粒中短的正向重复序列之间的同源重组有关，在无源性的两个位点之间也会发生缺失，培养基条件会对质粒结构不稳定性产生影响。

方法:选择合适的宿主菌、选择合适的载体、选择压力、分阶段控制培养、控制培养条件固定化

3、能谈谈基因工程制药过程中，如何获得目的基因么，至少介绍3种方法？

方法：反转录法、反转录-聚合酶链反应法、化学合成法。

反转录法:为了克隆编码某种特异蛋白质多肽的dna序列，可以从生产该蛋白质的真核细胞中提取mRNA，以其为模板，在反转录酶的作用下，反转录合成该蛋白mRNA互补dna，再以cDNA第一链为模板，在反转录酶或DNA聚合酶I作用下，最终合成编码该多肽的双链DNA序列。

反转录法：①mRNA的纯化②cDNA第一条连的合成③cDNA第二条链的合成④cDNA克隆⑤将重组体导入宿主细胞⑥cDNA文库的鉴定7目的cDNA克隆的分离和鉴定。

反转录-聚合酶链反应法：mRNA经反转录合成cDNA的第一条链，不需要再合成DNA的第二条链，而是在特异引物协助下，用PCR法进行扩增，特异的合成目的cDNA链，用于重组、克隆。

化学合成法的缺点：较小分子蛋白质或多肽的编码基因可以人工化学合成。化学合成法有个先决条件是必须已知其蛋白质的氨基酸顺序，再按相应的密码子推导出DNA的核苷酸序列。

4、用于基因工程制药表达的宿主细胞即受体，有哪些？各有什么优缺点？

基因表达的微生物宿主细胞：原核生物，常用的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌。真核生物，常用的有酵母菌、丝状真菌。

（1）大肠杆菌：优点：细胞内不溶性表达、胞内可溶性表达、细胞周质表达，极少数情况下也可分泌到细胞外。缺点：提取困难、真核蛋白质常形成不溶性的包含体、对蛋白产物不能糖基化、大肠杆菌会产生内霉素很难除去，还会产生蛋白酶破坏目的蛋白质。

（2）枯草芽孢杆菌：优点：分泌能力强，可以将蛋白质产物直接分泌到细胞外，不形成包含体。缺点：不能使蛋白质产物糖基化，有很强的胞外蛋白酶，对产物进行不同程度降解。（3）链霉菌：优点：非致病适用安全，分泌能力强，可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力；变铅青链霉菌限制修饰能力弱，可作为理想的受菌体；已构建一系列有效的载体；下游培养工艺成熟。

（4）酵母：基因组小，世代时间短，有单倍体、双倍体两种形式。繁殖速度快廉价，没有毒性。

（5）丝状真菌：有很强的蛋白分泌能力；能正确的进行翻译后加工，糖基化，有成熟的发酵和后处理工艺。

5、生物技术制药为何要中试？对于基因工程技术制药来说，中试需要考虑哪些因素？

中试可以得到大量产品供临床试验，也可以将中试所得数据供生产设计时参考。

考虑问题:适宜商品化生产的工程菌，设计发酵反应器，选择反应过程，发酵培养基组分，维持生产工艺最佳化的方法，工艺检测方法，工艺控制方法，工艺自动化使用方法，生物催化剂使用，产品提取方法的选择，分离精制技术的选择。

6、基因工程制药过程中，如何实现高密度发酵？以原核表达为例。【这个本来想在发酵工程制药讲，但看来是讲不到了，但希望你能自己学习，基本要点在书43-44页，你可以从41页看起】

①发酵条件的改进：培养基的选择:要尽量选择容易被工程菌利用的营养物质，普遍采用6g/L 的甘油作为高密度发酵培养基的碳源，高密度发酵培养基中各组分的浓度也要比普通培养基高2~3倍，才能满足高密度发酵中工程菌对营养物质的需求。建立流加式培养方式：一般、采用指数流加的方法。提高供养能力：小型发酵罐采用空气和纯氧混合通气的方法也可以采用增加发酵罐的压力的方法，向发酵液中添加过氧化氢，在细胞过氧化氢酶的作用下，细菌可放出氧气供自身使用。

②构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌：阻断乙酸产生的主要途径、对碳代谢流进行分流、限制进入糖酵解途径的碳代谢流、引入血红蛋白基因。

③构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌：培养大肠杆菌蛋白水解酶基因缺陷的突变株

7、基因工程药品的质量控制有哪些？

（1）生物材料的质量控制，主要包括对目的基因，表达载体及宿主细胞的检查。

①目的基因需明确目的基因的来源、克隆经过；②应提供载体的名称、结构、遗传特性及各个组成部分的来源与功能；③宿主细胞应提供宿主细胞的名称、来源、传代历史、鉴定结果及生物学特性；需阐明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞内的状态，证明宿主细胞与载体结合后的遗传稳定性；提供插入基因与表达载体两侧端控制区内的核苷酸序列，详细叙述在生产过程中，启动子与控制克隆基因在宿主细胞中表达的方法及水平。

培养过程的质量控制在工程菌的贮存中要求种子克隆纯而稳定；在培养过程中，要求工程菌所含的质粒稳定，始终无突变；在重复生产的过程中，工程菌表达稳定，始终能排除外源微生物污染。

①生产用细胞库基因工程产品的生产采用种子批系统，并证明种子批不含有致癌因子，无细菌、病毒、真菌和支原体等污染，并用原始种子批建立生产用工作细胞库；建原始种子批需证克隆基因DNA序列，详细叙述种子批来源、方式、保存和预计使用期，保存与复苏时种子的稳定性；对生产的种子，应详细叙述细胞的生长于产品生成的方法和材料，并控制微生物污染；提供培养生产浓度与产量恒定性数据，依据宿主细胞、载体系统稳定性确定最高允许传种代数。②培养过程，培养过程要测定被表达基因分子的完整性及宿主细胞长期培养后的基因型特征依宿主细胞、载体稳定系与产品恒定性，规定持续培养时间，并定期评价细胞系统和产品。培养周期结束时，应检测宿主细胞、载体系统的特性。

纯化过程的质量控制产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯分子批间保持一致性；外源蛋白质、DNA与热源质控制在规定限度以下。

目标产品的质量控制基因工程药物的质量控制主要包括以下几项要求：产品的鉴定、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性①生物活性的鉴定②理化性质的鉴定：非特异性鉴定、特异性鉴定、相对分子质量鉴定、等电点测定、肽图分析、氨基酸组成分析、部分氨基酸序列分

析、蛋白质二硫键分析③蛋白质含量测定④蛋白质纯度分析⑤杂志检测⑥稳定性考察⑦产品一致性保证。

8、如果说某个基因是非常有前景的肿瘤治疗靶标，抑制这个基因表达可以治疗某种癌症。最简单的做法你可以直接敲除该基因就行了【如果能做到的话，^_^】。另一种方式就是制备这个蛋白的抗体，中和抗体类型的，可以直接与体内这个蛋白结合而抵消该蛋白的功能。如果让你从基因工程制药入手，结合抗体工程技术，从技术角度上给个开发这个药物的战略规划，你能在30分钟内解答出来么？要合理合据啊。

从杂交瘤细胞中提取总RNA→RT-PCR获得重链可变区基因片段/RNA→RT-PCR获得轻链可变区基因片段→构建重链基因的表达载体/构建轻链基因的表达载体→筛选阳性克隆→转染细菌→挑选双重转染子→制成原生质体→轻染哺乳类细胞→嵌合抗体的表达

如何制备单克隆抗体及注意事项？传统的细胞融合技术啥情况？如果改用基因工程技术，如何处理？

淋巴细胞与骨髓瘤细胞用融合剂PEG处理，使两细胞融合，把融合细胞选择出来使成为单个细胞，培养杂交瘤细胞，使能产生抗体的杂交瘤细胞克隆化，把以克隆化的杂交瘤细胞进行大量培养和注入小鼠体内，小鼠腹水中含有单克隆抗体。

注意事项：用于免疫的动物应选择与亲本骨髓瘤细胞同一品系的动物、抗原免疫用的抗原尽量设法提高其纯度并保证其活性、融合剂对细胞有毒性，一般采用分析纯规格。浓度越高对细胞毒性越大、防止操作污染。

传统的细胞融合技术：取适量的脾细胞和骨髓瘤细胞进行混合，在聚乙二醇作用下诱导他们融合，时间控制在2min以内，然后用培养液将PEG融合液缓慢稀释

10、我们说单克隆抗体那是前（钱）景杠杠滴诱人啊，但我们又谈到单抗要改造，你能谈谈为啥要改造么？你能简单介绍几种改造的抗体形式么？

降低鼠源性单克隆抗体分子的免疫原性，降低抗体的相对分子质量，以增加组织的通透性。

①人鼠嵌合抗体：人IgC-小鼠IgV；②改形抗体人鼠CDR替换人CDR③Fab完整的L链和Fd

④Fv VH和VL⑤单链抗体VH-多肽-VL⑥单域抗体VH或VL⑦最小识别单位一个CDR

11、能谈谈什么是固定化酶么？固定化酶有哪些优点？

是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。

优点：①固定化酶可重复使用，使酶的使用效率提高、使用成本降低。

②固定化酶极易与反应体系分离，简化了提纯工艺，而且产品收率高、质量好。

③在多数情况下，酶经固定化后稳定性得到提高。

④固定化酶的催化反应过程更易控制。

⑤固定化酶具有一定的机械强度，可以用搅拌或装柱的方式作用于底物溶液，便于酶催化反应的连续化和自动化操作。

⑥固定化酶与游离酶相比更适于多酶体系的使用，不仅可利用多酶体系中的协同效应使酶催化反应速率大大提高，而且还可以控制反应按一定顺序进行。

谈谈你对酶工程制药的认识？

酶工程制药：可初步定义为利用酶的催化性质、动力学性质、可固定化性质生产一种药物或药物中间体的技术体系。它是酶学理论与制药技术相结合而形成的一种新技术

根据其在制药过程中的用途可分为：有治疗作用的药用酶和起催化作用的酶，以及起预处理作用的酶。

酶工程制药的优点①不需要有毒原料；②反应条件温和；③增加原料中原子的利用率；④废物排放少；⑤可以制造出化学方法不能制造的药物。

应用在多个方面：氨基酸生产、丙氨酸生产、抗生素的生产

13、简单谈谈动物细胞工程制药的优缺点？

缺点：培养条件高、成本高，产量低

优点：操作简单、无化学毒性、对细胞的损伤小、分泌胞外、收集纯化比较方便，较完善的翻译后修饰，与天然产品一致。

14、生产用动物细胞的要求有哪些？

从正常组织液中分离的原代细胞、二倍体细胞系可无限传代培养的转化细胞系、用这些细胞进行融合和重组的工程细胞系

我们说单位产量可以影响公司运营成本，以基因工程制药为例，谈谈如何实现外源基因在宿主细胞即受体中的高表达？

①有效的转录起始与基因的高效表达，选择强的可调控的启动子及相关的调控序列，是组建一个高效表达载体首先要考虑的问题。最理想的强的可调控的启动子应该是：在发酵的早期阶段表达载体的启动子被紧紧地阻遏，这样可以避免出现表达载体不稳定，细胞生长缓慢或由于产物表达而引起的细胞死亡等问题。对于原核细胞而言，可分为可诱导型启动子，比如lac,trp,λPr,tac,phoA等，和组成型启动子，如T7噬菌体启动子。而对于真核细胞的表达载体而言，启动子和增强子作为两个重要的转录控制序列，是外源基因在真核细胞中高效表达所必需的。

②mRNA 的有效延伸和转录终止与基因的高效表达。转录开始后，mRNA 开始进行有效延伸，终止以及稳定的积累，在这个过程中，转录物内的衰减和非特异性终止能诱发转录中的mRNA分子提前终止。由于衰减子序列是负调节元件，为保证mRNA转录安全，在表达载体的组建中要尽量避免其存在。为了防止mRNA在转录过程中的非特性终止，抗终止序列元件可加入到表达载体上。③有效的翻译起始与基因的高效表达，在原核细胞中影响翻译起始的因素有：起始密码子、核糖体结合部位(SD)、起始密码子与SD的距离和核苷酸组成、mRNA 的二级结构以及其上游5‘非翻译区序列和蛋白质编码区的5‘端序列等。作为翻译起始，可达到最大效率的一般原则是：1）AUG(ATG)是最首选的起始密码子。GUG,UUG, AUU和AUA 有时也用作起始密码子，但非最佳选择2) SD序列中至少含有AGGAGG序列中的四个碱基3) SD与起始密码之间的距离以9±3为适宜4) 如果在起始密码子AUG后的序列是GCAU或AAAA序列，能使翻译效率提高5) 在翻译起始区周围的序列应不形成明显的二级结构，使翻译起始调控元件易被核糖体识别和结合

6) 通过突变mRNA 5’非翻译区的核苷酸序列，去减少、去除某些stem-loop结构可以提高翻译的起始效率。④mRNA 的二级结构与基因的高效表达无论真核还是原核基因的表达，翻译的起始常被mRNA 不适当的二级结构所影响。二级结构比较松散，无明显的茎环结构，这样有利于复合物的形成，从而使得翻译起始得以有效进行⑤外源蛋白的稳定性与基因的高效表达，外源蛋白质表达后是否能在宿主细胞中稳定积累，不被内源蛋白水解酶所降解，这是基因高效表达的一个重要参数。如何避免外源蛋白被选择性的降解，可采用以下几种方式：1）通过组建融合基因的方法，产生融合蛋白。2）产生可分泌的蛋白3）外源蛋白可以在宿主细胞中以包含体的形式表达，4）选择合适的受体表达系统，如选择蛋白水解酶基因缺陷型菌株，然而这种蛋白酶基因缺陷型细胞，往往生长不正常，且不稳定。应该指出，受体细胞的选择是保证外源基因有效表达的最重要的因素之一。