(整理)基因操作原理

（这份材料根据老师给的PDF课件整理，仅供参考）

第一章

编码产生一种有生物学功能产物---蛋白质（多肽）或RNA所需信息的一段DNA称基因。Include:

1.编码蛋白质肽链或RNA所必需的核苷酸序列(open reading frame)

2.保证转录所必须的调控序列(S-D)

3. 5’-和3’-非翻译序列(leader and trailer)

4.内含子(intron)

Recombinant DNA（重组DNA）：是将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。

这项技术可概括为∶分、切、连、转、选。

两个最基本的特点是分子水平上的操作和细胞水平上的表达。

基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。

Genetic Engineering（基因工程）重组DNA技术与基因工程的基本用途分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源大规模生产生物活性物质设计、构建生物的新性状甚至新物种大规模生产生物活性物质工程细胞。

Development of gene engineering：

第一代基因工程蛋白多肽基因的高效表达经典基因工程

第二代基因工程蛋白编码基因的定向诱变蛋白质工程

第三代基因工程代谢信息途径的修饰重构途径工程

第四代基因工程基因组或染色体的转移基因组工程

第二章

目的基因的获得（DNA的准备）

1.从基因组直接获得

2.RT-PCR 方法获得

3.人工合成法

DNA抽提的基本原理

?1 获得细胞，裂解细胞

三种破壁、膜的方法比较：非离子型去污剂法较温和．适用于抽提10kb左右的质粒；而煮沸法与碱性SDS法相对较剧烈．只能抽提小于10kb的质粒，当然在熟练方法的前提下，碱性SDS法也能抽提较大的质粒。非离子型去污剂的变性能力较弱，常用的TritonX—100等，常用的离子型去污别是SDS。在选择去污剂类型对应根据变性剧烈程度的要求而定。

2 分离（质粒DNA与染色体DNA的分离）

3 纯化（去除RNA）

?RNA与DNA相比在化学及生化性质上有差别，因此可选用RNA酶处理．以保留DNA分子而专门分解RNA。

3 纯化（去除蛋白）

?常用的去除蛋白质的试剂有酚、酚／氯仿、氯仿／异戊醇。

PCR的基本原理：变性、复性、半保留复制

PCR三步曲：1. DNA热变性90～97℃ 2. 引物退火45～55℃ 3. 引物延伸72℃左右

How many copies?

1.到第3个循环才有目的片断（指用长DNA作为模板）.

2.早期并不严格按2倍增长

3.30 循环时约有1,073,741,764 个目的产物(~1×109).

4. 有约60 不是目的长度的片断.

5.大于35 个循环时不能明显增加产物量

进入平台期的原因:1.反应试剂用完2.产物之间相互退火3. Taq酶活性降低

优化PCR反应：

1.引物的退火温度.

2.Mg2+ 的浓度.

3. 延伸时间.

4.模板和Taq的量

能否扩增RNA?

? Not directly — the DNA polymerase requires a DNA template and will not copy RNA. ? mRNA can first be copied into cDNA using reverse transcriptase.

? cDNA is a template for PCR — it need not be double-stranded.

TA 克隆：

1.Taq扩增PCR产物物末端加个A；

2.可以与末端为T的载体直接连接

引物设计要求：引物长度在20个碱基左右；.引物G/C 含量约 45–55%；2条引物退火温度差别不要超过1°C；引物内部最好没有反相互补序列；2条引物之间不能有互补序列；引物内部不能有重复序列。

PCR存在的问题：

1 . 可信度（ F i d e l i t y ）： P C R 反应过程中的错配现象，给PCR克隆、变异导入带来麻烦。

2.扩增的DNA长度：一般扩增1～2 kbp以下的DNA片段。

3.扩增的DNA量：对有些检测、克隆时，DNA量往往达不到要求。

4. PCR扩增困难：当DNA富含GC或具有复杂二级结构时，PCR很难扩增。

5.PCR反应速度：当急于得到实验结果时，PCR反应速度较慢。

2-3 分子杂交

1 Southern Blotting

2 Northern Blotting

3 Western Blotting

（一）Southern Blot 基因组DNA与DNA探针的杂交

功能：

1 研究某一基因在基因组中的拷贝数

2 研究异源物种是否有类似基因（ZooBlooting）

?原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。

用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。Southern Blot Southern Blot 操作步骤：

DNA →琼脂糖电泳→印迹转移→预杂交→

杂交（变性探针）→洗膜→放射自显影或显色

二、Northern Blooting RNA与DNA探针的杂交

功能：1 分析mRNA的分子量大小 2 分析mRNA表达量

3 分析mRNA表达的组织分布

4 分析mRNA的发育表达化

5 研究mRNA的不同剪切方式

Northern blot的步骤：

?1 RNA电泳（包括制备变性胶和RNA样品的处理）

?2 转膜（把RNA从胶上转移到膜上）

?3 杂交（用标记同位素的DNA探针与膜进行杂交）

杂交前一般要进行预杂交，消除非特异性杂交

?4 洗膜、曝光、冲片

三、Western Blot 蛋白与蛋白的杂交，如蛋白与抗体的杂交

功能：1 分析蛋白的分子量大小 2 分析蛋白表达量

3 分析蛋白表达的组织分布

4 分析蛋白的发育表达变化

5 研究蛋白前体的后加工方式

WesternBlot原理：将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素或PVDF膜上，然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应，洗涤去除没有结合的特异性抗体后，加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体，加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现，也可通过条带的密度大小来进行特异性蛋白的半定量。

ELISA原理：ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。测定方法具有很高的敏感度（pg-ng/ml 水平），并且重复性好。

类型：（1）间接法测抗体(2) 双抗体夹心法测抗原

(3)竞争法测抗原

cDNA法克隆目的基因的基本策略

双链cDNA的克隆

双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：

1.平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收

2.平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，分子可这样重组通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段

3.加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收

cDNA法克隆目的基因的局限性：

1.并非所有的mRNA分子都具有polyA结构

2.细菌或原核生物的mRNA半衰期很短

3.m RNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难

4.仅限于克隆蛋白质编码基因

第3章基因工程酶的操作

限制性核酸内切酶简称限制性内切酶，是一类能识别双链DNA中特定核苷酸序列并具有专一切割位点的脱氧核糖核酸水解酶。

限制酶的命名从其来源微生物的拉丁名中摘取，即由其属名的第一个字母(大写)与种名的第一、二两个字母(小写)组成酶的基本命名，若酶的产生菌由株系之分，则有4个或4个以上拉丁字母组成，其第四个字母之后表示株系。如EcoRI来源于Echerichia.coli RY13 BamHI来源于B.amyloliquefaciens

已发现的限制酶可以分为三类或称作三型：I、II、III型。他们在酶反应中所需要的辅因子和切割DNA的位点都不相同，而且酶蛋白分子的大小和组成上也有差别。

II型限制酶的识别序列大多是具有双重对称结构性结构,或称回文序列(Palindromic Sequence)

大部分II型限制性内切酶的识别序列长度为4-8个核苷酸。识别长度决定了剪切DNA的频率（1/4n，n为识别的长度）。识别长度愈长，则切点少、产生片段少而长度长，酶特异性高。

限制酶的切割特异性和酶切片段的末端结构

切割位点专一

作为工具酶的限制性内切酶有固定的切割位点；

产物具有特定的末端结构

当一个DNA分子被限制酶切开后形成两个末端，全部产物具有相同的末端结构。即一种限制性内切酶切割任何DNA只产生一种固定形式的末端结构，在DNA连接酶的作用下，磷酸二酯键可以修复而成为一个重组的DNA分子；而不同限制酶则形成不同末端结构。

任何一种限制酶切割DNA链时，总是水解核苷酸3’、5’-磷酸双酯键的3’位磷酸酯键，使产物的5’端带磷酸单酯基团，而3’为游离羟基。

由于切割位点不同，所有的限制酶可产生两类末端结构

①平末端（Blunt End）指酶切片段为齐头末端结构。

②粘性末端（Cohesive End）酶切后DNA片段末端带有1-4个核苷酸残基长度的单链结构，而片段两端突出的单链具有互补的序列。

粘性末端又可分为5‘-粘性末端与3’-粘性末

同裂酶：有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，其差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内

切酶可以切割，另一种则不能。例如HpaⅡ和MspⅠ的识别顺序都是5’……CCGG……3’，如果其中有5’-甲基胞嘧啶，则只有HpaⅡ能够切割。这些有相同切点的酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。

酶反应条件

按手册或商品说明书

反应缓冲液：根据不同酶使用高、中或低盐缓冲液。常用的缓冲液选择Tris-Hcl 。同时还要加入Mgcl2 和2-巯基乙醇。

反应温度：一般限制性内切酶的反应温度是37○c。

酶活性单位： 1个酶活性单位是指一种酶在其最适宜的反应条件下，1小时使1μg λ噬菌体DNA底物完全水解的酶量。但由于许多因素可影响内切酶的水解反应和用量，实际用量需比所需用量多加一倍左右。

在次理想条件下,一些限制性内切酶的特异型会被降低,只有部分正常识别位置被识别,此称为第二活性。

限制酶在一些特定条件下使用时，对于底物DNA的特异性可能降低。即可以把与原来识别的特定的DNA序列不同的碱基序列切断，这个现象叫Star活性。

Star活性出现的频率，根据酶、底物DNA、反应条件的不同而不同，几乎所有的限制酶都具有Star活性。并且，它们除了识别序列的

范围增大之外，还发现了在DNA的一条链上加入切口的单链切口活性，所以为了极力抑制Star 活性，一般情况下，即使会降低反应性能，我们也提倡在低甘油浓度、中性pH、高盐浓度条件下进行反应。

每个限制性内切酶都有对应的甲基化酶(methylase)，由于一些特定位点被甲基化酶甲基化,使得限制性内切酶无法切割DNA链（甲基化敏感）。

基因工程（genetic engineering），也叫基因操作、遗传工程，或重组体DNA技术。它是根据人们预先设想，采用酶学的方法，将目的基因（所需要的基因）重组到一个适宜的载体上组成重组子，再将重组子转化到适当受体细胞中进行扩增表达，以达到改造生物细胞的目的的技术。

设计限制性核酸内切酶反应

? 根据待酶切DNA的量确定酶量和反应体积。

? 根据酶的活性程度确定基本缓冲体系。

? 限制性核酸内切酶对盐度敏感，控制盐度。

? 反应时尽可能做到无菌。

? 考虑限制性核酸内切酶的第二活性(星号活性)(Star Activity)。

相同粘性末端连接

如果外源DNA 和载体DNA 均用相同的限制性内切酶切割，则两种DNA分子均含有相同的末端，因此混合后它们能顺利连接为一个重组DNA 分子。

用两种同尾酶分别切割外源DNA片段和载体DNA，由

于产生的粘性未端相同，因此也可方便地连接。

酶切位点的定点更换

在有些分子克隆实验中，需要将DNA上的一种限制性内切酶识别序列转化成另一种酶的识别序列，以便DNA分子的重组. 有两种方法可以达到这个目的。

1．加装人工接头。接头是一段含有某种限制性内切酶识别序列的人工合成的寡聚核苷酸，通常是八聚体和十聚体。

2．改造识别序列。这种方法的原理是利用一种限制性内切酶的识别序列改造另一种酶的识别序列，从而使前者迁移到后者的位置上。

1、一次使用两个限制性内切酶的一般步骤是什么（比如双酶切）？

其步骤如同使用一个限制性内切酶的一般步骤。但要注意两个限制性内切酶在同一种缓冲液中都要有活力，即：使用通用缓冲液。

谷氨酸钾缓冲液适用所有的酶切。

2、能否在一次反应中用很多的限制性内切酶？

可以，一般而言，甘油浓度超过8%对酶切有抑制。有些酶在高的甘油浓度中会产生星号活力。限制性内切酶提供在50%的甘油中，故10 ul反应体积中不应加入超过1.6 ul的酶。限制酶酶切图谱(Restriction Mapping)是不同的限制性内切酶相对位置的物理图谱。

应用一系列限制性内切酶把待分析的双链DNA切割成大小不同的片段。由凝胶电泳(Gel Electrophoresis)分离限制片段并测量大小。通过分析比较就可以推断出在DNA分子上限制酶切的位置。

限制性片段长度多态性

在DNA顺序中，如果某个碱基发生了突变，使突变所在部分的DNA序列产生(或缺失)某种限制性内切酶的位点。当利用该限制性内切酶消化此DNA时，会产生与正常不同的限制性片段。这样，在同种生物的不同个体中会出现不同长度的限制性片段类型，即限制性片段多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP ）。

第4章载体

用于基因克隆的载体

质粒（plasmid）噬菌体或病毒DNA

考斯质粒（cosmid）与噬菌粒人造染色体载体

载体的功能

1.运送外源基因高效转入受体细胞

2.为外源基因提供复制能力或整合能力

3.为外源基因的扩增或表达提供必要的条件

载体应具备的条件

1.具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）

2.具有合适的筛选标记

3.具有较高的外源DNA的载装能力

4.具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点

5.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点

载体的种类

按来源分：质粒载体(plasmid vector)、噬菌体载体(phage vector)、柯氏质粒载体(cosmid vector)、病毒载体(virus vector ).

按作用分：克隆载体(cloning vector )、表达载体(expression vector)、穿梭载体(shuttle vector)

质粒

质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。

质粒常见于原核细菌和真菌中绝大多数的质粒是DNA型的

绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA。质粒DNA的分子量范围：1 - 300 kb

质粒的基本特征

1.质粒的自主复制性

质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制

质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系

根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒1 - 3 拷贝stringent plasmid

松弛型复制控制的质粒10 - 60 拷贝stringent plasmid

2.质粒的不相容性

任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。

3.质粒的不相容性：分子机制

两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势4.质粒的可转移性

革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：

接合型质粒能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用）。

非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作用。

5.携带特殊的遗传标记

野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成抗生素、细菌毒素、有机碱。这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义

质粒的分类

人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：

高拷贝质粒突变拷贝数控制基因拷贝数1000-3000 扩增基因

低拷贝质粒来自pSC101 拷贝数小于10 表达某些毒性基因

温敏质粒在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质

测序质粒含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker

整合质粒装有整合促进基因及位点便于外源基因的整合

穿梭质粒装有针对两种不同受体的复制子便于基因克隆

表达质粒装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件

探针质粒装有报告基因便于启动子等元件的克隆筛选

质粒DNA的分离纯化

实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA：

1.氯化铯密度梯度离心法

质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染

2.碱溶法

质粒DNA纯度底、快速、操作简便

3.沸水浴法

质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间

λ噬菌体作为克隆载体有两个优点：

1) 转染效率高:可在体外包装，产生有感染性的噬菌体颗粒，每个颗粒都可能感染一个大肠杆菌.

2)筛选程序简便:一定长度的噬菌体才能包装.

柯氏质粒或称粘尾质粒(cosmid)是指含有入噬菌体粘性末端的杂种质粒。由λDNA cos区与质粒重组建造而成.在宿主细胞中可以作为正常噬菌体进行复制，但不表达噬菌体的任何功

能。

cosmid的构造特点:

(1)含有抗药标志和复制起始部位。

(2)一个或多个单一酶的限制位点

(3)带有入噬菌体粘性末端。

(4)分子小，约4—6kb，可容纳大至40-50kb的外源DNA片段。适用于构建真核细胞的基因文库特。

另外，由于非重组体cosmid很小，不能在体外包装,因此非重组体的本底很低，利于重组克隆的筛选。

常用的动物病毒表达载体可分为两大类：

整合型（integrated）载体．即外源基因通过这种病毒载体与宿主细胞的染色体整合，外源基因随宿主细胞基因组的复制而扩增。这类载体的代表是SV40－PSV系列和逆转录病毒－逆转录病毒表达载体pLPGHL、pMSV 等。

游离型(transient)或称病毒颗粒型载体，这类载体携带外源基因后，本质上仍然是一种完整或缺损的病毒，能够以病毒颗的形式在宿主内自行复制或在辅助病毒存在下进行复制。这类载体有痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒。

克隆载体(cloning vector)：用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。

一般具有较低的分子量、较高的拷贝数和松弛型复制子。主要由细菌质粒或与其它质粒、噬菌体及真核生物病毒的DNA重组构建。

表达载体(expression vector)：使目的基因在宿主细胞中得以表达的载体。可将重组体DNA导入适合的受体细胞，使所载荷的目的基因能够复制、转录和翻译。

λ噬菌体生物学特性：感染周期

吸附LamB受体、注入复制、包装、裂解。

λ噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。

λ-DNA作为载体的优点：

1.λ-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌

2.λ-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量

3.重组λ-DNA分子的筛选较为方便

4.重组λ-DNA分子的提取较为简便

5.λ-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因

考斯质粒载体的特点：

能像λ-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞

装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围

能像质粒那样在受体细胞中自主复制

重组操作简便，筛选容易

不能体内包装，不裂解受体细胞

噬菌粒载体的特点：

噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体

能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞

装载量比常规的M13mp系列要大很多（10 kb）

能像质粒那样在受体细胞中自主复制

重组操作简便，筛选容易

通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA

人造染色体载体

将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳

定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外

源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，

它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。

目前常用的人造染色体载体包括：

细菌人造染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BAC）

酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YAC）

蓝白班筛选：lacZ基因编码β-半乳糖苷酶，能催化无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基因插入到lacZ基因中，基因失活，不能合成β-半乳糖苷酶催化底物生成蓝色化合物；而空载体则能合成β-半乳糖苷酶使底物产生蓝色透明斑。所以含重组载体的菌体周围形成白斑，含空载体的菌落周围形成蓝斑。（这个自己写的，仅供参考）

第5章基因的克隆及筛选

感受态细胞的制备

转化细菌的方式有许多种，如电转化法、CaC12处理

法制备感受态细胞等。一般的实验室都应用CaC12处理细

菌，改变细胞膜的结构，使质粒DNA能够穿过细菌细胞

膜进入细胞。然后在选择性培养基中培养转化处理过的细

菌，转化成功的细菌可在抗性培养基上生长形成菌落。

第6章DNA序列测定

DNA 序列测定方法

1. Sanger 双脱氧链终止法

2. Maxam-Gilbert 化学修饰法

Sanger双脱氧终止法(chain-terminator method)原理：

在模板指导下，聚合酶不断将dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延长，合成出新的互补的DNA链，如果加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP）,由于双脱氧核糖的3’位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同5’-引物端和以ddNMP 残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA，从而读取DNA的核苷酸序列。

双脱氧终止法测序反应体系包括：

DNA聚合酶、单链DNA模板、带有3-OH末端的单链寡核苷酸引物、Mg2+、

4种dNTP(aATP,dGTP,dCTP和dTTP)、4种ddNTP(ddATP,ddGTP,ddCTP和ddTTP)

测序反应的种类：①引物标记法(Dye primer reactions)

②终止物标记法(Dye terminator reactions)

Maxam-Gilbert化学修饰法(chemical cleavage method)原理：

一个末端标记的DNA片段在4组互相独立的化学反应中分别得到部分降解，其中每一组反应特异的针对某一种或某一类碱基。因此生成4种放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点。每组混合物中均含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA全片段上位置。此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检测末端标记的分子。

二、基本步骤

第一步，对特定碱基（或特定类型的碱基）进行化学修饰；

第二步，修饰碱基从糖环上脱落，修饰碱基5和3的磷酸二酯键断裂；

第三步，比较G、A+G、C+T、C和A>C各个泳道，可从测序凝胶的放射自显影片上读取DNA序列。Maxam-Gilbert 化学修饰法特点：

重现性好，所用试剂简单，易于掌握；

所测长度比Sanger法短一些，对放射性标记末端250个核苷酸以内的DNA序列效果较好；

序列来自原DNA分子而不是酶促合成反应所生成的拷贝；

可对合成的寡核苷酸进行测序，用以分析诸如甲基化等DNA修饰的情况，通过化学保护及修饰干扰实验来研究DNA的二级结构及蛋白质-DNA相互作用。

无需延伸反应及克隆

更适于含有稀有碱基或GC含量高及短链寡核苷酸的测序，可双向标记并测序。

比较繁琐费时，过长序列有困难。

第7章

基因在原核细胞中的表达（大肠杆菌中）

大肠杆菌表达外源基因的优势：

1.全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架

2.基因克隆表达系统成熟完善

3.繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定

4.被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物

5.大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征

大肠杆菌表达外源基因的劣势：

1.缺乏对真核生物蛋白质的复性功能

2.缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统

3.内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白

4.细胞周质内含有种类繁多的内毒素

mRNA翻译的起始效率主要由其5‘ 端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）。生物体对密码子的偏爱性

不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码

子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是：生物基因组中的碱基含量在富含AT的生物（如单链DNA噬菌体φX174）基因组中，密码子第三位上的U和A出现的频率较高；而在GC丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有G或C的简并密码子占90%以上的绝对优势。

密码子偏爱性对外源基因表达的影响

由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程大的差异性，因此外源

基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。一般而言，有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：外源基因全合成

同步表达相关tRNA编码基因

质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响

目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降解决上述难题的一种有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控制的轨道

包涵体及其性质

在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它

们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不

溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。

包涵体表达形式的优点：

1.包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来

2.能在一定程度上保持表达产物的结构稳定

3.在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异源重组

4.蛋白的稳定性已构不成威胁

包涵体表达形式的缺点：

以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通

过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具

有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产

物的收率至关重要。然而，这也是一个技术难题，尤其当目标蛋白

分子中的Cys残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，

一般不超过30%。

基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性，这种不稳定性具有下列两种表现形式：

1.结构不稳定性

重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表观生物学功能的丧失

2.分配不稳定性

整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸（curing）

工程菌遗传不稳定性的产生机制：

1.受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞

2.外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢产生应激反应：关闭合成途径，启动降解程序

3.重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配，这是重组质粒逃逸的基本原因

4.受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排

改善基因工程菌不稳定性的策略

1.改进载体受体系统

2.施加选择压力

3.控制目的基因的过量表达

4.优化基因工程菌的培养工艺

第八章酵母表达系统

酵母菌表达外源基因的优势：

1.全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便

2.具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统

3.大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉

4.能将外源基因表达产物分泌至培养基中

5.不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS）

6.酵母菌是最简单的真核模式生物

酵母质粒载体既可以在大肠杆菌复制与扩增、又可以在酵母系统中复制与扩增，故此类载体又称为穿梭载体（shuttle vector）。

酵母质粒载体 1.以大肠杆菌质粒为基本骨架 2.具有酵母的DNA复制起始区、选择标记、有丝分裂稳定区和外源DNA插入位点。

四种酵母质粒载体a: 整合质粒(YIp)；b: 复制质粒(YRp)；

c: 附加体质粒(YEp)；d: 稳定质粒(YCp)

整合载体YIp（yeast integrating plasmid）是通过质粒DNA与酵母基因组DNA之间发生同源重组而整合到基因组DNA上的，故遗传稳定性好但转化效率低。

第九章植物克隆载体（老师貌似说不考这一章吧，暂时没整理）

第十章基因在真核细胞中的表达

正常的哺乳类动物细胞具有下列四大生物学特征：

锚地依赖性：细胞必须附在固体上或固定的表面才能生长分裂

血清依赖性：细胞必须具有生长因子才能生长

接触抑制性：细胞与细胞接触后，生长便受到抑制

形态依赖性：细胞称扁平状，并有长纤维网状结构

上述特征使得正常的哺乳动物细胞在体外培养中，一般只能存活50代且在培养皿上以平面的形式生长，即单层细胞生长。有时，正常细胞会改变某些特征而越过生理临界点，继续增殖并无限制分裂，这种状态称为细胞系形成，此时的细胞成为细胞系。

以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞应具备下列条件：

1.细胞系特征丧失细胞接触抑制性和锚地依赖性特征，便于大规模培养

2.遗传稳定性外源基因多次传代后不至于丢失，易于长期保存

3.合适的标记便于转化株的筛选和维持

4.生长快且齐分裂周期短，生长均一，便于控制

5.安全性能好不合成分泌致病物质，不致癌

大多数正常的高等哺乳动物细胞并不能同时具备上述条件，癌细胞能满足上述前四项要求，但在安全性能上有欠缺。

常用的高等哺乳动物受体细胞

中国仓鼠卵巢细胞（CHO），其优势有如下几个方面：

1.遗传背景清楚，生理代谢稳定

2.与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确

3.基因转移和载体表达系统完善

4.耐受剪切力，便于大规模培养

5.被美国FDA确认为安全的基因工程受体细胞（GRAS）

高等哺乳动物的基因转移

1.哺乳动物细胞的物理转化法

1.1磷酸钙共沉淀法

1.2电击转化法

1.3脂质体介导法将待转化的DNA溶解与天然或人工合成的磷脂混合，后者在表面活性剂的存在下形成包埋水相DNA的脂质体结构。

1.4显微注射法

1.5血影细胞介导法

2.哺乳动物细胞的病毒转染法

外源基因表达产物的分离纯化

重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则：

1.针对不同的产物表达形式采取不同的策略

2.针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型

3.多种分离纯化技术的联合运用

4.合适分离纯化介质的选择

5.分离纯化过程的规模化

分离方法：离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析、膜分离

原核生物表达的重组蛋白质量检测：

1.重组蛋白的鉴别（序列）

2.重组蛋白的纯度（杂质的类型）

3.重组蛋白的活性（检测方法）

4.重组蛋白的安全性

5.重组蛋白的稳定性

6.重组蛋白的一致性（构象与构型）