实验七++细菌的药敏试验及耐药性检测
实验七细菌的药敏试验及耐药性检测
【目的和要求】
1.掌握纸片扩散法（K-B法）、液体稀释法两种药敏试验的原理和方法。
2.熟悉上述两种药敏试验方法的应用。
3.了解几种细菌耐药表型检测的原理、方法及意义。
【试剂与器材】
1．培养基：一般需氧和兼性厌氧菌采用水解酪蛋白（M-H）琼脂或M-H液体培养基（pH7.2~7.4）。对于营养要求高的细菌，则需在M-H培养基中加入其它营养成分。
2．抗菌药物纸片：直径为6.0~6.35mm的滤纸片上，含有一定量的某种抗菌药物。市场有售，但生产厂家须获得国家食品药品监督管理局（SFDA）批准。不同种类的待测菌药敏试验选择不同的抗菌药物，药敏纸片的选择见表7-1。
3．待测细菌接种普通营养琼脂经35℃16~18h的纯培养物。
4. 0.5%麦氏比浊管配制方法如下：
0.048mol BaCl2 (1.17% W/V BaCl2 . 2H2O) 0.5ml
0.18mol H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml
将二液置冰水浴中冷却后混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。用前混匀。有效期为6个月。
5.其它：无菌生理盐水、无菌棉签、无菌试管、酒精灯、镊子、生物安全柜、培养箱等。
【实验内容】
一、纸片扩散法（K-B法）药敏试验
1．原理
将含有定量的抗菌药物纸片贴在已接种待测细菌的琼脂平板表面，纸片上的药物随即溶于琼脂中，并沿纸片周围由高浓度向低浓度扩散，形成逐渐减少的梯度浓度。在纸片周围，一定浓度的药物抑制了细菌的生长从而形成了透明的抑菌环，抑菌环的大小则反映了待测菌对该种药物的敏感程度。
K-B法是由Kirby - Bauer 建立，美国NCCLS推荐，目前为世界所公认的标准纸片扩散法（定性法）。
2．方法
（1）培养基的准备：将无菌M-H琼脂加热融化，趁热倾注入无菌的直径90mm平皿中。琼脂厚为4mm（约23~25ml培养基），琼脂凝固后塑料包装放4℃保存，在5日内用完，使用前应在37℃培养箱放置30min使表面干燥。
（2）试验菌液准备：将待测细菌接种于普通琼脂平板，35℃培养16~18h，然后从平板上挑取数个菌落，于2~3ml无菌生理盐水中混匀后与0.5麦氏比浊管比浊，调整浊度与标准比浊管相同，其细菌浓度相当于108 CFU/ml。
（3）细菌接种：用无菌棉拭蘸取已调试的菌液，在管壁上稍加挤压之后，手持棉拭于M-H琼脂表面均匀划线接种，共划3次，每次将平板旋转60°角，最后沿平板内缘涂抹一周，盖上平板，室温下置3~5min待琼脂表面的水分稍干。
（4）贴纸片用无菌镊子夹取药物纸片平贴在种好细菌的琼脂表面，每个平板可贴4~6种药物纸片。纸片放置要均匀，各纸片中心距离不小于24mm，纸片距平板边缘的距离应不小于15mm。纸片一旦接触琼脂表面，就不能再移动。
（5）培养：贴好药物纸片的平板应于室温下放置15min，然后翻转平板，放35℃培养18~24h之后观察结果。
3．结果观察和报告
将平板置于黑背景的明亮处，用卡尺从背面精确测量包括纸片直径在内的抑菌环直径，测得结果以毫米为单位进行记录，最后参照NCCLS的标准（见附录）进行结果判断，并以敏感（sensitivity）、中度敏感（morderate sensitivity）和耐药（resistant）等程度报告之。
4．注意事项
（1）培养基的成分、酸碱度以及平板的厚度等对试验结果都可以造成影响。购买培养基时应考虑其质量，对每批M-H琼脂平板均需用标准菌株检测，合格后方可使用。制备平板时，注意其厚度并且厚薄要均匀。
（2）药物纸片的贴放要均匀，并且要充分接触琼脂。药物纸片应始终保存在封闭、冷冻、干燥的环境，否则会影响其活性。长期储存须置-20℃的冰箱，日常使用或没用完的纸片应及时放4℃保存，用时须提前1~2 h取出放室温平衡。纸片应在有效期内使用。
（3）菌液浓度也可影响试验的结果，浓度大细菌多时抑菌环减小；菌量少时抑菌环则偏大。此外，菌液配好后应在15min内用完。
（4）培养温度以35℃为宜。平板的堆放不超过2块，防止受热不均。
（5）试验过程严格按要求操作，严格无菌操作。
（6）抑菌环的测量要仔细、精确。
5．质量控制：以新鲜传代的金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853等标准菌株在相同条件下用与常规试验相同的方法测定对同种抗菌药物的敏感性，标准菌株的抑菌环应在预期的范围内。如超出了该范围，则不能向临床发报告，应及时查出原因，予以纠正。标准菌株应每周用M-H琼脂传代，4℃保存。
6．临床意义：用于临床细菌常规药敏检测，监测细菌的耐药变迁，指导临床用药。
二、试管稀释法
1．原理
将待测细菌种于一系列含有不同浓度抗菌药物的液体培养基中，定量测定抗菌药物抑制或杀死该菌的最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration,MIC）或最低杀菌浓度（minimal bactericidal concentration,MBC）。
2．方法
（1）抗菌药物原液的配制：试验用的抗菌药物应为标准的粉剂，选择适宜的溶剂和稀释剂进行溶解和稀释（表7-2），并配成一定浓度（通常为1000U或1000μg/ml）的药物原液。原液以过滤法除菌，小量分装使用，放-20℃以下一般可保存三个月，如果置4℃只能保存一周。
（2）待测菌液的准备：分纯的平板上挑取4~5个菌落，接种于3~5ml M-H肉汤中35℃
培养4~6h，与标准比浊管比浊，校正菌液浓度至0.5麦氏单位之后，再用M-H肉汤按1∶200稀释，并在15min内接种。
（3）试验方法：
1）排列试管：取无菌试管10~15支排列于试管架上，除第一管外，其余每管加入M-H 液体培养基1ml。
2）药物稀释：吸取抗菌药物原液（1000μg/ml）5.12ml和液体培养基4.88ml加入一无菌大试管中，充分混合后，从中吸出2ml分别加入第一、第二管中，每管1ml；第二管混匀后吸出1ml加入到第三管，以此类推直至最后一管，从最后一管吸出1ml弃去；经如此稀释，各管的药物浓度依次为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03μg/ml；另设培养基对照、待测菌生长对照和质控菌生长对照管。
3）细菌接种：将已准备好的菌液分别加入到上述各试验管和对照管中，每管0.05ml，轻轻旋转混匀。
4）培养：置35℃培养12~18h后观察结果。
3．结果判断及报告
将试管拿出逐一对光观察，凡无肉眼可见细菌生长的药物最低浓度即为对待测菌的最低抑菌浓度（MIC）。并以MIC报告之。
如果以0.01ml容量接种环从无菌生长的试管中移种一环于血琼脂平板上划线作次代培养，经35℃培养过夜后，观察能杀死99.9%的种入菌的最低药物浓度即为最低杀菌浓度（MBC）。
4．注意事项
（1）培养基的pH、渗透压和电解质均可影响试验结果。
（2）抗菌药物必须使用标准粉剂，不应使用口服药而影响其含量。配好后的药物原液应在有效期使用。考虑到抗菌药物的效力，不同药物应选择不同的稀释度。
（3）试验过程易污染，应严格无菌操作。
（4）结果应在12~18h内观察，培养时间过长，被轻度抑制的部分细菌可能会重新生长，由于某些抗菌药物不够稳定，时间长了其抗菌活性也会降低，甚至消失，从而使MIC 增高。
5．质量控制：每次试验应选用金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922、粪肠球菌ATCC29212和铜绿假单胞菌ATCC27853等标准菌株在相同条件下作平行试验。如果标准菌株的试验结果超过或低于预期值一个稀释度以上，不应发出临床报告，而应找出差错的原因。
6．临床意义：多用于抗菌药物抗菌效力的测定，新药开发。目前临床的自动化或半自动化的药敏试验多采用与次类似的微量稀释法。
三、部分细菌耐药表型的检测
1．耐甲氧西林葡萄球菌的检测（头孢西丁纸片扩散法）
甲氧西林(methicillin)是一种能耐青霉素酶的半合成青霉素。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA)因多了一个由mec Ａ基因编码的青霉素结合蛋白（PBP2α）而对甲氧西林耐药。这种PBP2α不但与β－内酰
胺类抗生素的亲和力极低，而且具有其他高亲合力青霉素结合蛋白(PBPs)的功能。当其他PBPs被β－内酰胺类抗生素抑制而不能发挥作用时，PBP2α可替代它们完成细菌细胞壁的合成，从而使细菌得以生存。MRSA从1961年发现至今几乎遍及全球，已成为院内感染的重要病原菌之一。因此，开展对MRSA的检测，对于控制医院内感染的流行，指导临床治疗有着十分重要的意义。
（1）原理：同纸片扩散法。由于头孢西丁和苯唑西林较甲氧西林稳定，不易失活，通常使用这两种药物代替甲氧西林测定葡萄球菌的耐药性。
（2）方法：以无菌棉拭蘸取已调试的待测菌液接种于M-H琼脂平板上（同K-B法），再贴上头孢西丁药物纸片（30μg/片）或苯唑西林药物纸片（1μg/片），将平板置于35℃培养24h，之后观察结果。
（3）结果判断：
头孢西丁纸片法：金黄色葡萄球菌抑菌环≥20mm为敏感，≤19 mm为耐药；凝固酶阴性葡萄球菌≥25 mm为敏感，≤24 mm为耐药。
苯唑西林纸片法：金黄色葡萄球菌抑菌环≥13 mm为敏感，≤10 mm为耐药；凝固酶阴性葡萄球菌≥18 mm为敏感，≤17 mm为耐药。
（4）注意事项：
1）头孢西丁法结果观察时应使用反射光线。苯唑西林纸片法结果需对着透射光线观察，抑菌环内有任何可辨别的细菌生长即为苯唑西林耐药。
2）培养温度应为33~35℃，超过35℃耐药的葡萄球菌可能被抑制不能生长而漏检。
2．肠杆菌科细菌产超广谱β-内酰胺酶的检测
超广谱β-内酰胺酶（extended -spectrum β-lactamase,ESBLs）是指能水解青霉素类和头孢菌素类抗生素并扩展到能水解第三、第四代头孢菌素以及单环类抗生素并由质粒介导的β-内酰胺酶。自1983年德国首次发现报道以来，在全世界ESBLs检出率呈现出不断上升的趋势。并具有多重耐药和转移迅速等特点，极易导致院内交叉感染和耐药菌的扩散。产生ESBLs的细菌主要是大肠埃希氏菌、肺炎克雷白氏菌、阴沟肠杆菌，其他如铜绿假单胞菌、变形杆菌属及不动杆菌属也可产生。对ESBLs有多种方法可以进行检测，目前主要采用美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）所推荐的纸片扩散法、稀释法，并分筛选实验和确认实验两步进行。
（1）筛选试验（纸片扩散法）
1）药物纸片：头孢泊肟(Cefprozil,CPD)10μg/片或
头孢他啶(Ceftazidime,CAZ) 30μg/片或
氨曲南(Aztreonam,ATM) 30μg/片或
头孢噻肟(Cefotaxime,CTX) 30μg/片或
头孢曲松(Ceftriaxone,CRO) 30μg/片）
2）方法：将0.5麦氏单位的待检菌液涂抹于M-H琼脂平板上，稍干后，在琼脂培养基表面贴上头孢他啶等药物纸片（同K-B法），之后放35℃温箱中培养16-18h观察结果。
3）结果判断：头孢泊肟抑菌环直径≤17mm
头孢他啶抑菌环直径≤22mm
氨曲南抑菌环直径≤27mm
头孢噻肟抑菌环直径≤27mm
头孢曲松抑菌环直径≤25mm
符合以上任何一项即可认为该菌能产ESBLs。
4）质量控制：以大肠埃希菌ATCC25922做质控，其抑菌环直径应符合CLSI质控范围。以肺炎克雷伯菌ATCC700603做质控，其抑菌环直径应符合以下要求：
头孢泊肟抑菌环直径9~16mm
头孢他啶抑菌环直径10~18mm
氨曲南抑菌环直径9~17mm
头孢噻肟抑菌环直径17~25mm
头孢曲松抑菌环直径16~24mm
（2）表型确证试验（双纸片增效法）
1）原理：克拉维酸可与多数β-内酰胺酶牢固结合，生成不可逆的结合物，为一种非常有效的抑制剂。在同一平板上贴加克拉维酸纸片，可以抑制细菌β-内酰胺酶的作用，从而使头孢他啶等抗菌药物的抑菌环增大。
2）药敏纸片：头孢他啶（30μg/片）
克拉维酸（Clavulanic Acid，CLA，10μg/片）
头孢噻肟（30μg/片）
3）方法：将0.5麦氏单位的待检菌液涂抹于MH琼脂平板上（同K-B法），稍干后，在琼脂培养基表面分别贴上头孢他啶和头孢他啶/克拉维酸，头孢噻肟和头孢噻肟/克拉维酸纸片，置35℃16~18h培养后量取抑菌环直径。
4）结果判断：与单纸片平皿对照，两种药物中的任何一种若加克拉维酸纸片较未加克拉维酸纸片抑菌环直径≥5mm，即为ESBL阳性。
5）质量控制
以大肠埃希菌ATCC25922所测试药物联合克拉维酸后的抑菌环直径与单药抑菌环相比，增大值≤2mm 。
肺炎克雷伯菌ATCC700603：头孢他啶/卡拉维酸抑菌环直径应增大≥5mm；头孢噻肟/克拉维酸抑菌环直径应增大≥3mm。
【结果记录和报告】
表7-1 非苛氧菌常规试验和报告中应考虑的抗微生物药物推荐分组
注：
试验常规抗菌药物选择在标准中分成A、B、C、U四组：
A组所列的抗生素为常规首选药敏试验药物。
B组为临床使用的主要抗生素,尤其在医院感染时使用的抗生素，可在下列情况下使用：①对A组同类抗生素耐药；②标本来源不同时，如三代头孢菌素使用于脑脊液中的肠杆菌，磺胺甲恶唑使用于尿道分离的细菌；③多种微生物感染；④多部位感染；⑤感染流行的控制；
⑤对A组抗生素过敏、耐受或无反应。
C组药物用于对A组药物耐药的流行菌株或对A组药物过敏的病人和某些不常见的细菌（如肠外分离的沙门菌属或耐万古霉素肠球菌）。
U组仅用于尿道中分离的细菌，不作为尿道外分离菌的常规药敏试验。
表7-2 常见抗菌药物原液的溶剂及稀释剂
抗生素溶剂稀释剂
阿莫西林/ 磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液
克拉维酸 0.1 mol/L, pH6.0 0.1 mol/L, pH6.0
替卡西林/ 磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液
克拉维酸 0.1 mol/L, pH6.0 0.1 mol/L, pH6.0
磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液，
头孢匹罗 0.1 mol/L, pH6.0 0.1 mol/L, pH6.0
头孢噻吩及磷酸盐缓冲液水
其它头孢菌素 0.1 mol/L, pH6.0
氨苄西林磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液
0.1 mol/L, pH8.0 0.1 mol/L, pH6.0
亚胺培南磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液
0.01 mol/L, pH7.2 0.01 mol/L, pH7.2
呋喃妥因磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液
0.1 mol/L, pH8.0 0.1 mol/L, pH8.0
氨曲南饱和碳酸氢纳水
头孢泊肟 0.10%碳酸氢钠水
头孢他啶碳酸钠水
萘啶酸， 1/2容量的水，逐滴加1 水
西诺沙星 mol/L NaOH至完全溶解
氟喹诺酮（环 1/2容量的水，逐滴加0.1 水
丙沙星除外} mol/L NaOH至完全溶解
磺胺嘧啶类 1/2容量的水，加2.5 mol/L 水
NaOH至完全溶解
甲氧苄啶 0.05 mol/L乳酸或热水
HCl (终体积为10%)
羟羧氧酰胺磷酸盐缓冲液
菌素二酸盐 0.04 mol/L HCl,置2 h 0.1 mol/L, pH6.0
阿奇霉素 95%乙醇肉汤液体培养基
氯霉素、红霉素 95%乙醇水
头孢替坦二甲基亚砜水
利福平甲醇水，搅拌
细菌分离培养及药敏试验方法及步骤
细菌分离培养方法及操作步骤无菌取血液或脏器、淋巴结划线接种于鲜血琼脂平板或血清琼脂平面培养基、普通肉汤培养基,37℃恒温培养24 h,观察其生长特性。目前细菌分离培养的常用方法有平板划线分离法、加热分离法与实验动物分离法。 平板划线接种法 这就是目前临床上最常用的分离接种方法。它可以从被检病料中通过划线可使细菌分离、分散生长而形成单个菌落(有利于从含有多种细菌的标本中分离出目的菌),以便挑选可疑菌落作纯培养加以鉴定。具体操作: 1、右手持接种环,在酒精灯上火焰灭菌; 图1 病料采集图2 接种环灭菌 2、待接种环冷却后,挑取被检料少许,左手持琼脂平板,以食指为
支点,用拇指与无名指将平皿揭开一空隙。大约20℃时,迅速地将接种环轻轻地涂布在培养基的边缘。 3、在涂布处来回移动作曲线形划线接种。(注意:划线时,以腕力使接种环在琼脂平板表面划动,尽量不要划破培养基,划的线条要密,但不能重复旧线,以免培养物形成菌 苔。) 图3 平板划线接种法 4、划线完毕,合上平皿盖,将琼脂平板倒置,放入37℃温箱内培养
18－24小时。 注意:分离培养用的平板培养基应表面干燥,可于临用前置37℃孵育箱内30分钟,这样表面即干燥有利于分离培养,又使培养基预温,对培养某些较娇弱的细菌有利。 细菌药敏试验方法操作步骤药敏试验就是抗菌药使用以前必不可少的一个基本环节,一个正确的药敏结果能够科学的指导养殖户用药,减少抗菌素使用的盲目性,从而减少养殖户损失。在临床实际生产中具备重要意义。 1、在“超净台”中,用经(酒精灯)火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物,以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式; 用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌,以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后,找到第二点划线至平皿的1/2,依次划线,直至细菌均匀密布于平皿。 图4 接种环划线
微生物抗菌素敏感试验
抗菌素敏感试验 一、实验目的 1、掌握药敏试验（K-B纸片琼脂扩散法）方法、原理及结果判读 2、掌握抗酸染色方法及结果判定 二、实验原理 1、抗菌药物分类： （1）β-内酰胺类：青霉素类和头孢菌素类（硫酶素类、单内酰环类、β-内酰酶抑制剂、甲氧青霉素类) （2）氨基糖甙类：链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、新霉素、核糖霉素、小诺霉素、阿奇霉素 （3）大环内脂类：红霉素、白霉素、乙酰螺旋霉素、麦迪霉素、交沙霉素 （4）四环素类：四环素、土霉素、金霉素、强力霉素 （5）氯霉素类：氯霉素、甲砜霉素 （6）作用于G+细菌的其它抗生素：林可霉素、氯林可霉素、万古霉素、杆菌肽 （7）作用于G-菌的其它抗生素：多粘菌素、磷霉素、、环丝氨酸、利福平、抗真菌抗生素、灰黄霉素 （8）抗肿瘤抗生素：丝裂霉素、放线菌素D、博莱霉素、阿霉素 （9）具有免疫抑制作用的抗生素：环孢霉素 2、抗菌药物敏感试验(antimicrobial susceptibility testing in vitro ) 1）抑菌试验：体外测定抗菌药物抑制细菌生长能力的试验 （1）纸片扩散法（disc diffusion test） K-B纸片琼脂扩散法原理:将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后不断地向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制,从而形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度,并与该药对测试菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关。（2）稀释法（dilusion test） a.将被检菌株接种于一组含有不同稀释度抗菌药物的培养基内 b.37℃18-24小时后，抗菌药物能抑制被检菌肉眼可见生长的最低浓度（MIC）即该菌 对该抗菌药物的敏感度 c.MIC50 MIC90 d.根据MIC和常用剂量时该药所能达到的血药浓度来划定细菌对各种药物的敏感度或 耐药的界限（break point,折点) （3）E试验法（E test） 2）杀菌实验 3）联合药敏试验 4）检测细菌所产生的抗生素灭活酶试验 3、药物敏感性分级 1）敏感（S）
药敏试验实验报告
药敏试验： 用药敏实验进行药物敏感度的测定，以便准确有效的利用药物进行治疗。目前，临床微生物实验室进行药敏试验的方法主要有纸片扩散法，稀释法（包括琼脂和肉汤稀释法），抗生素浓度梯度法（E-test 法），和自动化仪器等。 简介： 体外抗菌药物敏感性试验简称药敏试验（AST），是指在体外测定药物抑菌或杀菌能力的试验。 根据美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)近期推荐的标准，对非苛氧菌（肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌、和其他非肠科杆菌、葡萄球菌属细菌、肠球菌属细菌）和苛氧菌（嗜血杆菌属细菌、淋病奈瑟菌、肺炎链球菌和其他链球菌）选择常规药敏试验的首选药物（A 组抗生素）或临床使用的主要抗生素（B组抗生素）进行药敏试验。 抗菌药对细菌性传染病的控制起到了非常重要的作用，但由于养殖过程中不科学的、盲目的滥用抗菌药，很多致病性细菌产生了耐药性，使得抗菌药对细菌性疾病的控制效果越来越差，不但造成药物浪费，而且还延误病情，给养殖户造成了很大的经济损失。 随着新型致病菌的不断出现，抗菌药的防治效果越来越差。并且各种致病菌对不同的抗菌药物的敏感性不同，同一细菌的不同菌株对不同抗菌药物的敏感性也有差异。长期以来，各种致病菌耐药性的产生使各种常用抗菌药物往往失去药效，以及不能很好的掌握药物对细菌的敏感度，所以一个正确的结果，可供临床医师选用抗菌药物的参
考，并提高疗效。农业部动物检疫所青岛易邦生物工程有限公司动物疫病诊疗中心总结出几套适合基层进行药敏试验的操作方法，现简单介绍如下。 实验步骤： 实验材料 普通营养琼脂培养基：可去生化试剂店购买，做不同细菌的药敏试验可选择不同的培养基，如做大肠杆菌的药敏试验可选择普通营养琼脂或麦糠凯培养基。做沙门氏菌可选择血清培养基。 药敏试纸：购买或自制（详见实验准备） 细菌：待做药敏试验的细菌 仪器：接种环、酒精灯、打孔器、牛津杯、移液器、滴头 实验准备 2.1 药敏片的准备：购买或自制 2.1.1 制备方法：取新华1号定性滤纸，用打孔机打成6毫米直径的圆形小纸片。取圆纸片50片放入清洁干燥的青霉素空瓶中，瓶口以单层牛皮纸包扎。经15磅15-20分钟高压消毒后，放在37℃温箱或烘箱中数天，使完全干燥。 2.1.2 抗菌药纸片制作：在上述含有50片纸片的青霉素瓶内加入药液0.25毫升，并翻动纸片，使各纸片充分浸透药液，翻动纸片时不能将纸片捣烂。同时在瓶口上记录药物名称，放37℃温箱内过夜，干燥后即密盖，如有条件可真空干燥。切勿受潮，置阴暗干燥处存放，有效期3-6个月。
特殊细菌药敏试验规范化操作系列
特殊细菌药敏试验的规范化操作 一、目前我国细菌药敏试验现状 20年以来，我国在卫生部和各地临床检验中心和检验学会的共同努力下引进CLSI药敏系列标准，使全国微生物实验室能在同一标准下进行质量控制活动。当前，微生物实验室对常见临床分离细菌的药物敏感试验的水平已有了显著的提高，但对特殊细菌的药敏试验的各个环节的规范操作还不能得到普及，对目前还无折点的细菌能否做药敏试验，以及如何判断细菌的药物敏感和耐药，仍然概念模糊，有待进一步规范和普及。 目前常见错误做法： （一）铜绿假单孢菌的药敏判断标准用于其他非发酵细菌；嗜血杆菌的标准用于卡他莫拉菌等的错误做法时有发生。 （二）借用同属细菌敏感标准 （三）借用同类抗生素的敏感标准 二、各菌属的药物敏感性报告及试验方法的CLSI药敏标准 （一）“嗜麦芽”菌属药敏报告标准 1.CLSI对“嗜麦芽”纸片药敏判断标准 药物名称纸片含量ug/片耐药 R 中介I 敏感S 米诺环素30 ≤1415-18 ≥19 左氧氟沙星 5 ≤1314-16 ≥17 复方新诺明 1.25/23.75 ≤1011-15 ≥16 2.CLSI对“嗜麦芽”稀释法判断标准 药物名称S I R 替卡西林/棒酸≤16/232/2-64/2 128/2 头孢他定≤816 ≥32 米诺环素≤48 ≥16 左氟沙星 2 4 ≥8 复方新诺明≤2/38- 4/76 氯霉素≤816 ≥32（二）无折点细菌的药物敏感试验报告 1. 其他药物的敏感性报告: CLSI推荐的药物可以报告MIC值和敏感度（S、I、R），临床需要的其他药物的药敏试验报告可以直接报告MIC值但不报告S、I、R。 2. 不要用认为相近细菌的折点代替报告S、I、R，这会误导医生用药。
细菌鉴定和耐药性检测方法的发展
细菌鉴定和耐药性检测对于指导临床精确用药和及时治疗患者具有重要意义。目前临床上进行细菌鉴定和耐药检测仍以表型检测方法为主，主要包括：传统手工鉴定与药敏实验方法、自动化药敏鉴定系统。传统方法虽然能够满足临床的部分需要，但这些方法仍然存在一些缺点，例如检测时间较长和检测结果不够准确等。因此，随着分子生物学技术在临床检验领域的应用，近年来发展了一系列快速细菌鉴定和（或）耐药检测技术，例如基于ＰＣＲ技术和ＤＮＡ探针杂交以及生物芯片技术等，这类方法的特点是快速而准确，一般在几个小时之内就可以得到检测结果。 １传统方法在细菌鉴定和耐药性检测中的应用临床手工细菌鉴定和细菌药敏实验，是临床上尤其在中小医院应用最广泛的方法。细菌鉴定主要是根据细菌对生化物质的代谢特点进行，药敏方法包括纸片扩散法（常规实验室使用较普遍）和抗生素稀释法（ＭＩＣ法）等。这些方法的特点是方便、易操作，成本低，而且灵活性强，测定的细菌和药物可灵活选择。其缺点是操作烦琐、经验依赖性强、报告结果慢，不能完全适应临床治疗的需要。 使用自动化药敏和鉴定系统，是临床微生物学实验包括体外药物敏感实验的发展方向。最有代表性的是ＶＩＴＥＫ－ＡＭＳ微生物自动分析系统，可同时完成细菌鉴定和药敏实验。该套系统的检测卡片分为１４种，每一种鉴定卡片含有２５种以上的生化反应指标，基本与常规检测鉴定相同。此方法的优点是简便、快速、鉴定范围广，受人为的影响小，可靠性高。但它仍需要细菌培养的步骤，准确性也受到一定限制，同时其耗材价格较为昂贵。使用这类仪器的主要是三级甲等以上的大型医院。在细菌快速鉴定方面最有代表性的是ｍｉｎｉ－Ｖｉｄａｓ全自动免疫分析仪，其原理是应用细菌的特异性抗体对细菌进行鉴定，以荧光为标记，进行自动化检测。其最大优点是速度快，可以在４０ｍｉｎ内快速鉴定沙门氏菌、大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７、单核李斯特菌，空肠弯曲杆菌和葡萄球菌肠毒素等。但检测指标过少，主要限于这几种菌，而且也不能进行药敏实验。 目前，微生物鉴定技术中除了少数医院使用半自动、全自动的细菌鉴定仪外，大多数医院主要还是使用常规鉴定技术进行细菌菌种的鉴定。 ２分子生物学技术在细菌种属鉴定中的应用采用与系统发育学相关的基因实现对细菌血清型的分型，越来越成为一种趋势。目前，利用基因检测方法对细菌进行种属鉴定所涉及的基因包括细菌１６ｓｒＲＮＡ基因或５ＳｒＲＮＡ序列、ＨＳＰ基因家族、ｇｙｒＢ基因以及细菌特异基因等。 ２．１利用１６ＳｒＲＮＡ基因序列作为分类依据的原因利用１６ＳｒＲＮＡ基因序列对细菌进行菌种鉴定在目前应用较多，也越来越被临床所接受。在细菌分类学著作中，如《伯杰氏系统细菌学手册》，越来越倾向于选择１６ＳｒＲＮＡ基因序列作为分类的依据。主要原因有下面几点： ２．１．１ｒＲＮＡ存在于所有生物中，在生物进化过程中其功能保持不变。１６ＳｒＲＮＡ基因普遍存在于原核生物中，在真核生物中其同源分子是１８ＳｒＲＮＡ。２．１．２１６ＳｒＲＮＡ最能反映细菌间的亲缘关系。在１６ＳｒＲＮＡ分子中，既含有高度保守的序列，又含 细菌鉴定和耐药性检测方法的发展文章编号：１６７２－３３８４（２００６）－０４－００３９－０６ 【作者】杨华为蒋迪王璨赵传赞高华方 生物芯片北京国家工程研究中心（北京１０２２０６） 【中图分类号】Ｒ９１５【文献标识码】Ｂ
细菌药物敏感试验实验报告
细菌药物敏感试验实验报告 药物敏感性试验的基本原则 1药敏试验检测获得性耐药，不必测试天然耐药： 天然耐药是细菌菌种固有的特征，耐药基因一般位于染色体，可以长期稳定遗传，表现为对某类或某种药物的天然耐药。天然耐药信息一般由基础医学和临床文献提供。部分天然耐药，体外试验条件下可能无法检测出来，因而导致假敏感，如果报告将成为极重要错误，严重误导临床。常见菌种对各类药物的天然耐药见文献。实验室全体人员应熟知这些信息，可将其发给临床学习和参考。 2药敏试验测试的前提条件： 实验室应具备相应检测的人员能力、客观条件、结果解释依据。标本处理、菌株分离鉴定、药敏试验操作等环节规范、标准、结果可信；具备对结果的解释能力，能够提供临床会诊服务。临床常规工作，分离株(可能)有临床意义而非定植或污染时，才可进行药敏试验。 错误示例：来自痰标本的溶血葡萄球菌，未作标本质量评估和半定量培养，进行药敏试验；来自粪便标本肠球菌属进行药敏试验等。 3测试结果应准确： 实验室应遵照CLSI文件或相关规范建立本医院药敏试验的质量管理
体系。质控菌株、频率、质控范围符合相关要求；定期参加实验室室间比对项目。建议保留菌株，以便复核。 具体的专业要求 1标本类型 临床微生物学的一大特点是标本种类繁多，而不同药物在这些部位的分布不同。标本的规范采集、质量保证、立即运送和有效保藏有赖于临床、实验室以及相关各方的密切合作。在规范临床送检的前提下，实验室进行药敏试验和报告药敏结果时，应首先考虑标本的特殊性。实际工作中需重点考虑的标本如下。 1．脑脊髓液： 正常和疾病状态不能穿透血脑屏障的药物，常规不应报告。报告审核时，对于分离自脑脊髓液的菌，下列药物不能报告：仅有口服剂型的抗菌药物、一、二代头孢菌素(除外静脉用头孢呋辛)、头霉素类、克林霉素、大环内酯类、四环素类和喹诺酮类。
临床微生物检验和细菌耐药性监测分析
临床微生物检验和细菌耐药性监测分析 摘要目的深入分析临床微生物检验和细菌耐药性监测。方法收集尿液、分泌物、血液等检测标本，对药敏使用常规方法以及KirbyBauer方法进行试验并鉴定分析。结果本次研究分离出的致病菌株共500株，其中包括革兰阳性球菌270株（54.0%），革兰阴性杆菌230株（46.0%）；各个菌种对于抗菌药物的耐药率均不同。结论加强临床微生物的检验工作，以及对细菌耐药性进行监测，能够为临床抗菌药物的选择提供借鉴作用，对控制医院感染率具有十分重要的临床作用和意义，值得在临床实践中大力推广。 关键词临床微生物检验；细菌耐药性；监测 细菌耐药性（抗药性）指的是细菌对抗菌药物存在不同程度的耐受性，如果细菌产生耐药性后，会使临床抗菌药物的化疗效果受到很大的影响，使药物的治疗作用大大降低，从而直接影响到患者的治疗效果，因此加强临床微生物的检验工作，并对细菌耐药性进行监测具有十分重要的意义[1]。本次研究选取于2013年11月～2015年7月收集的尿分泌物、血液等检测标本进行微生物检验，以及对细菌耐药性进行监测，现报告如下。 1 资料与方法 1. 1 一般资料选取2013年11月～2015年7月本院收集的尿液、分泌物、血液等检测标本，按照常规方法对所有细菌进行培养、鉴定以及分离，共获得致病菌株500株。 1. 2 方法对收集的尿分泌物、血液等检测标本先采用常规方法分离病原菌，然后采用KirbyBauer 方法进行试验并鉴定分析，对相关抗菌药物最小的抑菌浓度使用肉汤稀释的方法进行检测，参考美国临床试验委员会制定的标准对以上检验结果进行鉴定并分析[2]。本次研究使用的抗菌药物药敏纸片为革兰阳性球菌药敏板条P535和革兰阴性杆菌药敏板条GN09、GN13，均为法国生物梅里埃公司生产。 2 结果 2. 1 菌种分布情况本次研究分离出的致病菌株共500株，其中包括革兰阳性球菌270株（54.0%），革兰阴性杆菌230株（46.0%）。其中67株（1 3.4%）凝固酶阴性葡萄球菌，66株（13.2%）铜绿假单胞菌，60株（12.0%）大肠埃希菌，57株（11.4%）金黄色葡萄球菌，57株（11.4%）枸橼酸菌属，50株（10.0%）不动杆菌属，44株（8.8%）变形杆菌属，36株（7.2%）克雷伯菌属，33株（6.6%）肠杆菌属，30株（6.0%）肠球菌。研究表明，凝固酶阴性葡萄球菌在耐甲氧西林中所占的比例要比金黄色葡萄球菌高很多，并且不动杆菌在革兰阴性菌中的比例也呈现出大幅度上升的趋势，同时发现的嗜麦芽寡养单胞菌以及洋葱克伯霍尔德菌均较为罕见。
南方医科大学微生物实验报告
2016年南方医科大学医学微生物学实验报告 日期 2016年5月22号 一、实验目的 1、掌握培养基制备的原则和一般方法。 2、掌握病原菌的分离与培养方法。 3、掌握油镜的正确使用、细菌涂片标本的制备、革兰氏染色法，熟悉细菌基本形态。 4、熟悉几种常用的细菌生化反应的名称、原理、方法、结果分析及用途。 5、掌握血浆凝固酶试验的原理、方法及用途。 6、熟悉药物敏感性试验方法的种类、原理及应用，掌握纸片扩散法。 7、掌握玻片凝集试验的原理、方法、结果观察与判断。 二、实验器材 1、天平、称量纸、干粉培养基、锥形瓶、量筒、15支试管、试管架、试管筐、5ml 刻 度吸管、平皿、洗耳球、酒精灯 2、脓汁标本1支，粪便标本1支；伊红美兰平板2个，营养琼脂平板2个，伊红美蓝 平板2个，接种环，酒精灯 3、斜面4支、细菌分离培养物（上次实验平板） 题目 脓汁和粪便标本中病原菌的检测 成绩 实验者 作者：马浩楠 3140020007 参与者名字：马浩楠 丁超 王尧鑫 桂文茁 年级专业 2014级医学影像专业 指导老师 罗军
4、斜面培养物4支，营养肉汤4支，生理盐水2支，镜油瓶、拭镜纸1套，吸水纸1 本，载玻片4张，染色瓶，染色架 5、斜面培养物4支，营养肉汤培养物（菌液）4支，半固体琼脂4支，营养琼脂平板4 个，糖发酵管1套，抗菌素纸片1套，眼科镊子2把 6、半固体培养物4支，药敏试验培养物4个，微量发酵管培养物1套。 三、方法与步骤 1、培养基的制备： 培养基称量干粉培 养基(g) 水量(ml) 煮沸(次）分装(ml) 备注 营养琼脂11.4 300 3瓶，500ml 瓶，平板 营养琼脂 2.7 70 3 5 14支×3，中试管，斜面 营养肉汤 1.3 60 1 3 20支×2，小试管，肉汤 半固体琼脂 1.7 60 3 4 14支×3，小试管，高层 （1）营养琼脂培养基的制备：称量11.4g琼脂，置于三角烧瓶中，加入300ml蒸馏水，分2瓶装，用于倒平板。 （2）营养琼脂培养基的制备（用于制作斜面）：称量2.9g琼脂，置于三角烧瓶中，加入75ml蒸馏水，放在电炉上，先后煮沸3次，分15支中试管装，每支试管5ml。 （3）肉汤培养基的制备（用于制作液体培养基）：称量1.1g琼脂，置于三角烧瓶中，加入50ml蒸馏水，放在电炉上，煮沸1次，分15支小试管装，每支试管5ml。 （4）半固体琼脂培养基的制备：称量1.7g琼脂，置于三角烧瓶中，加入60ml蒸馏水，放在电炉上，先后煮沸3次，分15支中试管装，每支试管4ml。 2、细菌的分离培养 平板划线分离法
细菌耐药性监测及预警机制
细菌耐药性监测及预警机制 多重耐药菌感染已成为延长患者住院时间、增加医疗费用和导致患者死亡的重要原因。为了加强对多重耐药菌感染监控与细菌耐药预警，更好地为临床合理使用抗菌药物提供科学依据，依照卫生部卫办医政发（2011）5号《多重耐药菌医院感染预防与控制技术指南（试行）》、卫生部（卫生令第84号）《抗菌药物临床应用管理办法》及卫办医政发（2009）38号《关于抗菌药物临床使用管理有关问题的通知》的精神，结合我院具体情况，现就建立完善细菌耐药监测与预警机制相关工作要求如下，请科室立即遵照执行。 一、临床科室 （一）对多重耐药菌感染患者或定植高危患者要进行监测，高危患者：（如1、长期住院患者；2、在ICU内；3、高龄、营养不 良及慢性疾病病人；4、机体免疫低下；5、前期使用多种抗生 素；6、外科手术、创伤及烧伤；7、侵袭性诊断；8、使用呼 吸机；）通过对无感染症状患者的标本（如鼻试纸、咽试纸、 伤口、气道内、肛试纸或大便）进行培养、监测，发现MDRO 定植患者；及时采集有关标本送检，并追踪结果，以及时发现、早期诊断多重耐药感染患者。属医院感染，应在24小时内填 《医院感染上报表》报告感控科。 （二）科内及科间告知制度： 1、主管医生发现或接到检验科室多重耐药菌感染病例报告，应立即开“特殊疾病护理”医嘱，报告科室主任及科室感控员。
2、感控员应在早交班上告知全科医护人员。 3、护士感控员落实消毒、隔离措施，并填报《耐药菌控制措施督查表》。 4、责任护士负责告知家属及陪护人员相关隔离常识。 5、主管医生根据患者治疗情况判断解除隔离的时机，如果患者转科/转院或死亡，护士做好多重耐药菌患者床单元的终末消毒。 6、转床、转科、送医技科室辅助检查或需要手术治疗时应告知相关科室的接诊医生或护士，做好消毒隔离。 7、感控员及时对耐药感染预防控制措施的有效性进行追踪总结。（三）科室短时间内发生特殊耐药表型或3例以上名称相同、耐药表型相同的耐药菌病例，应立即向感控科报告。班外时间、 节假日报院总值班，院总值班通知感控看负责人。 （四）科室应按《多重耐药菌管理流程》落实相关院感防控措施。（五）应了解医院前五位目标细菌及科室（重点科室）前五位目标细菌名称及耐药率，根据细菌耐药性情况分析和耐药预警报 告，指导经验性使用抗菌药物。 二、检验科 （一）应及时对临床送检标本进行细菌培养及药敏，发现多重耐药菌应填写《多重耐药菌病人交接班登记本》并及时通知 临床科室，及感控科。 （二）一旦发现特殊耐药表型或短时间内某一病区有3例及以上某耐药表型相同病原菌，应立即通知感控科及相关临床科
细菌耐药性监测分析中应注意的问题
细菌耐药性监测分析中应注意的问题 摘要：细菌耐药性监测对于了解本地区细菌耐药性现状和发展趋势、指导临床合理使用抗生素具有重要意义。为此，临床微 生物学工作者应认真掌握临床常见细菌的某些特性及抗生素的相关知识，如天然耐药性、罕见耐药谱型、易产生选择性耐药的抗生 素及代表性药物在药敏试验中的作用。因为这些知识对于如何解释药敏试验结果和监测数据分析时至关重要。 关键词：耐药性监测；天然耐药性；耐药谱型 体外细菌药敏试验最重要的是如何对其结果进行分析和判读，而不是仅将结果记录并报告给临床医生。为此，本文简要介绍美国临床实验室标准委员会［１］（ＣＩ。ＳＩ／ＮＣＣＬＳ）和英国抗感染化疗委员会［２］（ＢＳＡＣ）有关耐药谱型分析和解读的有关内容，其目的是帮助临床微生物实验室工作人员（１）了解临床常见菌种天然或固有耐药性；（２）发现异常和罕见的细菌耐药表型；（３）了解对特殊菌种易引起选择性耐药的抗菌药物，建议临床医生尽可能不用或避免长期使用；（４）认识代表性药物在药敏试验中的作用。 尽管国内临床常见菌种的耐药谱型与国外情况有不同之处，常出现与下述谱型存在差异和矛盾的地方，但这并不影响我们在监测数据分析时发现不足和缺点，提高监测数据的质量。１天然或固有耐药的菌属或菌种 有些菌属和菌种对某些抗菌药物天然耐药或固有耐药。因此，若药敏试验的结果为敏感应予以怀疑，有必要重复药敏试验和重新鉴定菌种，同时，细菌天然耐药也可作为菌种鉴定的辅助手段之一。表１列举了临床常见细菌的天然耐药表型。２罕见耐药谱型影响体外药敏试验结果的因素很多，因此，加强临床微生物实验室的质控工作至关重要［３３。当质控菌的结果在ＣＩ．ＳＩ／ＮＣＣＬＳ要求的允许范围内，所出现的异常或罕见耐药表型应引起实验室工作人员的注意。 表２中介绍的耐药谱型在世界范围内均属罕见，如在日常药敏试验中发现并经复试依然出现相同的结果，应该将菌株送到参考实验室进行核实。 ３易产生选择性耐药的抗生素和致病菌组合 某些抗生素容易诱导某些菌种产生耐药性，因此，应避免选择这些抗生素进行特定感染的治疗，或尽可能避免长期使用这类抗生素。表３列举了主要易诱导产生耐药性的抗生素和致病菌组合。 ４代表性药物在药敏试验中的作用 代表性药物在药敏试验中的作用不仅仅局限于该抗生素本身，还代表与其相关的抗菌药物。如葡萄球菌对头孢西丁耐药表明它对所有ｐ一内酰胺类抗生素耐药（表４）。 ５从耐药表型推论耐药机理 根据机制和表型的有关知识，可以从不同的细菌表型组合来推断其耐药机制，其目的可以（１）估计耐药特性菌株的分布；（２）确定菌种鉴定和药敏试验结果的正确性；（３）推荐抗菌药物的选择。 ５．1β-内酰胺类抗生素 β-内酰胺类抗生素的耐药机制和表型很多，由于临床微生物实验室的常规试验不可能包括很多的ｐ内酰胺类抗生素，因此，表５～８有一定的局限性。但根据表中的基本原则，依然可以提供有意义的参考价值。 诱导型ＡｍｐＣ酶（肠杆菌属、弗氏柠檬酸杆菌）头孢西丁耐药，但与甲氧亚氨基８一内酰胺类抗生素不交叉耐药；去阻遏ＡｍｐＣ酶头孢他啶、头孢噻肟和头孢西丁耐药。通过比较含酶抑制剂的复合口一内酰胺类和不耐酶青霉素类抗生素的药敏结果，可以得出较
实验11-抗生素的抑菌试验
实验十一抗生素的抑菌试验 一目的要求 1、掌握纸片法测定抗生素抗菌作用的基本方法 2、了解抗生素的抗菌谱 二实验原理 抗生素是某些植物与微生物生长到对数期前后所产生的次生代谢产物，其在低浓度下可其它微生物生长具抑制作用或杀死作用的物质。抗生素对敏感微生物的作用机理分为抑制细胞壁的形成、破坏细胞膜的功能、干扰蛋白质合成及阻碍核酸的合成。 由于不同微生物对不同抗生素的敏感性不一样，抗生素的作用对象就有一定的范围，这种作用范围成为抗生素的抗菌谱，作用对象广的抗生素称为广谱抗生素，作用对象少的抗生素称为窄谱抗生素。而且当某种抗生素长时间用于敏感微生物生长后，即使同一种菌的不同菌株对不同药物的敏感性也常发生改变，甚至出现耐药菌株，亦即产生抗性菌株，则抗生素将失去对抗性菌株生长的抵制，只以采用新的抗生素才可能控制抗性菌株的生长与繁殖，因而不断开发新的抗生素是保健人类身体健康的重要工作。新抗生素产生菌的分离筛选应通过拮抗菌发酵，然后以发酵产物进行抗菌活性实验，根据实验结果而获得产新抗生素的菌株。微生物代谢产物的抗菌活性常以管碟法与纸法进行检测，根据透明抑菌圈的有无与大小作为依据。 三实验器材 1、菌种枯草杆菌、大肠杆菌。 2、培养基MH（Mueller-Hintion）琼脂。 3、试剂青霉素、链霉素。 四方法步骤 1、无菌滤纸片以孔径6mm打孔器将滤纸打为圆形纸片，放入培养皿内，121℃蒸汽湿热灭菌，100℃烘干2h。 2、抗生素溶液制备将取适量青霉素、链霉素，以无菌水溶解。 3、指示菌悬浮液的制备枯草杆菌、大肠杆菌斜面菌种分别以无菌水洗下菌苔细胞，到入无菌三角瓶内，制备适宜浓度的细胞悬浮液。 4、混菌平板制备取批示菌细胞悬浮液1mL加入无菌培养皿内，再加入温度为43~45℃的PDA培养基或牛肉膏蛋白胨琼脂培养基20mL，立即振荡使细胞与培养基混合均匀，静置冷凝。 5、平板加抗生素溶液将滤纸片在抗生素溶液中充分浸泡2min以上，然后将纸片放于混菌平板上，每皿呈三角形放3点，每点贴放纸片2张。 6、培养与观察将平板放于33℃左右的温度培养，每24h测量一次透明抑菌圈直径，共测量3次。
常见细菌药物敏感性试验报告规范
常见细菌药物敏感性试验报告规范中国专家共识 微生物学检验为感染性疾病的诊断、治疗和控制提供了必不可少的证据。因此微生物学检验报告是临床和实验室等多方共同关注的焦点。国内临床微生物学检验发展较为薄弱，报告存在着种种不足。同时，临床与实验室的沟通存在一定不足，密切协作非常必要。基于实际存在的问题，为规范国内临床微生物学检验药物敏感性试验报告，加强临床与实验室合作，发挥检验医师作用，特制订本共识，以期指导相关报告的规范化，减少错误，增加专业信息，提高服务质量，为临床医学诊、治、控提供坚实的科学依据。本共识限于常见细菌的药物敏感性报告。 一、药物敏感性试验的意义和基本原则 (一)意义 药物敏感性试验可以检测细菌对于抗细菌药物的敏感性，为临床用药、新药研究、监测耐药变迁、发现耐药机制等提供客观证据[1]。对于经验治疗，依据一方面来自医生自身的经验，一方面是实验室长期不断提供的数据积累。临床需要考虑不同感染的病原谱和常见病原对不同药物的敏感性；对于靶向治疗，特定分离株的具体药敏试验结果可以用于判断经验治疗选药合理性、经验治疗效果分析、调整治疗选药依据等。 (二)基本原则 1．药敏试验检测获得性耐药，不必测试天然耐药： 天然耐药是细菌菌种固有的特征，耐药基因一般位于染色体，可以长期稳定遗传，表现为对某类或某种药物的天然耐药[2]。天然耐药信息一般由基础医学和临床文献提供。部分天然耐药，体外试验条件下可能无法检测出来，因而导致假敏感，如果报告将成为极重要错误，严重误导临床。常见菌种对各类药物的天然耐药见文献[3,4]。实验室全体人员应熟知这些信息，可将其发给临床学习和参考。 2．药敏试验测试的前提条件[5]： 实验室应具备相应检测的人员能力、客观条件、结果解释依据。标本处理、菌株分离鉴定、药敏试验操作等环节规范、标准、结果可信；具备对结果的解释能力，能够提供临床会诊服务。临床常规工作，分离株(可能)有临床意义而非定植或污染时，才可进行药敏试验。错误示例：来自痰标本的溶血葡萄球菌，未作标本质量评估和半定量培养，进行药敏试验；来自粪便标本肠球菌属进行药敏试验等。 3．测试结果应准确： 实验室应遵照C L S I文件或相关规范建立本医院药敏试验的质量管理体系。质控菌株、频率、质控范围符合相关要求；定期参加实验室室间比对项目。建议保留菌株，以便复核。 二、具体的专业要求 (一)标本类型 临床微生物学的一大特点是标本种类繁多，而不同药物在这些部位的分布不同。标本的规范采集、质量保证、立即运送和有效保藏有赖于临床、实验室以及相关各方的密切合作。
细菌耐药性检测方法
细菌耐药性检测方法 1、细菌耐药表型检测：判断细菌对抗菌药物的耐药性可根据NCCLS标准，通过测量纸片扩散法、肉汤稀释法和E试验的抑菌圈直径、MIC值和IC值获得。也可通过以下方法进行检测： （1）耐药筛选试验：以单一药物的单一浓度检测细菌的耐药性被称为耐药筛选试验，临床上常用于筛选耐甲氧西林葡萄球菌、万古霉素中介的葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌及氨基糖苷类高水平耐药的肠球菌等。 （2）折点敏感试验：仅用特定的抗菌药物浓度（敏感、中介或耐药折点MIC），而不使用测定MIC时所用的系列对倍稀释抗生素浓度测试细菌对抗菌药物的敏感性，称为折点敏感试验。 （3）双纸片协同试验：双纸片协同试验是主要用于筛选产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）革兰阴性杆菌的纸片琼脂扩散试验。若指示药敏纸片在朝向阿莫西林/克拉维酸方向有抑菌圈扩大现象（协同），说明测试菌产生超广谱β-内酰胺酶 （4）药敏试验的仪器化和自动化：全自动细菌鉴定及药敏分析仪如：Vitek-2、BD-Pheonix、Microscan等运用折点敏感试验的原理可半定量测定抗菌药物的MIC值。 2．β-内酰胺酶检测：主要有碘淀粉测定法（iodometric test）和头孢硝噻吩纸片法（nitrocefin test）。临床常用头孢硝噻吩纸片法，β-内酰胺酶试验可快速检测流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、卡他莫拉菌和肠球菌对青霉素的耐药性。如β-内酰胺酶阳性，表示上述细菌对青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药；表示葡萄球菌和肠球菌对青霉素（包括氨基、羧基和脲基青霉素）耐药。 3．耐药基因检测：临床可检测的耐药基因主要有：葡萄球菌与甲氧西林耐药有关的MecA 基因,大肠埃希菌与β-内酰胺类耐药有关的blaTEM、blaSHV、blaOXA基因，肠球菌与万古霉素耐药有关的vanA、vanB、vanC、vanD基因。检测抗菌药物耐药基因的方法主要有：PCR扩增、PCR-RFLP分析、PCR-SSCP 分析、PCR-线性探针分析、生物芯片技术、自动DNA 测序 4．特殊耐药菌检测 （1）耐甲氧西林葡萄球菌检测：对 1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤10㎜，或其MIC≥4цg/ml的金黄色葡萄球菌和对1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤17㎜，或MIC≥0.5цg/ml 的凝固酶阴性葡萄球菌被称为耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）。对MRS不论其体外药敏试验结果，所有的β-内酰胺类药物和β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂均显示临床无效；绝大多数的MRS 常为多重耐药，耐药范围包括氨基糖甙类、大环内酯类、四环素类等。 （2）耐青霉素肺炎链球菌检测：当对1цg苯唑西林纸片抑菌圈直径〈20㎜或MIC〉0.06цg/ml均应视为耐青霉素肺炎链球菌（PRSP）。临床治疗显示 PRSP对氨卞西林、氨卞西林/舒巴坦、头胞克肟、头胞唑肟，临床治疗疗效很差，但应检测对头胞曲松、头胞噻肟和美洛培南等的MIC以判断是否对这些抗生素敏感。 （3）耐万古霉素肠球菌检测：肠球菌对30цg万古霉素纸片抑菌圈直径≤14㎜或MIC≥32цg/ml被称为耐万古霉素肠球菌（VRE）。针对多重万古霉素药物目前尚无有效治疗方法，但对青霉素敏感的VRE可用青霉素和庆大霉素联合治疗，若对青霉素耐药而不是高水平耐氨基糖甙类可用壁霉素+庆大霉素。 （4）产超广谱β-内酰胺酶的肠杆菌科细菌检测：超广谱β-内酰胺酶是一种能水解青霉素、
细菌药敏试验
实训细菌的药物敏感性试验 教学目标 使学生掌握细菌药物敏感性试验的操作方法，能够利用本试验方法选择敏感药物治疗兽医临床常见的细菌性传染病。 材料准备 1．器材：温箱、天平、打孔机、滤纸、无菌试管及吸管、镊子、接种环、酒精灯等。 2．试剂：蒸馏水。 3．培养基：普通琼脂平板。 4．菌种：金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的固体培养物。 5．药品：链霉素、金霉素、新霉素、红霉素等抗菌药物。 6．硫酸钡标准管：取1%~1.5%氯化钡0.5ml加1%硫酸溶液99.5ml，充分混匀即成，用前充分振荡。 方法步骤 将抗菌药物置于接种待检菌的固体培养基上，抗菌药物通过向培养基内的扩散，抑制敏感细菌的生长，从而出现抑菌环。由于药物扩散的距离越远，达到该距离的药物浓度越低，由此可根据抑菌环的大小，判定细菌对药物的敏感度。 （一）含药纸片的制备 1．滤纸片最好选用新华1号定性滤纸，用打孔机打成直径6mm的滤纸片，放在小瓶中或平皿中，在121.3℃灭菌15min，再置100℃干燥箱内烘干备用。 2．药液的配制用无菌蒸馏水将各药稀释成以下浓度：磺胺100mg/ml、青霉素100IU/ml、链霉素、金霉素、新霉素、红霉素、多粘菌素1000μg/ml。 3．含药纸片的制备将灭菌的滤纸片用无菌的镊子摊布于灭菌平皿中，按每张滤纸片饱和吸水量为0.01ml计算，50张滤纸片加入药液0.5ml。要不时翻动，使纸片充分吸收药液，浸泡1~2h后于37℃温箱中烘干备用。对青霉素、金霉素纸片的干燥宜采用低温真空干燥法，干燥后立即放入瓶中加塞，放干燥器内或置-20℃冰箱中保存。纸片的有效期一般为4~6个月。 （二）测验方法 1．钩取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌落各4~5个，分别接种于肉汤培养基中，37℃培养4~6h。 2．用灭菌生理盐水稀释培养菌液，使其浊度相当于硫酸钡标准管。装有以上两种成分的试管须相同，硫酸钡应用前需充分振动。 3．用无菌棉拭子蘸取上述肉汤培养液，在试管壁上挤压除去多余的液体，在琼脂培养基表面均匀涂抹。每种细菌分别接种1~2个琼脂平板。
细菌的耐药性及检测
细菌的耐药性及检测：体外抗生素敏感试验方法 近年来，由于细菌耐药性不断增加，新的耐药机制和耐药菌株不断被发现，如MRSA、耐万古霉素肠球菌(VRE)、耐青霉素肺炎链球菌(PRP)以及β内酰胺酶中的超广谱β内酰胺酶(ESBLs)、去阻遏持续高产AmpC酶和金属β内酰胺酶等。临床抗生素的选择使用非常困难。因此必须开展体外抗生素敏感试验，了解细菌耐药谱，对抗菌药物的临床使用效果进行预测，对患者选择个体化的治疗方案；同时通过耐药检测及流行病学调查，为医院感染控制方案制订提供依据；也有助于新药的抗菌特性研究。临床细菌学实验室应选择合适的抗菌药物用于体外药敏试验，为临床抗感染治疗提供依据。 (一)药敏试验中抗菌药物的选择原则 抗菌药物药敏试验中测试药物种类的选择，应依据各医院院内感染控制委员会、临床医师、药剂人员及微生物学检验医师等相互协商按本单位的实际情况制订，但必须满足以下条件： 1.选用的抗菌药物应具备一组或一群代表性及预示性，如具有共同的耐药机制，或对某类菌株具有特定的意义等。 2.有助于指导临床抗感染治疗与流行病学的调查。 3.应充分考虑分离菌株的来源部位，如从脑脊液分离的菌株，应选用能通过血脑屏障的抗菌药物进行体外药敏试验等。 4.根据细菌种类或来源，通常选择6～16种不同抗菌药物。 (二)选择方案 在遵循上述原则基础上，可以参照美国CLSI推荐的各菌种抗菌药物的分组选择。结合本院实际情况制定选用方案。 1.肠杆菌科细菌抗菌药物药敏试验抗菌药物选择方案 (1)首选试验和报告的抗菌药物：氨苄西林、氨苄西林／舒巴坦或阿奠西林／克拉维酸或哌拉西林／他唑巴坦或替卡西林／克拉维酸中任一种；头孢唑林或头孢噻吩、头孢呋辛或头孢孟多、头孢西丁或头孢替坦、头孢噻肟或头孢他啶或头孢曲松或头孢哌酮中任选二种；头孢吡肟或头孢匹罗；庆大霉素；环丙沙星或左氧氟沙星或培氟沙星任选1～2种；亚胺培南，复方新诺明。 (2)次选试验和报告的抗菌药物：呋喃妥因、氯霉素、妥布霉素、卡那霉素、阿米卡星、氨曲南、奈替米星、四环素、诺氟沙星或氧氟沙星。 (3)从肠道标本中分离的沙门菌属与志贺菌属细菌常规只应试验和报告氨苄西林、复方新诺明及一种喹诺酮类抗菌药物；分离自肠道以外的沙门菌属菌株应试验和报告多种抗菌药物的药敏试验与报告，包括氯霉素和三代头孢菌素。 (4)分离自脑脊液的肠杆菌科细菌，只需报告氨苄西林、头孢噻吩、头孢唑啉、庆大霉素的药敏结果。 (5)采用合适的方法如双纸片法等检测ESBLs；对产ES-BLs细菌，不管实际药敏检测结果如何，所有青霉素类、头孢菌素类和氨曲南的试验结果报告耐药。 2.铜绿假单胞菌和不动杆菌属等药敏试验抗菌药物选择方案 (1)首选试验和报告的抗菌药物：替卡西林或哌拉西林或美洛西林中的一种，头孢他啶、头孢哌酮、头孢吡肟、氨曲南、亚胺培南或美洛培南；庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素；环丙沙星等。 (2)次选试验和报告的抗菌药物：羧苄西林、头孢噻肟或头孢曲松、奈替米星、氯霉素、四环素、左氧氟沙星或诺氟沙星或氧氟沙星、复方新诺明等。 (3)除铜绿假单胞菌和不动杆菌可用纸片扩散法进行药敏试验，对其他非发酵菌应使用稀释法进行药敏试验。
微生物实验报告
脓汁和粪便标本中病原菌的检测 专业：学号：姓名： 一、实验目的 探究检测其病原菌的类型并通过一系列的观察与鉴定从而确定其病原菌的名称和性质。在实践中学习培养基的制备、消毒和灭菌，细菌的分离与培养，细菌群体和个体形态特征的观察，细菌生化反应鉴定等技巧。从而掌握微生物实验的各种操作方法，培养对微生物实验的兴趣。 二、实验材料 器材 打火机、油性笔、酒精灯、接种环、接种针、污物盘、普通冰柜、隔水式电热恒温培养箱、奥林巴斯CX21型生物显微镜、电炉、试管（带棉塞）、称量纸、药勺、牛皮纸、硫酸纸、橡皮筋、尺子、锥形瓶、高压蒸汽灭菌器、镊子、玻片、吸水纸、拭镜纸 试剂药品 普通营养琼脂培养基、蒸馏水、脓汁标本、粪便标本、石蜡油、生理盐水、结晶紫、卢戈碘液、95%乙醇、稀释复红、葡萄糖微量发酵管（2支）、乳糖微量发酵管（2支）、青霉素抗菌素纸片、链霉素抗菌素纸片、庆大霉素抗菌素纸片、血浆、福氏志贺菌诊断血清 三、方法与步骤 1、培养基制备 干粉培养基→蒸馏水→加热溶化→分装→集中放在试管筐里→罩上硫酸纸、牛皮纸→用橡皮筋扎好→放入讲台边的灭菌桶或灭菌筐内→送到高压蒸汽灭菌室（洗刷室）→灭菌→（1）平板培养基：倾注平板10ml→琼脂完全凝固后，平板倒放→4℃冰箱保存备用。（2）斜面培养基：培养基趁热斜放→琼脂凝固以后，4℃冰箱保存备用。
→贴上标签后灭菌使用。 2、空气与人体体表细菌学检查 ①空气的细菌学检查 每组1个营养琼脂平板，选择采样地点（实验室、卫生间或任选地点）→将平板盖打开，盖朝下放置在平板旁边→平板暴露于空气中15min→平板倒扣盖上→作标记→37℃温箱培养24h→观察结果。 ②人体体表的细菌学检查 甲乙常规洗手，丙丁标准洗手。甲和乙、丙和丁共用1个平板 按规定在普通平板上接种手指上的细菌。第1格为洗手前，第2格为洗手后，第3格为消毒后，第4格空白对照。 3、细菌的分离培养 接种环烧灼灭菌→分别取脓汁标本与粪便标本点在普通平板和依红美蓝平板上，各做两份，→烧掉接种环上多余的标本→冷却后，应用分区划线分离法，将脓汁标本接种于营养琼脂平板（2份），粪便标本接种于伊红美蓝平板（2份）→接种环烧灼灭菌→将平板倒置37℃培养18～24h→观察结果。 4、细菌的群体生长特性观察和纯化培养 接种环烧灼灭菌→挑选平板上典型的四种单菌落（白色、黄色、紫黑色、粉红色）进行斜面接种纯培养→做好标记→接种环烧灼灭菌→斜面培养基置于37℃培养过夜→保存备用 5、细菌的个体形态特征的观察 ①革兰氏染色： 取洁净载玻片→用灭菌操作后的接种环取生理盐水1-2环于玻片上→挑取细菌培养物少许与盐水轻轻抹匀→待涂片干燥后在酒精灯火焰外侧快速来回2-3回合→结晶紫初染1min→水洗→卢戈碘液媒染1min→水洗→95％乙醇脱色约20s→水洗→稀释品红→复染1min→水洗→吸干,镜检。 ②肉汤接种法: 接种环烧灼灭菌→分别在斜面培养物中挑取菌苔少许→立即移入肉汤培养基管中→在接近液面的管壁上轻轻研磨→沾取少量肉汤调和→混匀→试管口通过火焰2-3次灭菌→塞好棉塞→35℃培养4~6h 6、药敏试验 接种环烧灼灭菌→分别取之前实验中得到的四种菌液在普通平板密集涂布→接种环烧灼灭菌→标记:青、链、庆→镊子火焰消毒→贴青霉素、链霉素、庆大霉素纸片→按压→镊子消毒→倒置37℃培养18～24h→观察结果
细菌耐药性及其临床意义
细菌耐药性及其临床意义 当前医院内外的新的耐药菌在不断出现，常导致治疗失败、并发症增多、感染复发、住院时间延长、昂贵抗生素及其它药物的使用增加等。耐药株还随着国际贸易及旅游业的高速发展而在全球蔓延。由于新抗生素的广泛使用，各个细菌对抗生素的耐药谱不断在发生变化，特别是耐药性经常以多重耐药为特点，有时甚至找不到可治之药。在细菌耐药性日趋严重的情况下，作为临床医生非常有必要知道一些有关耐药菌的当前状况和治疗时的注意点。 当前主要的耐药问题集中在以下6个方面。 一、耐苯唑西林的葡萄球菌(MRS) 耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)的特点是它们都具有一外来基因mecA，它负责编码青霉素结合蛋白(PBP2a)，PBP2a占优势时，由于β-内酰胺类对它的亲和力低，使得MRS对青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯、单环内酰胺类都耐药。而且对其它类抗生素也降低了敏感性，如氨基糖甙类、喹诺酮类、大环内酯类。 对于耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌，如果它们确切是该患者感染中的病原菌，医生应该相信理论和前人的经验：即MRS对所有头孢类和其它β-内酰胺类——如阿莫西林/克拉维酸、替卡西林/克拉维酸、哌拉西林/三唑巴坦、氨曲南和亚胺培南等临床治疗效果均不好，而不考虑这些药物的体外药敏试验结果报告是否敏感。这是因为已知的耐甲氧西林葡萄球菌感染的绝大多数病例对β-内酰胺类药治疗反应很差，而且尚缺乏令人信服的临床数据来证实这些药物的临床效力。 治疗MRS的有效抗生素不多，有万古霉素、链阳霉素、四环素类、SMZ/TMP、克林霉素，也可试用氟喹诺酮类和阿米卡星，但后两种美国食品与药物管理局(FDA)未推荐。严重感染应联合用药，利福平是可以联合应用的药物之一。 但必须记住医院内的葡萄球菌，不论是否为MRS株，95％以上都产青霉素酶(TEM型)。