食用菌菌种选育的一般方法

食用菌菌种选育的一般方法

导言

3-1自然选育

定义：

自然突变的结果：

自然选育的特点：简单易行，可以纯化菌种，防止菌种退化，稳定产量。但自然选育的效率低，应该经常跟诱变选育交替使用，提高育种效率。

自然选育的一般程序：

3-2诱变选育

导言

3-2-1诱变育种的原理

诱变育种的理论基础是基因突变，突变包括染色体畸变和基因突变两大类。

染色体畸变指的是，染色体或DNA片段发生缺失、易位、逆位、重复等。

基因突变指的是，DNA中的碱基发生变化，即点突变。

过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌种的育种方法。

常用的诱变剂包括物理、化学、生物的三大类。表3-1所示。

3-2-2诱变育种的基本方式

导言

3-2-2-1出发菌株的选择

进行诱变的出发菌株的性能，对提高诱变效果和效率十分重要。

选择出发诱变菌株的注意事项：

诱变育种的程序：

3-2-2-2诱变剂的使用方法

|------单一诱变剂处理：对野生菌株处理有效。

诱变方法|

|------复合诱变剂处理：对经过多次诱变处理的老菌株。

复合诱变剂处理|----同一诱变剂多次处理

|----两种以上诱变剂先后分别处理

|----两种以上诱变剂同时或多次处理

举例：青霉菌的选育。

3-2-2-3诱变剂的剂量选择

诱变剂的剂量与致死率有关，而致死率又与诱变率有关。

因此，可用致死率作为诱变剂剂量的选择依据。

关系：诱变率随诱变剂剂量的增加而提高，但达到一定程度后，反而下降。

近年来处理剂量控制在致死率70-80%。

高剂量诱变的好处：A形成较纯的菌株。(引起一些细胞核变异，同时引起另外一些细胞核被破坏，细胞死亡。)

B促使变异菌株稳定，不易产生回复突变。（高剂量会引起细胞遗传物质发生难以恢复的巨大损伤。）

3-2-3突变菌株的筛选

3-2-3-1营养缺陷型突变菌株的筛选

营养缺陷型突变菌株的诱变育种具有重要的理论研究和工业应用价值。

已经广泛应用在氨基酸、核苷酸生产中。

在营养缺陷型突变菌株中，生物合成途径中的某一步发生了酶缺陷，合成反应不能完成，末端产物不能积累，因此末端产物的反馈调节作用被解除。只要在培养中限量加入所要求的末端产物，克服生长障碍，就能使中间产物积累。

营养缺陷型突变菌株具有明显的遗传标记，在杂交育种中作为出发菌株，有利于杂交重组的分析，也可以作为基因工程中的受菌体，检出克隆基因的表达。

3-2-3-2抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变菌株的筛选

抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变菌株这2种突变，都是由于代谢失调。

它们的共同表现：细胞中已经有了大量末端产物时，仍然不断合成这一产物。

代谢失调原理不同：

抗反馈阻遏突变菌株：调节基因或操纵基因发生突变，使产生的阻遏蛋白不再能和终产物结合或结合后不能作用于已突变的操纵基因，因此不再起反馈阻遏作用。

抗反馈抑制突变菌株：由于编码酶的结构基因发生突变，使变构酶不再具有结合终产物的能力，但仍具有活性，从而解除了反馈抑制。

通过使用抗结构类似物的方法筛选。

（1）与末端产物有相似的结构，能与阻遏蛋白或变构酶结合，阻止产物的合成，引起反馈调节；（2）但它们不能代替末端产物参与生物合成，它们的浓度不会降低。（3）它们与阻遏蛋白或变构酶的结合是不可逆的。

（1）未突变细胞：抗结构类似物与阻遏蛋白或变构酶结合，引起反馈调节，阻止某种产物的合成。生长受阻，死亡。（2）发生突变细胞：抗结构类似物与阻遏蛋白或变构酶不能结合，因此不能引起反馈调节，无法阻止产物的合成。因此生长不受影响。

3-2-3-3组成型突变株的筛选

在酶制剂的发酵过程中，常采用在发酵过程中分批限量加入诱导物的方法，提高诱导酶的活性。

为了解除对诱导物的依赖，通过诱变改变菌种的遗传特性，筛选组成型突变株。

突变发生位置：突变发生在调节基因或操纵基因，都可获得组成型突变菌株。

优势，或能适当分辨两类菌落的方法，选出组成型突变菌株。

例如，可以在培养基中加入抑制诱导酶合成的物质，使组成型菌株处于选择优势。

3-2-3-4抗性突变株的筛选

包括对抗生素、金属离子、温度、噬菌体等的抗性（或敏感）突变株的筛选，这些突变型常用来提高某些代谢产物的产量。

A,抗生素抗性突变：

抗生素之所以能治疗疾病，就是因为抗生素有抑制微生物代谢的机制。而各种抗生素抑制微生物代谢的机理各不相同，不同的机制改变微生物代谢，可以使某些产物过量积累。

在抗生素产生菌的选育中，筛选抗生素抗性突变株，可明显地提高抗生素产量。

例解烃棒杆菌产生棒杆菌素，棒杆菌素是氯霉素的类似物，抗氯霉素的解烃棒杆菌突变株比亲株产生的棒杆菌素高出3倍。

B,抗噬菌体株的选育：

噬菌体的感染给工业生产带来的危害是巨大的。

细菌对噬菌体的抗性是基因突变的结果，所以，可以采用自然选育和诱发突变选育两种方法。

自发突变是以噬菌体为筛子，在不经任何诱变的敏感菌株中筛选抗性菌株，但抗性突变的频率低。

诱变处理之后，再用高浓度的噬菌体平板筛选抗性菌株，可以提高抗性突变的频率。

C,条件抗性突变：

又称条件致死突变，其中温度敏感突变通常可以提高产物产量。

因为温度敏感型突变，使代谢过程中某一酶的蛋白结构发生改变，在高温情况下失去活力，可能变成营养缺陷型，在特定的培养基中积累产物。

D,敏感突变：

在柠檬酸生产中，采用敏感突变，造成某些酶结构基因的改变，从而抑制顺乌头酸酶的活性，达到提高柠檬酸的产量。

导言：我们上面向大家介绍的自然选育和诱变选育，是工业微生物菌种选育的常用方法，主要是为了达到提高微生物生产产量的目的。

然而，采用合适的筛选方法，诱变育种可以获得高产菌株，但不能达到定向育种的目的。

而且，长期使用诱变剂处理，会使菌种生活能力逐渐下降，比如生长周期延长、代谢减慢等等。因此，有必要进行杂交育种，来提高菌种的生产性能。

3-3杂交育种

定义：一般指两个不同基因型的菌株通过接合或原生质体融合，使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性状的菌株。

杂交育种适用的微生物：真菌、放线菌、细菌都可以进行杂交育种。

A. 杂交育种具有定向育种的性质。(选用已知性状的供体菌株和受体菌株作为亲本，把不同菌株的优良性状集中于组合体中。)

B. 杂交后的杂种可以克服原有菌种生活力衰退的趋势。

C. 使杂种菌种对诱变剂更加敏感。（因为遗传物质的重组，动摇了菌种遗传基础。）

D. 可以消除某一菌种经长期诱变处理所产生的产量上升缓慢的现象。

E. 可以改变产品质量和产量。

导言：杂交育种主要有常规的杂交育种和原生质体融合这两种方法，近年来，后一种方法较为多见。一些同学手中的教材把原生质体融合技术从杂交育种章节单列出来，作为一个独立的节，不等于它不属于杂交育种范畴。

3-3-1常规的杂交育种

常规的杂交育种不需用脱壁酶处理，就能使细胞结合而发生遗传物质的重新组合。

导言：由于课时的原因，我们不能按照参考教材上那样分别对细菌、放线菌、霉菌的杂交育种分别介绍。从遗传学角度，这几类微生物之间的杂交育种原理有着相似性，所以，我们仅以霉菌中的青霉菌的杂交育种过程，来说明杂交的主要过程。至于涉及到的遗传学相关内容，请同学们课余时间复习微生物遗传学。

青霉菌的杂交过程，实际上是青霉菌的准性生殖过程。

重组。

3-3-1-1遗传标记

杂交育种所用的亲本菌株通常要有一定的遗传标记以便于筛选。

可以作为青霉菌株亲本的遗传标记有许多种，如营养缺陷型、抗药突变型等。其中以营养缺陷型作为遗传标记最为常见。今天给大家介绍的杂交方法就是以营养缺陷型作为遗传标记的。

通常是将两个用来杂交的野生型菌株，经过诱变得到两株不同的营养缺陷型，作为杂交的直接亲本菌株。

3-3-1-2异核体形成

异核体（异核现象）：当两个不同形状的细胞或菌丝，也可以是孢子管与菌丝之间相互连接时，导致在一个细胞或菌丝中存在两个或两个以上不同遗传型的核，这样的细菌或菌丝体称为异核体。这种现象叫异核现象。

。

A亲本孢子(营养缺陷型) + B亲本孢子(营养缺陷型)

液体完全培养基

培养1-2天

挑出生长的菌丝体

用液体基本培养基或生理盐水离心洗涤3次

将菌丝取出、撕碎

基础培养基平板

培养7天

菌丝（异核体）

异核体是两个直接亲本菌株经过细胞间的接合而形成的，也就是在一条菌丝里含有两个遗传特性不同的细胞核，共同生活在均一的细胞质里，能够互补营养，因此能在基础培养基上生长。

合细胞核是双倍体。

杂合二倍体是杂交育种的关键。

因为杂合二倍体本身不仅具备了杂种的特性，而且随着其染色体或基因的重组和分离，还能形成更多类型的杂种（重组体分离子），这就为杂交育种提供了丰富的材料。

异核体自发形成杂合二倍体的频率很低，必须人为提高形成杂合二倍体的频率。

常用的方法有：提高异核体的培养温度，用紫外线照射异核体，用樟脑蒸汽熏异核体菌丝等。

3-3-1-4染色体交换和单倍体

杂合二倍体一般是稳定的，但也有极少数杂合二倍体的细胞核在无性繁殖的细胞分裂过程中，偶然发生染色体交换和单倍化，产生很多类似的二倍或单倍分离子。

有诱变剂处理，则分离子的类型会更多。

分离子从表型上可以分为亲本型分离子和重组型分离子。

重组型分离子在二倍体菌落中表现为角变和扇形斑点。

青霉菌杂交的目的就是为了获得重组型分离子。

导言：对微生物来说，有性重组的局限性很大。这是因为至今为止发现有杂交现象的微生物并不多，这就妨碍了基因重组在微生物育种中的应用。

原生质体融合技术，打破了种属间的界限，提供了充分利用遗传重组杂交的方法。

或电场作用下，是它们互相凝聚，发生细胞融合，实现遗传重组。

A. 两亲株没有受体和供体之分，有利于不同种属微生物杂交。

B. 重组频率高于其他杂交方法。

C. 遗产物质的传递更加充分、完善，既有核配又有质配。

D. 可以先采用温度、药物、紫外线等处理纯化亲株的一方或双方，然后再融合，筛选再生重组子菌落，提高筛选效率。

E. 用微生物的原生质体进行诱变，可明显提高诱变频率。

导言：原生质体融合，一般包括标记菌株的筛选、原生质体的制备、原生质体的融合、融合子的选择、实用性菌体的筛选等，我们下面分别向大家介绍各个过程。

3-3-2-1标记菌株的筛选

供融合用的两个亲株，要求性能稳定并带有遗传标记，以利于融合子的选择。

采用的遗传标记一般以营养缺陷型和抗药性等遗传性状为标记。

通过采用多种抗生素及其他药物，以梯度平板法进行粗选，再用具有抗性的抗性生物制备不同浓度的平板，进行较细的筛选。

3-3-2-2原生质体的制备

获得有活力、去壁较完全的原生质体对于随后的原生质体融合和原生质体再生是非常重要的。

对于细菌和放线菌，制备原生质体主采用溶菌酶；

A. 菌体的预处理：

在使用脱壁酶处理菌体前以前，先用某些化合物对菌体进行预处理，有利于原生质体制备。

例如，用EDTA（乙二胺四乙酸）处理细菌，可使菌体的细胞壁对酶的敏感性增加。

B. 菌体的培养时间：

为了使菌体细胞易于原生质体化，一般选择对数生长后期的菌体进行酶处理。

这时的细胞正在生长代谢旺盛期，细胞壁对酶解作用最为敏感。可以提高原生质体形成率和再生率。

C. 酶浓度：

酶浓度增加，原生质体的形成率也增大，超过一定范围，则原生质体形成率提高不大。

酶浓度过低，不利于原生质体形成；酶浓度过高，则导致原生质体再生率降低。

建议：以使原生质体形成率和再生率的乘积达到最大时的酶浓度，为最适酶浓度。

D. 酶解温度：

温度对酶解作用有双重影响，一方面随着温度升高，酶解反应速度加快；另一方面，随着温度升高，酶蛋白变性而使酶失活。

一般酶解温度控制在20-40度。

E. 酶解时间：

充分的酶解时间是保证原生质体化的必要条件。

但是，如果酶解时间过长，则再生率随酶解的时间延长而显著降低。

原因：当酶解达到一定时间，绝大多数菌体均呈原生质体，因此，再继续进行酶解作用，酶便会进一步对原生质体发生作用而使细胞膜受到损失，造成原质体失活。

F. 渗透压稳定剂：

原生质体对溶液和培养剂的渗透压很敏感，必须在高渗透压或等渗透压的溶液和培养剂中才能维持其生存。在低渗透压溶液中，原生质体会破裂死亡。

不同菌种要求渗透压稳定剂是不同的。

细菌和放线菌：蔗糖、丁二酸钠等；

酵母菌：山梨醇、甘露醇等；

霉菌：KCl、NaCl等。

渗透压稳定剂的使用浓度：一般为0.3-0.8mol/L

3-3-2-3原生质体的融合与再生

融合是把两个亲株的原生质体混合在一起，在融合剂PEG（聚乙二醇）和Ca2+作用下发生原生质体的融合。

无性繁殖。

A.菌体的前处理；

B.菌体的培养时间；

C.融合剂浓度；

D.融合剂作用时间；

A.阳离子浓度；

B.融合的温度；

A. 菌种自身的再生性能；

B. 原生质体制备的条件；

C. 再生培养基成分；

（1）将用酶处理前的菌体经无菌水系列稀释，涂布于完全培养基平板上培养，计出原菌数，设该数值为A。（2）将用酶处理后得到原生质体分别经如下过程处理。

（2-1）用无菌水适当稀释，在完全培养基平板上培养计数，由于原生质体在低渗透压条件下会破裂失活，所以生长出来的菌落数为未形成原生质体的原菌数，设该值为B。

（2-2）用高渗透压适当稀释，在再生培养基平板上培养计数，生长出来的菌落数是原生质体再生的菌数与未形成原生质体的原菌数之和。设该值为C。

那么，计算方式如下：

A-B

原生质体形成率=————*100%

A

C-B

原生质体再生率=————*100%