微生物计数检查法USP61中英对照版
非无菌产品微生物学检查：微生物计数检查法
USP61中英对照版
<61> MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS: MICROBIAL ENUMENRATION TESTS
非无菌产品微生物学检查：微生物计数检查法
INTRODUCTION 导言
The tests described hereafter will allow quantitative enumeration of mesophilic bacteria and fungi that may grow under aerobic conditions.
以下所描述的这些检测将使得对在有氧的条件下生长的嗜温性细菌和真菌进行定量计数成为可能。
The tests are designed primarily to determine whether a substance or preparation complies with an established specification for microbiological quality. When used for such purposes, follow the instructions given below, including the number of samples to be taken, and interpret the results as stated below.
这些检测主要设计用于测定一种物质或制备品是否符合已确立的微生物质量标准。当用于此类目的时，需遵照以下所给的说明，包括待取样品的数量，并且按照下面所述解释结果。
The methods are not applicable to products containing viable microorganisms as active ingredients.
这些方法不适用于以活菌作为活性成分的产品。
Alternative microbiological procedures, including automated methods, may be used, provided that their equivalence to the Pharmacopeial method has been demonstrated. 可以使用替代的微生物规程，包括自动化方法，只要已经证明它们与药典方法具同等作用。
GENERAL PROCEDURES 通用规程
Carry out the determination under conditions designed to avoid 12 microbial contamination of the product to be examined. The precautions taken to avoid contamination must be such that they do not affect any microorganisms that are to be revealed in the test.
在经过设计可避免外来微生物污染供试产品的条件下，进行此项测定。用于避免污染的这些预防措施是必须做到，它们不会影响任何试图在此项检验中揭示的微生物。
If the product to be examined has antimicrobial activity, this is, insofar as possible, removed or neutralized. If inactivators are used for this purpose, their efficacy and their absence of toxicity for microorganisms must be demonstrated. 如果供试产品具有抗菌活性，则此活性需在尽可能的范围内去除或中和。如果将灭活剂用于这个目的，则必须证实它们的功效和对微生物不具毒性。
If surface-active substances are used for sample preparation, their absence of toxicity for microorganisms and their compatibility with any inactivators used must be demonstrated.
如果表面活性物质用于样品制备，则必须证实它们对微生物不具毒性以及与所使用的任何灭活剂的兼容性。
ENUMERATION METHODS计数法
Use the Membrane Filtration methodor one of the Plate-Count Methods, as directed. The Most-Probable-Number (MPN) Method is generally the least accurate method for microbial counts; however, for certain product groups with very low bioburden, it may be the most appropriate method.
按规定，使用膜过滤法或多个平板计数法中的一种。液体稀释法（MPN）通常对微生物计数而言是最不准确的方法；然而，对具备非常低生物载荷的特定产品类型，它可能是最合适的方法。
The choice of a method is based on factors such as the nature of the product and the required limit of microorganisms. The method chosen must allow testing of a sufficient sample size to judge compliance with the specification. The suitability of the chosen method must be established.
方法的选择基于某些因素，例如产品的性质和微生物的要求限度。所选的方法必须能够对充足的样本量进行检测，以判断与质量标准的符合性。所选方法的适用性必须被建立。
Table 1. Preparation and Use of Test Microorganisms
表1. 供试微生物的制备和使用
Growth Promotion
生长促进
Suitability of Counting Method in the Presence of Product
在产品存在的情况下计数方法的适用性
Microorganism
微生物
Preparation of Test Strain
供试菌株的制备
Total Aerobic Microbial Count
总好氧微生物计数
Total Yeasts and Molds Count 总酵母菌和霉菌计数
Total Aerobic Microbial Count
总好氧微生物计数
Total Yeasts and Molds Count总酵母菌和霉菌计数
Staphylococcus aureus such as ATCC 6538, NCIMB 9518, CIP 4.83, or NBRC 13276
金黄色葡萄球菌如：ATCC 6538, NCIMB 9518, CIP 4.83, 或 NBRC 13276
Soybean-Casein Digest Agar or Soybean-Casein Digest Broth 300-350 18-24 hours 大豆酪蛋白消化物琼脂培养基或大豆酪蛋白消化物肉汤培养基300-350 18-24 小时
Soybean-Casein Digest Agar and Soybean-Casein Digest Broth≤100 cfu 300-350≤3 days 大豆酪蛋白消化物培养基和大豆酪蛋白消化物肉汤培养基≤100 cfu 300-350 ≤3 天
Soybean-Casein Digest Agar/MPN Soybean-Casein Digest Broth≤100 cfu 300-350≤3 days 大豆酪蛋白消化物培养基/MPN（最大几率数）大豆酪蛋白消化物肉汤培养基≤100 cfu
300-350 ≤3 天
Pseudomonas aeruginosa such as ATCC 9027, NCIMB 8626,CIP 82.118, or NBRC 13275 绿脓杆菌如ATCC 9027, NCIMB 8626,CIP 82.118, 或 NBRC 13275
Soybean-Casein Digest Agar or Soybean-Casein Digest Broth 300-350 18-24 hours 大豆酪蛋白消化物琼脂培养基或大豆酪蛋白消化物肉汤培养基300-350 18-24 小时
Soybean-Casein Digest Agar and Soybean-Casein Digest Broth≤100 cfu 300-350≤3 days 大豆酪蛋白消化物琼脂培养基和大豆酪蛋白消化物肉汤培养基≤100 cfu 300-350≤3 天
Soybean-Casein Digest Agar/MPN Soybean-Casein Digest Broth≤100 cfu 300-350≤3 days 大豆酪蛋白消化物琼脂培养基/MPN（最大几率数）大豆酪蛋白消化物肉汤培养基≤100 cfu 300-350≤3 天
Bacillus subtilis such as ATCC 6633, NCIMB 8054, CIP 52.62, or NBRC 3134
枯草芽孢杆菌如ATCC 6633, NCIMB 8054, CIP 52.62, 或 NBRC 3134
Soybean-Casein Digest Agar or Soybean-Casein Digest Broth 300-350 18-24 hours 大豆酪蛋白消化物琼脂培养基或大豆酪蛋白消化物肉汤培养基300-350 18-24 小时
Soybean-Casein Digest Agar and Soybean-Casein Digest Broth≤100 cfu 300-350≤3 days 大豆酪蛋白消化物琼脂培养基和大豆酪蛋白消化物肉汤培养基≤100 cfu 300-350≤3 天
Soybean-Casein Digest Agar/MPN Soybean-Casein Digest Broth≤100 cfu 300-350≤3 days 大豆酪蛋白消化物琼脂培养基/MPN（最大几率数）大豆酪蛋白消化物肉汤培养基≤100 cfu 300-350≤3 天
Candida albicans such as ATCC 10231, NCPF 3179, IP 48.72, or NBRC 1594
白色念珠菌如ATCC 10231, NCPF 3179, IP 48.72, 或 NBRC 1594
Sabouraud Dextrose Agar or Sabouraud Dextrose Broth 200-250 2-3 days
Sabouraud（沙氏）葡萄糖琼脂培养基或Sabouraud（沙氏）葡萄糖肉汤培养基
Soybean-Casein Digest Agar ≤100 cfu 300-350≤5 days大豆酪蛋白消化物琼脂培养基≤100 cfu 300-350≤5 天
Sabouraud Dextrose Agar ≤100 cfu 200-250≤5 days
Sabouraud（沙氏）葡萄糖琼脂培养基≤100 cfu 200-250≤5 天
Soybean-Casein Digest Agar≤100 cfu 300-350≤5 days MPN: not applicable
大豆酪蛋白消化物琼脂培养基≤100 cfu 300-350≤5 天 MPN(最大几率数)：不适用
Sabouraud Dextrose Agar≤100 cfu 200-250≤5 days
Sabouraud（沙氏）葡萄糖琼脂培养基≤100 cfu 200-250≤5 天
Aspergillus niger such as ATCC 16404, IMI 149007, IP 1431.83, or NBRC 9455
黑曲霉如ATCC 16404, IMI 149007, IP 1431.83, 或NBRC 9455
Sabouraud Dextrose Agar or Potato-Dextrose Agar 200-250 5-7 days, or until good sporulation is achieved
Sabouraud（沙氏）葡萄糖琼脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基 200-250 5-7天,或直到实现良好的产孢
Soybean-Casein Digest Agar≤100 cfu 300-350≤5 days
大豆酪蛋白消化物琼脂培养基≤100 cfu 300-350≤5 天
Sabouraud Dextrose Agar ≤100 cfu 200-250≤5 days
Sabouraud（沙氏）葡萄糖琼脂培养基≤100 cfu 200-250≤5 天
Soybean-Casein Digest Agar≤100 cfu 300-350≤5 days MPN: not applicable
大豆酪蛋白消化物琼脂培养基≤100 cfu 300-350≤5 天MPN(最大几率数)：不适用
Sabouraud Dextrose Agar≤100 cfu 200-250≤5 days
Sabouraud（沙氏）葡萄糖琼脂培养基≤100 cfu 200-250≤5 天
GROWTH PROMOTION TEST AND SUITABILITY OF THE COUNTING METHOD 生长促进试验和计数方法的适用性
General Considerations通用考虑因素
The ability of the test to detect microorganisms in the presence of product to be tested must be established.
在供试产品存在的情况下，必须确立检测微生物的试验能力。
Suitability must be confirmed if a change in testing performance or a change in the product that may affect the outcome of the test, is introduced.
如果引入了可能影响试验结果的在测试性能或产品方面的变更，则必须确认其适用性。
Preparation of Test Strains
供试菌株的制备
Use standardized stable suspensions of test strains or prepare as stated below. Seed-lot culture maintenance techniques (seed-lot systems) are used so that the viable microorganisms used for inoculation are not more than 5 passages removed from the original master seed-lot. Grow each of bacterial and fungal test strains separately as described in Table 1.
使用供试菌株的标准化稳定悬浮液或按下面所述制备。使用菌种保藏技术（种子批系统），以便用于接种的可萌发微生物从最初的主种子批开始传代不超过5次。按照在表1 中的描述，分别培养每个细菌和霉菌供试菌株。
Use Buffered Sodium Chloride-Peptone Solution pH 7.0 or Phosphate Buffer Solution pH 7.2 to make test suspensions; to suspend A. niger spores, 0.05% of polysorbate 80 may be added to the buffer. Use the suspensions within 2 hours, or within 24 hours if stored between 2o and 8o. As an alternative to preparing and then diluting a fresh suspension of vegetative cells of A. niger or B. subtilis,a stable spore suspension is prepared and then an appropriate volume of the spore suspension is used for test inoculation. The stable spore suspension may be maintained at 2o to 8o for a validated period of time.
使用pH 7.0的缓冲氯化钠-蛋白胨溶液，或pH7.2的磷酸盐缓冲液制作供试悬浮液；为使黑曲霉孢子悬浮，可以将0.05%的聚山梨醇酯80加入该缓冲液中。这些悬浮液需在2个小时之内使用，或如果存放在2o至8o的条件下，则可在24小时之内使用。作为制备然后稀释黑曲霉或枯草杆菌的新鲜体细胞悬浮液的替代方法，可制备稳定的孢子悬浮液，然后将适量的孢子悬浮液用于试验接种。此稳定的孢子悬浮液可以在2o至8o之间于一段经过验证的时间内保存。
Negative Control 阴性对照
To verify testing conditions, a negative control is performed using the chosen diluent in place of the test preparation. There must be no growth of microorganisms. 为了确认试验的条件，在制备供试品的场所使用所选的稀释液替代供试品，作阴性对照。其必须没有微生物的增长。
Growth Promotion of the Media
培养基的生长促进
Test each batch of ready-prepared medium and each batch of medium prepared either from dehydrated medium or from the ingredients described.
对每一批已经制备好的培养基和每一批从脱水培养基或根据描述的组分制备出来的培养基，进行测试。
Inoculate portions/plates of Soybean-Casein Digest Broth and Soybean-Casein Digest Agar with a small number (not more than 100 cfu) of the microorganisms indicated in Table 1, using a separate portion/plate of medium for each. Inoculate plates of Sabouraud Dextrose Agar with a small number (not more than 100 cfu) of the microorganisms indicated in Table 1, using a separate plate of medium for each. Incubate according to the conditions described in Table 1.
在部分/整个平皿内的大豆酪蛋白消化物肉汤培养基和大豆酪蛋白消化物琼脂培养基中接种少量(不超过100cfu) 表1中指定的微生物，每种微生物均使用单独的部分/整个平皿的培养基。在平皿内的Sabouraud（沙氏）葡萄粮琼脂培养基中接种少量(不超过100cfu)表1
中指定的微生物，每种均使用一个单独平皿的培养基。按照表１中描述的条件进行培养。
For solid media, growth obtained must not differ by a factor greater than 2 from the calculated value for a standardized inoculum. For a freshly prepared inoculum, growth of the microorganisms comparable to that previously obtained with a previously tested and approved batch of medium occurs. Liquid media are suitable if clearly visible growth of the microorganisms comparable to that previously obtained with a previously tested and approved batch of medium occurs.
对于固体培养基，所获得的生长与标准化接种体的计算值之间的差异因素决不能大于2。对于刚刚制备好的接种体，发生的微生物生长与用此前检验并批准过的培养基批次所得到的微生物生长相当。如果出现了与此前从上一个经过测试并批准的培养基批次获得的微生物生长相当的、清晰可见的、微生物生长，则液体培养基适用。
Suitability of the Counting Method in the Presence of Product
在存在产品的情况下计数法的适用性
PREPARATION OF THE SAMPLE样品的制备
The method for sample preparation depends on the physical characteristics of the product to be tested. If none of the procedures described below can be demonstrated to be satisfactory, a suitable alternative procedure must be developed.
样品制备方法取决于供试品的物理特征。如果以下描述的规程不能够被令人满意地证实，则必须开发一个适用的替代规程。
Water-Soluble Products—Dissolve or dilute (usually a 1 in 10 dilution is prepared ) the product to be examined in Buffered Sodium Chloride-Peptone Solution pH 7.0, Phosphate Buffer Solution pH 7.2, or Soybean-Casein Digest Broth. If necessary, adjust to a pH of 6 to 8. Further dilutions, where necessary, are prepared with the same diluent.
水溶性产品——溶解或稀释（通常制备1:10的稀释液）供试品，于pH值为7.0的缓冲氯化钠-蛋白胨溶液中，pH值为7.2的磷酸盐缓冲液，或大豆酪蛋白消化物肉汤培养基。如有必要，将pH值调整为6至8。在需要时，用相同的稀释剂进一步地稀释。
Nonfatty Products Insoluble in Water—Suspend the product to be examined (usually
a 1 in 10 dilution is prepared) in Buffered Sodium Chloride—Peptone Solution pH
7.0, Phosphate Buffer Solution pH 7.2, or Soybean—Casein Digest Broth. A surface —active agent such as 1 g per L of polysorbate 80 may be added to assist the suspension of poorly wettable substances. If necessary, adjust to a pH of 6 to 8. Further dilutions, where necessary, are prepared with the same diluent.
不溶于水的非脂肪性供试品——将检测的供试品（通常制备1:10的稀释液）悬浮于pH值为7.0的缓冲氯化钠-蛋白胨溶液，pH值为7.2的磷酸盐缓冲液，或者大豆酪蛋白消化物肉汤培养基中。可以加入某个表面活性剂，比如1克每升的聚山梨酯80，以帮助难以与水混合的物质悬浮。如有必要，调整pH值为6至8。在需要时，用相同的稀释剂进一步的稀释。
Fatty Products—Dissolve in isopropyl myristate sterilized by filtration, or mix the product to be examined with the minimum necessary quantity of sterile polysorbate 80 or another noninhibitory sterile surface-active reagent heated, if necessary, to not more than 40o or, in exceptional cases, to not more than 45o. Mix carefully and if necessary maintain the temperature in a water bath. Add a sufficient quantity of the prewarmed chosen diluent to make a 1 in 10 dilution of the original product. Mix carefully, while maintaining the temperature for the shortest time necessary for the formation of an emulsion. Further serial 10-fold dilutions may be prepared using the chosen diluent containing a suitable concentration of sterile polysorbate 80 or another noninhibitory sterile surface-active reagent.
脂肪性供试品——溶解于以过滤除菌的豆蔻酸异丙酯，或者将供试品与所需最少量的、经过加热的无菌聚山梨酯80或另一种非抑菌性的无菌表面活性剂进行混合，如有必要，可加热至不超过40o或者，在特殊情况下，至不超过45o。仔细混匀，如有必要，在水浴锅里中维持该温度。加入充足数量、经过预热的所选择稀释剂，制成原产品的1:10稀释液。仔细混匀，同时维持该温度至形成乳化剂所必需的最短的时间。可以用所选择的含有适当浓度的无菌聚山梨酯80或者另一种非抑菌性的无菌表面活性剂的稀释液，来制备后续的系列10倍稀
释液。
Fluids or Solids in Aerosol Form—Aseptically transfer the product into a membrane filter apparatus or a sterile container for further sampling. Use either the total contents or a defined number of metered doses from each of the containers tested. 气溶胶与液溶胶——以无菌操作将供试品转移至一个过滤膜设备或一个无菌容器里，以进一步取样。从每个被检测的容器中，使用全部内容物或剂量的规定倍数。
Transdermal Patches—Remove the protective cover sheets (“release liners”) of the transdermal patches and place them, adhesive side upwards, on sterile glass or plastic trays. Cover the adhesive surface with a suitable sterile porous material (e.g., sterile gauze) to prevent the patches from sticking together, and transfer the patches to a suitable volume of the chosen diluent containing inactivators such as polysorbate 80 and/or lecithin. Shake the preparation vigorously for at least 30 minutes.
贴剂——去除贴剂的防护面（“释放衬板”）并将它们放置在无菌玻璃或塑料托盘上，胶贴剂的一面向上。用适当的无菌多孔材料（例如：无菌纱布）盖住胶贴面，以防止贴剂粘在一起，并将贴剂转移到所选的含有灭活剂（例如聚山梨醇酯80和/或卵磷脂）的适量稀释剂中。用力摇动供试品至少30分钟。
INOCULATION AND DILUTION接种和稀释
Add to the sample prepared as directed above and to a control (with no test material included) a sufficient volume of the microbial suspension to obtain an inoculum of not more than 100 cfu. The volume of the suspension of the inoculum should not exceed 1% of the volume of diluted product.
向按上述规定制备的样品中以及向对照制备品（其中无供试物质）中，加入充足体积的微生物悬浮液，以获得一个不多于100 cfu的接种体。接种的菌体悬浮液体积应当不超过被稀释产品体积的1%。
To demonstrate acceptable microbial recovery from the product, the lowest possible dilution factor of the prepared sample must be used for the test. Where this is not possible due to antimicrobial activity or poor solubility, further appropriate protocols must be developed. If inhibition of growth by the sample cannot otherwise be avoided, the aliquot of the microbial suspension may be added after neutralization, dilution, or filtration.
为证明供试品有可接受的微生物回收率，必须使用已制备样品的最低可能稀释倍数来进行检
测。当由于抗菌活性或低溶解度而无法做到这一点时，必须进一步开发更适合的规程。如果样品对生长的抑制不能以其他方式避免，可以在中和、稀释、或过滤之后，加入等量的微生物悬浮液。
NEUTRALIZATION/REMOVAL OF ANTIMICROBIAL ACTIVITY
抗菌活性的中和/去除
The number of microorganisms recovered from the prepared sample diluted as described in Inoculation and Dilution and incubated following the procedure described in Recovery of Microorganisms in the Presence of Product, is compared to the number of microorganisms recovered from the control preparation.
用制备好的样品按接种和稀释项下的描述稀释，并按在产品存在的情况下微生物的回收率项下描述的规程培养，将从中回收的微生物的数量与从对照制备品中回收的微生物的数量进行比较。
If growth is inhibited (reduction by a factor greater than 2), then modify the procedure for the particular enumeration test to ensure the validity of the results. Modification of the procedure may include, for example,
如果生长被抑制（以大于2的因素减少），那么修改特定的计数测试规程，以确保结果的有效性。规程的修改可以包括，例如：
(1) An increase in the volume of the diluent or culture medium稀释剂或培养基体积的增加;
(2) Incorporation of a specific or general neutralizing agents into the diluent将某个特定或通用的中和剂整合至稀释剂中;
(3) Membrane filtration膜过滤; or或
(4) A combination of the above measures上述方法的组合.
Neutralizing Agents—Neutralizing agents may be used to neutralize the activity of antimicrobial agents (see Table 2). They may be added to the chosen diluent or the medium preferably before sterilization. If used, their efficacy and their absence of toxicity for microorganisms must be demonstrated by carrying out a blank with neutralizer and without product.
中和剂——中和剂可以用于中和抗菌剂（见表2）的活性。最好在灭菌之前，将它们加入到所选的稀释剂中或培养基中。如果使用，则必须通过进行一个带中和剂而不含产品的空白试验，来论证它们的功效和无毒性。
If no suitable neutralizing method can be found, it can be assumed that the failure to isolate the inoculated organism is attributable to the microbicidal activity of the product. This information serves to indicate that the article is not likely to be contaminated with the given species of the microorganism. However, it is possible that the product inhibits only some of the microorganisms specified herein, but does not inhibit others not included among the test strains or those for which the latter are not representative. Then, perform the test with the highest dilution factor compatible with microbial growth and the specific acceptance criterion.
如果没有找到合适的中和方法，则可以假定未能分离所接种有机体的原因是供试品杀灭微生物活性。这个信息帮助指出此物品不太可能被特定微生物种群所污染。然而，有可能供试品只抑制这里所列出微生物中的某些，而并不抑制未包括在供试菌株之中其他微生物或者后者对其不具代表性的那些微生物。然后，用与微生物生长和具体接受标准相适应的最高稀释倍数进行试验。
RECOVERY OF MICROORGANISMS IN THE PRESENCE OF PRODUCT
在产品存在的情况下微生物的回收
For each of the microorganisms listed, separate tests are performed. Only microorganisms of the added test strain are counted.
对所列出的每个微生物，做单独的检测。只计算所加入的供试菌株的微生物。
Membrane Filtration—Use membrane filters having a nominal pore size not greater than 0.45 μm. The type of filt er material is chosen in such a way that the bacteria-retaining efficiency is not affected by the components of the sample to be investigated. For each of the microorganisms listed, one membrane filter is used. 膜过滤——使用一个标称孔径不超过0.45 μm的膜过滤器。过滤器的材料按以下标准选择，即待检测样品的组成部分不会对细菌保留效率产生影响。对于所列出的每个微生物，单独使用一个膜过滤器。
Transfer a suitable quantity of the sample prepared as described under Preparation of the Sample, Inoculation and Dilution, and Neutralization/Removal of Antimicrobial Activity (preferably representing 1 g of the product, or less if large numbers of cfu are expected) to the membrane filter, filter immediately, and rinse the membrane filter with an appropriate volume of diluent.
将按照样品的制备、接种和稀释、和抗菌活性的中和/去除项下描述所制备的适当数量的样品（最好相当于1克产品，在cfu数量预计较大时，也可少于此数量）转移至膜过滤器，立即过滤，并用适量的稀释剂冲洗膜过滤器。
For the determination of total aerobic microbial count (TAMC), transfer the membrane filter to the surface of the Soybean-Casein Digest Agar. For the determination of total combined yeasts and molds count (TYMC), transfer the membrane to the surface of the Sabouraud Dextrose Agar. Incubate the plates as indicated in Table 1. Perform the counting.
对于总好氧微生物计数的测定（TAMC），将滤膜转移至大豆酪蛋白消化物琼脂培养基的表面。对于总酵母菌和霉菌联合计数（TYMC）的测定，将膜转移至Sabouraud（沙氏）葡萄糖琼脂培养基的表面。按表1中规定的条件培养这些平皿。进行计数。
Plate-Count Methods—Perform plate-count methods at least in duplicate for each medium, and use the mean count of the result.
平板计数法——每种培养基至少进行两次平板计数法，并使用计数结果的平均值。
Pour-Plate Method—For Petri dishes 9 cm in diameter, add to the dish 1 mL of the sample prepared as described under Preparation of the Sample, Inoculation and Dilution, and Neutralization/Removal of Antimicrobial Activity and 15 to 20 mL of Soybean-Casein Digest Agar or Sabouraud Dextrose Agar, both media maintained at not more than 45o. If larger Petri dishes are used, the amount of agar medium is increased accordingly. For each of the microorganisms listed in Table 1, at least two Petri dishes are used.
倾注培养法——对于直径为9cm的平皿，将按照样品的制备、接种和稀释、抗菌活性的中和/去除项下的描述所制备的样品1 mL以及15至20 mL大豆酪蛋白消化物琼脂培养基或者Sabouraud（沙氏）葡萄粮琼脂培养基加入至平皿，此两种培养基的温度均维持在不超过45o。如果使用较大的平皿，琼脂培养基的量也需相应地增加。对于表1中所列出的每一个微生物，至少要使用两个平皿。
Incubate the plates as indicated in Table 1. Take the arithmetic mean of the counts per medium, and calculate the number of cfu in the original inoculum.
按表1中的指示培养这些平皿。取每培养基计数的算术平均值，计算在最初的接种体中的菌落数（cfu）数量。
Surface-Spread Method—For Petri dishes 9 cm in diameter, add 15 to 20 mL of Soybean-Casein Digest Agar or Sabouraud Dextrose Agar at about 45o to each Petri dish, and allow to solidify. If larger Peti dishes are used, the volume of the agar is increased accordingly. Dry the plates, for example, in a laminar-airflow cabinet or in an incubator. For each of the microorganisms listed in Table 1, at least two
Petri dishes are used. Spread a measured volume of not less than 0.1 mL of the sample, prepared as directed under Preparation of the Sample, Inoculation and Dilution, and Neutralization/Removal of Antimicrobial Activity over the surface of the medium. Incubate and count as directed for Pour-Plate Method.
表面铺展法——对于直径为9cm的平皿，倾入15至20 mL、温度大约为45o的大豆酪蛋白消化物琼脂培养基或Sabouraud（沙氏）葡萄粮琼脂培养基至每个平皿中，静置凝固。如果使用较大的平皿，琼脂的数量也需相应地增加。干燥平皿，例如，在层流柜或恒温箱里。对于表1中列出的每个微生物，至少使用两个平皿。将已称量好的体积不少于0.1 mL、按照样品的制备、接种和稀释、和抗菌活性的中和/去除项下的规定所制备的样品，铺展在培养基的表面。按照倾注培养法项下的规定培养和计数。
Most-Probable-Number (MPN) Method—The precision and accuracy of the MPN Method is less than that of the Membrane Filtration method or the Plate-Count Method. Unreliable results are obtained particularly for the enumeration of molds. For these reasons, the MPN Method is reserved for the enumeration of TAMC in situations where no other method is available. If the use of the method is justified, proceed as follows.
最大几率数（MPN）法——MPN法的精密度和准确度低于膜过滤法或平板计数法。所获得的霉菌计数的结果尤其不可靠。由于这些原因， MPN法被保留用于当没有其它可行方法情况下的总好氧微生物计数。如果有证据支持此方法的使用，则按如下进行。
Table 2. Common Neutralizing Agents/Methods for Interfering Substances 表2.对干扰物质的常用中和试剂/方法
Interfering Substance
干扰物质
Potential Neutralizing Agents/Method
潜在中和试剂/方法
Glutaraldehyde, mercurials
戊二醛，汞制剂
Sodium hydrogen sulfite (Sodium bisulfite)亚硫酸氢钠
Phenolics, alcohol, aldehydes, sorbate酚类物质，酒精，醛类，山梨酸
Dilution 稀释剂
Aldehydes醛类
Glycine 甘氨酸
Quaternary ammonium compounds (QACs), parahydroxybenzoates (parabens), bisbiguanides
季铵盐化合物（QACs），对羟苯甲酸（防腐剂），
Lecithin 卵磷脂
QACs, iodine, parabens
QACs，碘，防腐剂
Polysorbate 聚山梨醇酯
Mercurials 汞制剂
Thioglycollate 硫胶质
Mercurials, halogens, aldehydes
汞制剂，卤素，醛类
Thiosulfate硫代硫酸盐
EDTA (edetate)
EDTA乙二胺四乙酸盐
Mg or Ca ions
镁或钙离子
Table 3. Most-Probable-Number Values of Microorganisms
表3 微生物的最大几率数的值
Observed Combinations of Numbers of Tubes Showing Growth in Each Set
每套显示生长的试管所观察到的数量组合
MPN per g or per mL of Product
每克或每毫升产品的最大几率数
95% Confidence Limits
95%置信限度
Number of g or mL of Product per Tube
每管中的产品克或毫升数
Prepare a series of at least three serial 10-fold dilutions of the product as described for Preparation of the Sample, Inoculation and Dilution, and Neutralization/Removal of Antimicrobial Activity. From each level of dilution, three aliquots of 1 g or 1 mL are used to inoculate three tubes with 9 to 10 mL of Soybean-Casein Digest Broth. If necessary a surface-active agent such as polysorbate 80, or an inactivator of antimicrobial agents may be added to the medium. Thus, if three levels of dilution are prepared, nine tubes are inoculated.
按样品的制备，接种和稀释，以及抗菌活性的中和/移除这些项下的描述，制备系列的、至少连续三级、每级稀释10倍的产品稀释液。从每个水平的稀释液，将1克或者1毫升的三等分试样接种到三管9至10毫升的大豆酪蛋白消化物肉汤培养基。如有必要，像聚山梨醇酯80这样的表面活性剂，或某种抗菌剂的灭活剂可以加入到培养基中。因此，如果制备了三水平的稀释液，则会接种九个试管。
Incubate all tubes at 30o to 35o for not more than 3 days. If reading of the results is difficult or uncertain owing to the nature of the product to be examined, subculture in the same broth or in Soybean-Casein Digest Agar for 1 to 2 days at the same temperature, and use these results. From Table 3, determine the most probable number of microorganisms per g or mL of the product to be examined.
培养所有的试管，温度为30o至35o之间，不超过3天。如果由于供试品的性质导致结果的读数很难或不确定，则在相同温度下，在同样的肉汤培养基或大豆酪蛋白消化物琼脂培养基中放置1至2天进行再次培养，并且使用这些结果。从表3中，确定每克或每毫升的供试品中微生物的最大几率数。
RESULTS AND INTERPRETATION结果和说明
When verifying the suitability of the Membrane Filtration method or the Plate-Count Method, a mean count of any of the test organisms not differing by a factor greater than 2 from the value of the control defined in Inoculation and Dilution in the absence of product must be obtained. When verifying the suitability of the MPN Method, the calculated value from the inoculum must be within 95% confidence limits of the results obtained with the control.
当确认膜过滤法或平板计数法的适用性时，任何供试微生物的平均计数与在没有产品的情况下，从培养和稀释项下规定的对照组的数值差距必须不超过2。当确认最大几率数法的适用性时，从接种体得到的计算值必须是在从对照组取得的结果的95%置信限度以内。
TESTING OF PRODUCTS供试品的测试
Amount Used for the Test用于测试的数量
Unless otherwise directed, use 10 g or 10 mL of the product to be examined taken with the precautions referred to above. For fluids or solids in aerosol form, sample 10 containers. For transdermal patches, sample 10 patches.
除非另有规定，使用10克或者10毫升供试品，并采取上面提到的预防措施。对于气溶胶形式下的液体或固体，取10个容器作样品。对于贴剂，取10片作样品。
The amount to be tested may be reduced for active substances that will be formulated in the following conditions: the amount per dosage unit (e.g., table, capsule, injection) is less than or equal to 1 mg, or the amount per g or mL (for preparations not presented in dose units) is less than 1 mg. In these cases, the amount of sample to be tested is not less than the amount present in 10 dosage units or 10 g or 10 mL of the product.
对于某些活性物质来说，供试数量可以减少，前提是这些活性物质将会按如下条件组方：每剂量单位（例如，片，胶囊，注射液）数量小于或等于1毫克，或者每克或毫升中数量（对于不按剂量单位使用的制备品）小于1毫克。在这些情况下，供试样品数量不小于当前10剂量单位中存在的数量，或10克或10毫升的供试品。
Examination of the Product产品的检测
MEMBRANE FILTRATION膜过滤
Use a filtration apparatus designed to allow the transfer of the filter to the medium. Prepare the sample using a method that has been shown to be suitable as described in Growth Promotion Test and Suitability of the Counting Method, transfer the appropriate amount to each of two membrane filters, and filter immediately. Wash each filter following the procedure shown to be suitable.
使用能够将滤膜转移至培养基中的过滤设备。按生长促进测试和计数方法的适用性项下描述的、已经证明适用的方法制备样品，转移合适的量至两个膜过滤器中的每一个，并立即过滤。按照以下已经证明适用的规程清洗每个过滤器。
For the determination of TAMC, transfer one of the membrane filters to the surface of Soybean-Casein Digest Agar. For the determination of TYMC, transfer the other membrane to the surface of Sabouraud Dextrose Agar. Incubate the plate of Soybean-Casein Digest Agar at 30o to 35o for 3 to 5 days and the plate of Sabouraud Dextrose Agar at 20o to 25o for 5 to 7 days. Calculate the number of cfu per g or per mL of product.
对于总好氧微生物计数的测定，转移滤膜中的一个至大豆酪蛋白消化物琼脂培养基的表面。对酵母菌和霉菌联合计数的测定，转移另一个滤膜至Sabouraud（沙氏）葡萄糖琼脂培养基的表面。在温度30o至35o之间培养大豆酪蛋白消化物琼脂培养基的平皿3至5天，并在温度20o至25o之间培养Sabouraud（沙氏）葡萄糖琼脂培养基的平皿5至7天。计算每克或每毫升供试品的菌落数（cfu）数量。
When examining transdermal patches, separately filter 10% of the volume of the preparation described for Preparation of the Sample through each of two sterile filter membrances. Transfer one membrance to Soybean-Casein Digest Agar for TAMC and the other membrane to Sabouraud Dextrose Agar for TYMC.
当检测贴剂时，分别将样品的制备项下描述的制备品数量的10%过滤通过两个无菌滤膜中的一个。为总好氧微生物计数将一个滤膜转移至大豆酪蛋白消化物琼脂培养基，以检测总好氧微生物计数，而将另一个滤膜转移至Sabouraud（沙氏）葡萄糖琼脂培养基，以检测总酵母菌和霉菌联合计数。
PLATE-COUNT METHODS平板计数法
Pour-Plate Method—Prepare the sample using a method that has been shown to be suitable as described in Growth Promotion Test and Suitability of the Counting Method. Prepare for each medium at least two Petri dishes for each level of dilution. Incubate the plates of Soybean-Casein Digest Agar at 30o to 35o for 3 to 5 days and the plates of Sabouraud Dextrose Agar at 20o to 25o for 5 to 7 days. Select the plates corresponding to a given dilution and showing the highest number of colonies less than 250 for TAMC and 50 for TYMC. Take the arithmetic mean per culture medium of the counts, and calculate the number of cfu per g or per mL of product.
倾注培养法——使用已经证明适用的、在生长促进测试和计数方法的适用性项下描述的方法制备样品。对于每种培养基，为每个稀释水平准备至少两个培养平皿。在温度30o至35o 之间，培养大豆酪蛋白消化物琼脂培养基的平皿3至5天，并在温度20o至25o之间，培养Sabouraud（沙氏）葡萄糖琼脂的平皿5至7天。选择总好氧微生物的数量不超过250个和总酵母和霉菌的数量不超过50的稀释平板进行计数。取每培养基计数的算术平均值，并计算每克或每毫升供试品的cfu数量。
Surface-Spread Method—Prepare the sample using a method that has been shown to be suitable as described in Growth Promotion Test and Suitability of the Counting Method. Prepare at least two Petri dishes for each medium and each level of dilution. For incubation and calculation of the number of cfu, proceed as directed for the Pour-Plate Method.
表面铺展法——使用已经证明适用的、在生长促进测试和计数方法的适用性项下描述的方法制备供试品。为每种培养基和每个稀释水平准备至少两个培养平皿和不同程度的稀释液。对于培养和cfu数量的计算，直接按倾注培养法进行。
MOST-PROBABLE-NUMBER METHOD最大几率数法
Prepare and dilute the sample using a method that has been shown to be suitable as described in Growth Promotion Test and Suitability of the Counting Method. Incubate all tubes for 3 to 5 days at 30o to 35o. Subculture if necessary, using the procedure shown to be suitable. Record for each level of dilution the number of tubes showing microbial growth. Determine the most probable number of microorganisms per g or mL of the product to be examined from Table 3.
使用已经证明适当的、在生长促进测试和计数方法的适用性项下描述的方法制备和稀释样品。在温度30o至35o之间时，培养所有试管3到5天。如有必要，则使用已经证实适合的规程再次培养。记录不同稀释水平下显示出微生物生长的试管数。从表3中确定每克或每毫升供试品中微生物的最大几率数。
Interpretation of the Results结果的说明
The total aerobic microbial count (TAMC) is considered to be equal to the number of cfu found using Soybean-Casein Digest Agar; if colonies of fungi are detected on this medium, they are counted as part of TAMC. The total combined yeasts and molds count (TYMC) is considered to be equal to the number of cfu found using Sabouraud Dextrose Agar; if colonies of bacteria are detected on this medium, they are counted as part of TYMC.When the TYMC is expected to exceed the acceptance criterion due to the bacterial growth, Sabouraud Dextrose Agar containing antibiotics may be used. If the count is carried out by the MPN Method, the calculated value is TAMC.
总好氧微生物计数（TAMC）被认为等于使用大豆酪蛋白消化物琼脂培养基所发现的cfu数量，如果在该培养基上发现真菌的菌落，则它们作为总好氧微生物计数的一部分来计数。总酵母菌和霉菌联合计数（TYMC）被认为等于使用Sabouraud（沙氏）葡萄粮琼脂培养基所发现的cfu数量，如果在该培养基上发现细菌的菌落，则它们作为总酵母菌和霉菌联合计数的一部分来计数。当细菌的生长导致总酵母菌和霉菌联合计数预计超过接受标准时，可以使用含有抗生素的Sabouraud（沙氏）葡萄粮琼脂培养基。如果通过最大几率数法进行计数，则计算出的数值就是总好氧微生物计数。
When an acceptance criterion for microbiological quality is prescribed, it is interpreted as follows:
当规定微生物质量的接受标准给出时，其可以理解如下：
— 101 cfu: maximum acceptable count = 20;
— 102 cfu: maximum acceptable count = 200;
— 103 cfu: maximum acceptable count = 2000;
and so forth.
— 101 cfu: 最高可接受计数＝20；
— 102 cfu: 最高可接受计数＝200；
— 103 cfu: 最高可接受计数＝2000；
等等。
The recommended solutions and media are described in Microbiological Examination of Nonsterile Products: Tests for Specified Microorganisms <62>.
推荐的溶液和培养基在非无菌产品微生物学检查：指定微生物检查<62>中描述。
微生物的计数——血球计数板法
微生物得计数——血球计数板法 【摘要】测定微生物细胞数量得方法很多，有分光光度法、显微直接计数法与平板计数法。分光光度法比较简便，易操作，但就是会使数据严重偏大。而平板计数法则会使实验数据严重偏小.?显微计数法适用于各种含单细胞菌体得纯培养悬浮液,如有杂菌或杂质，常不易分辨.菌体较大得酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板,一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽(PetｒｏｆHausｓｅr)细菌计数板。两种计数板得原理与部件相同，只就是细菌计数板较薄,可以使用油镜观察。而血球计数板较厚,不能使用油镜，计数板下部得细菌不易瞧清.本实验采用血球计数板法，主要目得就是了解血球计数板法得构造与使用方法，学会用血球计数板对酵母菌细胞进行计数。 一、实验目得与要求 １、了解微生物计数常用得三种方法：分光光度法;平板计数法；血球计数板法。 2、了解血球计数板得构造与使用方法。 3、学会用血球计数板对酵母细胞进行计数。 二、基本原理 利用血球计数板在显微镜下直接计数，就是一种常用得微生物计数方法。此法得优点就是直观、快速.将经过适当稀释得菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间得计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室得容积就是一定得（０、1mｍ2），所以可以根据在显微镜下观察到得微生物数目来换算成单位体积内得微生物总数目。由于此法计得得就是活菌体与死菌体得总与，故又称为总菌计数法. 血球计数板,通常就是一块特制得载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间得平台又被一短横槽隔成两半，每一边得平台上各刻有一个方格网,每个方格网共分九个大方格,中间得大方格即为计数室，微生物得计数就在计数室中进行。 计数室得刻度一般有两种规格,一种就是一个大方格分成１６个中方格，而每个中方格又分成25个小方格;另一种就是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但无论就是哪种规格得计数板,每一个大方格中
土壤微生物数量测定方法整理
土壤微生物的分离鉴定及数量测定 （一）培养基的制备 Ⅰ测定微生物总量培养基： 1. 细菌培养基（牛肉膏蛋白胨琼脂培养基） 牛肉膏Beefextract 5.0g 蛋白胨Peptone 10.0g NaCI 5.0g 蒸馏水H20 1000m1 琼脂15～20g PH 7.2~7.4 制备步骤： ⑴在100 mL小烧杯中称取牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，加50 mL蒸馏水，置电炉搅拌加热至牛肉膏，蛋白胨完全溶解. ⑵向小铝锅中加入500 mL蒸馏水，将溶解的牛肉膏，蛋白胨倒入铝锅中并用自来水洗2～3次.加入 5.0gNaC1，在电炉上边加热边搅拌. ⑶加入洗净的琼脂条，继续搅拌，加热至琼脂完全熔化，补足水量至1000 mL. ⑷用NaOH或HC1调至pH7.0. 用酸度计或用玻棒沾少许液体用精密pH试纸测定其pH值，并用10％NaOH 调至所需pH值，必要时用滤纸或脱脂棉过滤。一般比要求的pH高出0.2，因为高压蒸汽灭菌后，pH常降低。 ⑸根据不同需要，可将配好的培养基分装入配有棉塞的试管或三角瓶内。注意分装时避免培养基挂在瓶口或管口上引起杂菌污染。如液体培养基，应装试管高度的1/4左右；固体培养基装试管高度的1/5左右；装入三角瓶的量以三角瓶容量的一半为限。，塞好棉塞，装入小铁丝筐，然后用旧报纸将棉塞部分包好. 标签表明培养基的名称、配制日期等。 ⑹高压蒸汽灭菌，用0.1Mpa（15lb/in2）121℃灭菌（15-20）30min. 2. 放线菌培养基（改良高氏1号琼脂培养基） 可溶性淀粉20g KNO3 1g K2HPO40.5g MgSO4? 7H2O 0.5g NaCl 0.5g原0.05g FeSO4? 7H2O 0.01g pH 7.2-7.4 制备步骤： （1）计算根据配方计算各种药品所需要的量，然后再分别称量。 （2）称量准确称量各种成分。 （3）溶化配制时，先用少量冷水将淀粉调成糊状，倒入少许沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分，溶化后，补足水分到1000ml，调PH（可不调）。 （4）分装、包扎、灭菌。
常见的微生物检测方法
常见的微生物检测 方法
摘要：微生物的检测，无论在理论研究还是在生产实践中都具有重要的意义，本文分生长量测定法，微生物计数法，生理指标法和商业化快速微生物检测简要介绍了利用微生物重量，体积，大小，生理代谢物等指标的二十余种常见的检测方法，简要介绍了这些方法的原理，应用范围和优缺点。 概述： 一个微生物细胞在合适的外界条件下，不断的吸收营养物质，并按自己的代谢方式进行新陈代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用，则其原生质的总量（重量，体积，大小）就不断增加，于是出现了个体的生长现象。如果这是一种平衡生长，即各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，从而引起个体数目的增加，这时，原有的个体已经发展成一个群体。随着群体中各个个体的进一步生长，就引起了这一群体的生长，这可从其体积、重量、密度或浓度作指标来衡量。微生物的生长不同于其它生物的生长，微生物的个体生长在科研上有一定困难，一般情况下也没有实际意义。微生物是以量取胜的，因此，微生物的生长一般指群体的扩增。微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。因此生长繁殖情况就可作为研究各种生理生化和遗传等问题的重要指标，同
时，微生物在生产实践上的各种应用或是对致病，霉腐微生物的防治都和她们的生长抑制紧密相关。因此有必要介绍一下微生物生长情况的检测方法。既然生长意味着原生质含量的增加，因此测定的方法也都直接或间接的以次为根据，而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。微生物生长的衡量，能够从其重量，体积，密度，浓度，做指标来进行衡量。 生长量测定法 体积测量法：又称测菌丝浓度法。 经过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液（如10毫升）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间（如5分钟）和转速（如5000 rpm），离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为（10-v）/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。 称干重法：
微生物大小的测定及微生物数量的直接计数法
微生物大小的测定及微生物数量的直接计数法摘要：本文使用了目镜测微尺和镜台测微尺来测量野生酵母的细胞大小，得到的结果是宽在5.78~11之间，长在8.25~20之间。然后用血细胞计数板对酵母菌进行计数，并绘制其生长曲线，有四个时期，分别是延滞期、对数期、稳定期和衰亡期。 关键词：细胞大小血细胞计数板酵母菌生长曲线 前言 生产生活中利用微生物时，需要了解微生物的一些基本物理属性，如菌体的大小形状等。本实验利用显微测微尺对野生酵母进行测量，并用血球计数板对酵母菌进行其生长曲线的测定，了解去生长规律。通过此综合性实验加深对无菌操作的印象，并将其掌握。 1实验材料与仪器 1．1实验材料与试剂 麦芽汁培养基、生理盐水、果汁（自制）、活化的酵母菌、酒精 1．2实验仪器 锥形瓶、试管、接种环、移液枪、显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、盖玻片、载玻片、滴管、血细胞计数板、吸水纸、酒精灯 2实验方法 2．1预准备 2.1.1培养基的制备 麦芽汁培养基（130.1g/L）200ml*4瓶 麦芽汁琼脂培养基（145.1g/L）5ml*2支试管150ml*1瓶 生理盐水9ml*20支 （制备后高压蒸汽灭菌121℃，20min） 2.1.2酵母分离纯化 平板划线分离：先倒制无菌琼脂培养基平板,待充分冷却凝固后,用接种环以无菌沾取少量待分离的含菌样品,在无菌琼脂平板表面进行有规则的划线。划线的方式有连续划线、平行划线、扇形划线或其它形式的划线。通过这样在平板上进行划线稀释, 微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少, 并逐步分散开
来。经培养后,可在平板表面形成分散的单 个菌落。但单个菌落并不一定是由单个细 胞形成的，需再重复划线1-2次, 并结合显 微镜检测个体形态特征, 才可获得真正的 纯培养物。 斜面接种是从已生长好的菌种斜面上 挑取少量菌种移植至另一支新鲜斜面培养基上的一种接种方法。具体操作如下：接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等。贴在距试管口约2-3cm的位置。点燃酒精灯。用接种环将少许菌种移接到贴好标签的试管斜面上。操作必须按无菌操作法进行。 简述如下：1)手持试管：将菌种和待接斜面的两支试管用大拇指和其他四指握在左手中，使中指位于两试管之间部位。斜面面向操作者，并使它们位于水平位置。2)旋松管塞：先用有于松动棉塞或塑料管盖，以便接种时拔出。3)取接种环：右手拿接种环(如握钢笔一样)，在火焰上将环端灼烧灭菌。然后将有可能伸入试管的其余部分均灼烧灭菌，重复此操作，再灼烧一次。4)拔管塞：用右手的无名指、小指和手掌边先后取下菌种管和待接试管的管塞，然后让试管口缓缓过火灭菌(切勿烧得过烫)。5)接种环冷却：将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却。6)取菌：待接种环冷却后，轻轻沾取少量菌体或胞子，然后将接种环移出菌种管，注意不要使接种环的部分碰到管壁，取出后不可使带菌接种环通过火焰。7)接种：在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。从斜面培养基的底部向上部作“Z”形来回密集划线，切勿划破培养基。有时也可用接种针仅在斜面培养基的中央拉一条直线作斜面接种，直线接种可观察不同菌种的生长特点。8)塞管塞：取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将管塞旋上。塞棉塞时不要用试管去迎棉塞，以免试管在移动时纳入不洁空气。9)将接种环灼烧灭菌。放下接种环，再将棉花塞旋紧。
土壤微生物计数法
土壤微生物计数法 土壤是最复杂、最丰富的微生物基因库，所含微生物不仅数量巨大，而且各类繁多，主要包括细菌、真菌和放线菌三大类，是土壤最活跃的成分。土壤微生物数量测定方法可分为三大类：一类是根据在培养基上生长的菌落数来计算土壤微生物的数量，统称为培养计数法，主要有稀释平板法和最大或然计数法；二类是将土壤微生物染色后，在显微镜下观察计数，称为直接镜检法，包括涂片法、琼脂薄片法和膜过滤法等；三类是直接将微生物从土壤中分离和提取出来后再进行测定，主要有离心分离法。 1.1培养计数法 1.1.1概要 在自然条件下，土壤中的大多数微生物处于休眠状态，一旦供给可利用的碳源（如培养基），一些微生物将快速生长繁殖。因此，根据在培养基上所生长的微生物数量，可以估算土壤中微生物的数量。这种土壤微生物数量测定方法称为培养计数法，主要包括稀释平板计数法（简称稀释平板法）和最大或然计数法。 稀释平板计数法的基本原理：土壤微生物经分散处理成为单个细胞后，在特殊的培养基上生长并形成一个菌落，根据形成的菌落数来计算微生物的数量。 最大或然计数法的基本原理：假设被测定的微生物在稀释液中均匀分布，并在试管或平板上全部存活，随着稀释倍数的加大，稀释液中微生物的数量将越来越少，直到将某一稀释度的土壤稀释液接种到培养基上培养后，没有或很少出现微生物菌落。根据没有出现菌落的最低稀释度和出现菌落的最高稀释度，再用最大或然计数法计算出样品中微生物的数量。 1.1.2稀释平板法 一、试剂配制
常用的培养基各类很多（见附录一），可根据需要测定的微生物种类选择培养基。按配方配制培养基后，先在121℃下灭菌15min，冷却至45～50℃使用。凝固后的培养基可加热溶解后使用。 二、仪器设备 广口瓶或三角瓶及配套的橡皮塞，移液管（1ml、10ml，吸口用棉花塞住后用牛皮纸包好灭菌）培养皿（9㎝，用牛皮纸包好后灭菌）和显微镜等。 三、操作步骤 （1）土壤系列稀释液制备 取新鲜土壤（＜2㎜）10.00g，放入经灭菌的装有70ml水的广口瓶中，塞上经灭菌的橡皮塞，在振荡机上振荡10min，此为10-1土壤稀释液。迅速用灭菌的移液管吸取10-1土壤稀释液10ml，放入灭菌的装有90ml水的广口瓶中，塞上橡皮塞，混合均匀，此为10-2土壤稀释液。再如此依次配制10-3、10-4、10-5和10-6系列土壤稀释液。上述操作均在无菌条件下进行，以避免污染。 （2）平板制备和培养 从两个稀释倍数的土壤稀释液中（细菌和放线菌通常用10-5和10-6土壤稀释液，真菌用10-2和10-3稀释液）吸取1.00ml（吸前摇匀），分别放入五套培养皿中（注意每变换一次浓度，须更换一支移液管）；再向培养皿内注入45～50℃的培养基10ml，立即混合均匀，静置凝固后，倒置放于培养箱中培养。细菌和放线菌在28℃下培养7～10d，真菌在25℃下培养3～5d。 （3）镜检计数
微生物计数方法
微生物的显微直接计数法 一、实验目的 了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，掌握显微镜下直接计数的技能。 二、实验原理 测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。 显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。 血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区（图21-1），计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。 计数区边长为1mm，则计数区的面积为l mm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。 使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。 已知：1mm3体积=10 mm×10 mm×10 mm= 1000mm3 所以：1mm3体积应含有小方格数为1000mm3/1/4000mm3=4×106个小方格，即系数K=4×106。 因此：每ml菌悬液中含有细胞数= 每个小格中细胞平均数（N）×系数（K）×菌液稀释倍数（d） 三、实验器材 1．活材料：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）斜面或培养液。 2．器材：显微镜、血球计数板、盖玻片（22mm×22mm）、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸。 四、实验方法 1．视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释到10-2），以每小格的菌数可数为度。 2．取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。 3．将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高。然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。4．静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。 5．计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央l个大方格的菌数（即80个小格）。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。
土壤微生物测定方法
土壤微生物测定 土壤微生物活性表示土壤中整个微生物群落或其中的一些特殊种群状态，可以反映自然或农田生态系统的微小变化。土壤微生物活性的表征量有:微生物量、C/N、土壤呼吸强度和纤维呼吸强度、微生物区系、磷酸酶活性、酶活性等。 测定指标： 1、土壤微生物量(Mierobia lBiomass，MB) 能代表参与调控土壤能量和养分循环以及有机物质转化相对应微生物的数量，一般指土壤中体积小于5Χ103um3的生物总量。它与土壤有机质含量密切相关。 目前，熏蒸法是使用最广泛的一种测定土壤微生物量的方法阎，它是将待测土壤经药剂熏蒸后，土壤中微生物被杀死，被杀死的微生物体被新加人原土样的微生物分解(矿化)而放出CO2，根据释放出的CO2:的量和微生物体矿化率常数Kc可计算出该土样微生物中的碳量。因此碳量的大小就反映了微生物量的大小。 此外，还有平板计(通过显微镜直接计数)、成份分析法、底物诱导呼吸法、熏蒸培养法(测定油污染土壤中的微生物量—碳。受土壤水分状况影响较大，不适用强酸性土壤及刚施用过大量有机肥的土壤等)、熏蒸提取法等，均可用来测定土壤微生物量。 熏蒸提取-容量分析法 操作步骤： （1）土壤前处理和熏蒸 （2）提取 将熏蒸土壤无损地转移到200mL聚乙烯塑料瓶中，加入·L-1 K2SO4（图水比为1:4；w：v），振荡30min（300rev·min-1），用中速定量滤纸过滤于125mL 塑料瓶中。熏蒸开始的同时，另称取等量的3份土壤于200mL聚乙烯塑料瓶中，直接加入·L-1 K2SO4提取；另作3个无土壤空白。提取液应立即分析。 （3）测定 吸取10mL上述土壤提取液于150mL消化管（24mmх295mm）中，准确加入mol·L-1K2Cr2O7—12 mol·L-1H2SO4溶液，加入2~3玻璃珠或瓷片，混匀后置于175±1℃磷酸浴中煮沸10min（放入消化管前，磷酸浴温度应调至179℃，
微生物大小测定和显微镜直接计数
实验五微生物大小测定和显微镜直接计数 一、实验目的： 1、了解显微测微尺的结构； 2、掌握显微测微尺用于测量菌体的方法； 3、学习使用血细胞计数板计算酵母细胞数的原理和方法； 4、了解微生物活体染色的原理的技术的方法。 二、实验原理： 1、显微测微尺可用于测量微生物细胞或孢子的大小，包括镜台测微尺和目镜测微尺两个部件。镜台测微尺全长1mm，等分为100格，每格0.01mm。用于校正目镜测微尺没小哥的长度.目镜测微尺其中央刻有50等分或100等分的小格.测量前应预先用镜台测微尺来校正并计算出在某一放大镜下,目镜测微尺每小格所代表的实际长度,再以后作为测量微生物 细胞的长度.目镜测微尺每格长度/μm = 两条重合线间镜台测微尺的格数×10/两条重合线间目镜测微尺的格数 2、利用血球计数板直接在显微镜下计数微生物的细胞（或孢子）数目。优点：直观、快速、操作简便，其缺点为：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察 1ml菌液中的总菌数=（5个方格中的总菌数/5）×25×104×稀释倍数 本实验中暂规定：计上不计下，计左不计右，即位于本格上线和左线上的细胞计入本格，本格的下线和右线上的细胞按规定计入相应的格中 三、实验步骤： （一）微生物大小的测定： 1、放置目镜测微尺：取出目镜，旋开目透镜，目镜测微尺放在光阑上，旋上目镜，将目镜插入镜筒 2、将镜台测微尺放在井台上，调焦看清镜台测微尺的刻度 3、低倍镜下使镜台测微尺与目镜测微尺刻度平行，一段起止线重合，分别数出格数并求出目镜测微尺每小格的实际长度，同样的方法在高倍镜下重复进行 4、按公式计算目镜测微尺每格的长度 5、测量菌体的大小：取下镜台测微尺，制作酵母菌涂片，分别在低倍镜、高倍镜下测量10个菌体的长宽，求其平均值，用长（μm)*宽（μm）表示 （二）显微镜直接计数 1、制备酵母菌的稀释液，将菌液稀释10倍 2、将计数板的盖玻片放在计数室上面的两边平台架上，混匀后酵母菌悬液吸取滴加在盖玻片与计数板的边缘缝隙处，待菌液渗入计数室，菌体自然沉降与稳定后计数 3、在计数室移至视野中央，选取25中格（4觉与中央）计含菌数，重复计数2-4个计数室内的含菌量，求其平均值。 四、材料和器皿： 酵母菌液，显微镜，镜台测微尺，目镜测微尺，擦镜纸，二甲苯，血细胞计数板，配套的计数板厚盖玻片，试管，移液管，吸水纸。 五、实验结果：
非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法
湖南湘大兽药有限公司工作标准文件 一、目的：为规定非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法的检测方法和操作要求，特制定本操作规程。 二、引用标准：中华人民共和国兽药典（2015年版一部附录P179）。 三、适用范围：适用于本公司检品采用非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法的质量检测。 四、责任者：理化分析员对本标准的实施负责。 五、正文： 1简述： 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。 微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。 如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检查时, 若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。 供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。 2.计数方法 计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（Most-Probable-Number Method，简称MPN 法）。MPN 法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，
MPN 法可能是更适合的方法。 供试品检查时,应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，检测的样品量应能保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。所选方法的适用性须经确认。 3.计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验 供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。 供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。 若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。 表 1 试验菌液的制备和使用
农田土壤中微生物的检测
农田土壤中微生物的检测01 农田土壤中微生物的检测及探究；摘要：土壤微生物是土壤的重要组成部分，其群落结构；土壤的质量，是土壤生态系统稳定性的重要指示因子；Microbiologyinthesoilisa；关键词：农田土壤微生物检测展望；土壤微生物是生态系统的重要组成部分,其数量和种类；材料和方法1）材料；1.1仪器和其他用品三角烧瓶培养皿，吸管试管涂布；1.2培养基牛肉膏蛋白胨培养基农田土壤中微生物的检测及探究 摘要：土壤微生物是土壤的重要组成部分，其群落结构多样性及变化在一定程度上反映了 土壤的质量，是土壤生态系统稳定性的重要指示因子。通过对农田土壤中微生物的检测，了解农田中微生物的多样性，并从生态功能方面阐述了土壤微生物多样性的作用，并探讨其发展前景。 Microbiology in the soil is a important part of the soil . The diversity and chang eable of its community reflect the quality of the soil to some extend .It is the import ant factor of the soil’steady .we can know the diversity of soil by detect the farmlan d’soil .and account the function of the microbiology from the aspect of ecology. Final ly ,we researched the future of microbiology. 关键词：农田土壤微生物检测展望 土壤微生物是生态系统的重要组成部分, 其数量和种类受耕作制度、地理位置、土壤层次、植被、土壤肥力、气候变化及土壤类型等诸多因素的影响, 在土壤环境中起着重要作用。微生物在土壤中的数量、分布与活动情况, 反应了土壤肥力的高低。不同的土地利用方式导致土壤环境不同。农田中含有着许许多多的微生物，千百年来，微生物在默默的为人类服务而不为人知。了解农田土壤中微生物的种类，从而能够更好的为人类做贡献。通过不同的培养基对土壤中的微生物进行测定，从未得
微生物直接计数法及测微技术
微生物直接计数法及测微技术 实验类型：基础 学时：4(参考) 内容： 一、实验目的 1.了解血球计数板计数原理，并掌握计数方法。 2.掌握用测微尺测定微生物大小的方法。 二、实验原理 显微镜直接计数法是将一定稀释的菌体或孢子悬液注入血球计数板的计数室中，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。因为计数板是一块特别的载玻片。其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格(见图2—3—44)；另一种是一个大方格分成16个中方格，每个中方格又分成25个小方格，无论哪种每个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为0．1mm，所以计数室的容积为0．1mm3。计数时，通常只用5个中格内的菌体(孢子)数即可。然后求出每个中方格的平均值，再乘上25或16，得出一个大方格中的总茵数，再换算成lml菌液中的总菌数。若设5个中方格中总菌数为N，菌液稀释倍数为M，如果是25个中方格计数板，则计算方法为： lml菌液中的总菌数=平均每个中格中菌的个数×25×104×M=50000N·M(个) 微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具——测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺。镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般是将1mm等分为100格，每格长0．01mm(即10pm)。镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于校正目镜测微尺每格的相对长度。 三、试剂与器材 1.材料酿酒酵母、藤黄微球菌和大肠杆菌的染色标本片、酿酒酵母24h马铃薯斜面培养物。 2.实验器材细胞计数板、显微镜、盖玻片、无菌毛细滴管、目镜测微尺、镜台测微尺、载玻片、盖玻片、显微镜等。 四、实验内容 1.微生物直接计数法 菌悬液制备→镜检计数室→加样品→显微镜计数→清洗血细胞计数板 2.微生物测微技术 装目镜测微尺→校正→菌体大小测定 五、关键步骤及注意事项 1.防止加样空气泡产生。 2.调节显微镜光线的强弱适当。 六、思考题 1.根据你的体会，说明用血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面?应如何尽量减少误差、力求准确? 2.某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌存活率，请设计1～2种可行的检测方法。 3.为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正?
污染土壤微生物群落结构多样性及功能多样性测定方法
第26卷第10期 2006年10月生 态 学 报ACT A EC O LOGIC A SI NIC A V ol.26,N o.10Oct.,2006 污染土壤微生物群落结构多样性及 功能多样性测定方法 陈承利,廖 敏3 ,曾路生 (污染环境修复与生态健康教育部重点实验室,浙江大学环境与资源学院,杭州 310029)基金项目:国家重点基础研究发展规划“973”资助项目(2002C B410804);国家自然科学基金资助项目(40201026) 收稿日期:2005206227;修订日期:2006205220 作者简介:陈承利(1982～),男,浙江平阳,硕士,主要从事土壤环境化学与环境生态毒理学研究.E 2mail :clchen1982@1631com 3通讯作者C orresponding author.E -mail :liaom in @https://www.360docs.net/doc/6816850168.html, or liaom inzju1@1631com Found ation item :The project was supported by National K ey Basic Research Support F oundation of China (N o.2002C B410804)and National Natural Science F oundation of China (N o.40201026) R eceived d ate :2005206227;Accepted d ate :2006205220 Biography :CHE N Cheng 2Li ,M aster ,mainly engaged in s oil environmental chem istry and ecotoxicology.E 2mail :clchen1982@1631com 摘要:土壤微生物在促进土壤质量和植物健康方面发挥着重要的作用,土壤微生物群落结构和组成的多样性及其变化在一定程度上反映了土壤质量。为了更好地了解土壤健康状况,非常有必要发展有效的方法来研究污染土壤微生物的多样性、分布以及行为等。回顾了近年来国内外污染土壤微生物群落结构多样性及功能多样性的测定方法,包括生物化学技术和分子生物学技术,现将它们的原理、优缺点、实用性及其发展动态作一阐述,同时指出结合这两种技术可为微生物群落分析提供一个更全面的、精确的方法。 关键词:污染土壤;微生物多样性;分子生物学;BI O LOG;P LFA ;PCR ;DNA 文章编号:100020933(2006)1023404209 中图分类号:Q143,Q938,S154 文献标识码:A Methods to measure the microbial community structure and functional diversity in polluted soils CHE N Cheng 2Li ,LI AO Min 3,ZE NG Lu 2Sheng (MOE K ey Laboratory ,Environmental Remediation and Ecosystem H ealth ,College o f Environmental and Resources Sciences ,Zhejiang Univer sity ,Hangzhou ,310029,China ).Acta Ecologica Sinica ,2006,26(10):3404～3412. Abstract :S oil m icroorganisms ,such as bacteria and fungi ,play im portant roles in prom oting soil quality and im proving plant health and nutrition ,thus in fluencing terrestrial ecosystems.Increasing anthropogenic activities ,such as spraw ling urbanization ,agricultural development ,pesticides utilization ,and pollutions from all sources ,can potentially affect soil m icrobial community com position and diversity ,leading to deterioration of soil quality and fertility.H owever ,it is yet to be determ ined how these changes in m icrobial diversity can in fluence surface and ground ecosystems.T o that end ,there is an acute need for reliable and accurate methods to study the community structure and tax onomy of soil m icroorganisms.W ithout the development of effective methods for studying the m icrobial diversity ,distribution ,and behavior in polluted soil ,a thorough understanding of m icrobial diversity ,as well as its im pact on soil health ,cannot be achieved. The determ ination of species diversity depends on several factors including the intensity of each species ,the total number of species present ,species evenness ,and the spatial distribution of species.M ethods to measure m icrobial community structure and functional diversity in polluted soils can be classified into tw o groups ,i.e.,biochem ical 2based techniques and m olecular biological 2based techniques.T ypically ,diversity studies include the relative com parisons of communities across a gradient of stress and disturbance.W ith current techniques ,it is difficult to study true diversity due to lack of know ledge on com position and the techniques to determ ine the accuracy of the extraction or detection methods.T raditionally ,the analysis of soil m icrobial
实验四 微生物平板菌落计数法
实验四微生物平板菌落计数法 一、实验目的 学习并掌握平板菌落计数的基本原理和方法。 二、实验原理 平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2～3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低，为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位（cfu）而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。 平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水（包括水源水）等的含菌指数或污染程度的检测。 三、实验器材 1 ．菌种：酵母菌。 2 ．培养基：YEB培养基。 3 ．仪器或其他用具： 1ml 无菌吸管，无菌平皿，盛有 4.5ml 无菌水的试管，试管架，恒温培养箱等。 四、实验步骤 1 ．编号 取无菌平皿 9 套，分别用记号笔标明 10-4、 10-5、 10-6（稀释度）各 2 套，另取 6 支盛有 4.5ml 无菌水的试管，依次标是 10-1、 10-2、 10-3、 10-4、 10-5、 10-6。 2 ．稀释 用 1ml 无菌吸管吸取 1ml 已充分混匀的大肠杆菌菌悬液（待测样品），精确地放0.5ml 至 10-1的试管中，此即为 10 倍稀释。将多余的菌液放回原菌液中。
土壤酶活性及土壤微生物计数测定方法
土壤酶活性及土壤微生物计数测定方法 The manuscript was revised on the evening of 2021
土壤酶活性及微生物测定 土壤酶活性测定 取样工具及取样方法 在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。土样在自然条件下烘干装入袋中备用。 所需试剂： 酒石酸钠、NaCl、阿拉伯胶、纳氏试剂、硫酸铵[(NH4)2SO4]、甲苯、苯磷酸二钠、、HAc、酚、铁氰化钾、4-氨基安替吡啉、碘化钾、氯化汞、氢氧化钾、、 配置方法： 铵态氮标准溶液：称取0.4717g(精确至0.0001g)干燥的硫酸铵[(NH4)2SO4]溶于水中，再加水稀释至1000mL，此溶液1mL含100μg N。往500ml容量瓶中注入10、25、40、60、75、90ml标准溶液并用蒸馏水稀释至刻度，制备成的溶液在490nm下比色，并绘制标准曲线。 醋酸缓冲液：，50g，溶于适量水中，加6mol/LHAc34ml，稀释至500ml。 硼酸缓冲液：，80毫升l硼砂（）和l的硼酸混合。 纳氏试剂：将碘化钾10g溶于10ml水中，边搅拌边慢慢地加入氯化汞饱和水溶液，直至生成的红色沉淀不再溶解为止。加入氢氧化钾30g并溶解之，再加入氯化汞饱和溶液1ml，加水至200ml。静置，取上层清液，贮于棕色瓶中
酚的标准溶液：（1）原液—1克酚溶于蒸馏水中定容至1升，溶液在暗色中稳定，（2）工作液—取50ml原液稀释至1升（1ml含酚）；分别向100ml容量瓶中注入1、2、3、4、5、6、7ml工作液并显色定容（分别相当于、、、、、、毫克酚），待颜色稳定后，570nm比色绘制标准曲线。 测定方法 磷酸酶活性测定 一、试验原理 土壤中的磷，很大部分以有机磷化合物的形式存在。磷酸酶能促进有机磷化合物的水解。实验表明，土壤微生物对于土壤含磷有机物质的矿化起着主要作用；土壤的磷酸酶活性，在很大程度上取决于土壤的腐殖质含量，活性磷量，能矿化有机磷化合物的微生物数量，植物类型等因素，土壤的磷酸酶活性可以表征土壤的肥力状况。 二、实验仪器 恒温箱、分光光度计、 三、实验药品 甲苯、苯磷酸二钠、酚、醋酸缓冲液、硼酸缓冲液、铁氰化钾、4-氨基安替吡啉、 四、实验步骤 取5克过20目筛的风干土样于50毫升容量瓶中，用(16滴)毫升甲苯处理，15分钟后，加入5毫升苯磷酸二钠溶液（6.75克苯磷酸二钠溶于水，并稀释至1升）和5毫升相应的缓冲液（碱性磷酸酶用pH10的硼酸缓冲液，中性磷
显微镜直接计数法
血球计数板计数法 利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。此法的优点是直观、快速。将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的（0.1㎜3），所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。 血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。 计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，共400小格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格，总共也是400小格。所以无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的。 每一个大方格边长为1㎜，则每一大方格的面积为1㎜2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1㎜，所以计数室的容积为0.1㎜3。其计算方法如下： 1．16×25的计数板计算公式 细胞数/ml=(100小格内的细胞数/100)×400×1000×稀释倍数 2．25×16的计数板计算公式 细胞数/ml=(80小格内的细胞数/80)×400×1000×稀释倍数 器材酵母菌悬液，血球计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管等。 操作步骤 1．稀释：将酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。 2．镜检计数室：在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗后才能进行计数。 3．加样品：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），使菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。静置5—10分钟即可计数。 4．显微镜计数：将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有5—10个菌体为宜。若选用25×16规格的计数板则每个计数室选5个中方格，可选4个角和中央的中格（即80个小格），若选用16×25规格的计数板，则数四个角：左上、右上、左下、右下的四个中方格，（即100小格）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。 5．清洗血球计数板：使用完毕后，将血球计数板在水笼头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其化沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。 实验报告 将结果记录于下表中。A表示五个中方格中的总菌数；B表示菌液稀释倍数。
土壤微生物分离纯化及测数.
土壤微生物分离纯化及测数 作者：土壤微生物|分离纯化及测数来源：生物秀时间：2008-5-28 一、实验目的要求 1 了解土壤微生物的分离纯化及测数的基本原理。 2 学习并掌握微生物分离纯化技术方法。 3 学习并掌握微生物平板菌落计数的技术方法。 二、基本原理 土壤是微生物生活的大本营，其中含有大量不同类型的微生物，可按照一定的方法将各类微生物通过分离进行纯培养，并能对特定类群进行数量测定。基本原理是通过稀释使菌体细胞充分分散，单细胞得以生长发育形成菌落，可使用稀释法或平板划线法进一步纯化，还可通过平板菌落计数，推算单位重量土壤样品含有微生物的数量。 三、实验步骤 （一）土壤样品采集 在待测田块上，若田块面积小于50平方米则按对角线三点采样，若田块面积大于50平方米按对角线五点采样。采样一般定点于耕作层0--20cm，先除去表土1--2cm，以无菌铲采土足量充分混匀后用无菌塑料袋分装。 （二）好气性细菌的分离纯化及测数 1.制备土样稀释液 吹吸三次混匀 无菌操作 另留一管不稀释留作对照（CK） 2.培养基的准备
融化牛肉膏蛋白胨培养基，融化后保温在48℃。并取6个无菌培养皿，分别在皿底贴好标签，注明10-5、10-6、CK（每个稀释度要两个平行皿，对照要两个平行皿）。 3.倾注法接种 先按10-6，10-5的顺序将不同稀释度菌悬液接入对应平皿中（每个平皿接入1ml），再向每个平皿倾注约15 ml的牛肉膏蛋白胨培养基（48℃）待冷凝，混合均匀。 4.保温培养 将已经接种的平皿静置10min后，放入温箱倒置培养3--5日（30℃），观察结果。
5.分区划线法纯化 平板划线分离，其划线方法有以下两种：