构建重组质粒基本方法解析

构建重组质粒基本方法

1. cDNA编码区片段的PCR扩增

50ul ×2

模版 1

5‘引物 1

3‘引物 1

dNTP 1

10×buffer 5

Taq 1

Milliq H2O 40

2．PCR产物纯化

1、加5倍体积的PB

2、将Spin柱放于2ml收集管上

3、加样液，14Krpm，离心1min

4、弃去排出液

5、加0.75ml PE, 14Krpm，离心1min

6、弃去排出液,14Krpm,离心1min

7、将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中

8、往Spin柱的膜中央加入50μl的EB(或milliq H2O,静置2min, 14Krpm，离

心1min

3．双酶切

载体和PCR产物分别用一下条件进行双酶切（反应体系均为30ul，37℃，酶切n 小时）：

载体10ul PCR产物20ul

10x buffer3ul10x buffer3ul

100xBSA0.3ul100xBSA0.3ul

酶11ul酶11ul

酶21ul酶21ul

MilliQ H2O14.7ul MilliQ H2O 4.7ul

4．双酶切后的载体用试剂盒割胶回收

1. 割胶并称重，加3倍体积的QG（胶块每100mg约合100μl的体积）

2. 50℃，恒温10min，等到胶完全被溶解

3. 将一个Spin柱放在一个2ml的收集管中

4. 加样液，14Krpm，离心1min

5. 弃去排出液

6. 加0.75ml PE, 14Krpm，离心1min

7. 弃去排出液,14Krpm,离心1min

8. 将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中

9. 往Spin柱的膜中央加入50μl的EB(或milliq H2O,静置2min, 14Krpm，离心

1min

5．连接

上述双酶切产物经过纯化（其中载体酶切产物割胶回收，PCR片段酶切后纯化步骤与上述PCR产物纯化步骤相同），在T4 DNA连接酶作用下16℃连接过夜。连接体系如下：

载体 2ul

PCR 片段 6ul

10xT4 buffer 1ul

T4 DNA ligase 1ul

6．转化

取上述连接液5μl转化到预先制备的DH5α化学感受态细胞中，冰浴30分钟，42℃热激2min,置冰上5min，加入1mlLB培养液37℃摇床45min，离心5000rpm，1-5min（不要离心太久，以免太实），最后均匀涂布在含有100 ng/ml 抗生素的LB平板上（100-150 ul）。将平板在37℃倒置培养过夜。挑取阳性克隆菌落转划到另一块含有100 ng/ml抗生素的LB平板上，并对之进行编号，37℃倒置培养过夜。

7．菌落原位PCR

挑取转划后长出的阳性克隆菌落，加入3ul细菌DNA提取液破细胞。将细菌裂解液作为PCR模板，其他PCR组分及PCR条件同上。PCR产物在2%凝胶上进行电泳分析。

8. QIAGEN试剂盒抽提质粒

1 用1.5ml管离心收集细菌，两次，共3ml左右。

2 加入250ul的预冷的P1，打匀后在震荡仪上高速震荡1min。

3 加入250ul P2，温和颠倒数次混匀。

4 （在5min内）加入冰上预冷的溶液 N3 350ul，迅速温和颠倒混匀，至出现

分散的絮状沉淀。

5 冰上静置2min后离心，13，000rpm，10min。

6 小心吸取上清于蓝色的spin柱中（勿吸到沉淀）

7 离心13，000rpm，1min，弃流出液

8 加入750ul PE，离心13，000rpm，1min，弃流出液

9 再离心一次，离心13，000rpm，1min，弃流出液。以让管内彻底干燥。

10 将spin柱拿出，置于一干净的1.5ml管中，小心的在spin柱中央加入30ul

MilliQ H2O，或者Elution Buffer，室温静置2min。

11 离心13，000rpm，1min，收集质粒，测浓度，电泳检测。

流程图的各个图标详解

流程图的各个图标详解 1、各司其职的形状在我的流程图中，适用于不同目的和功能的形状都有各自确定的规范。到目前为止，我一共定义了以下一些形状：（1）开始和结束作为整张流程图的头和尾，必须标清楚到底具体指哪个页面，以免日后出现歧义。（2）网页如你所见，网页的形状是一个带有漂亮的淡蓝色过渡效果的长方形，它的边框为深蓝色，中间写明了这个网页的用途，括号中的数字代表这个形状所对应的demo文件的名称（比如这里是2.html），我有时会把流程图输出为网页的形式，并把每个网页形状和它所对应的demo文件链接起来，这样查看起来非常方便。对OmniGraffle来说这是小菜一碟，如果你被迫用Visio，嗯…… 另外，所有从形状出来的线条，都具有和此形状边框一样的颜色。这样的做法不仅看起来漂亮，在复杂的流程图中还能轻易地标明各形状的关系。我没有见过类似的做法，所以这是由我首创也说不定，呵。（3）后台判断

很常见的一个形状。我在用法上有一点和其他人的不同在于，我几乎总是让…是?的分支往下流动，让…否?的分支向右流动。因为流程图一般都是从上向下、从左到右绘制的，遵循上述规则一方面可以让绘制者不用为选择方向操心，另一方面也方便了读者阅读。（4）表单错误页既然有表单，当然会有错误信息。其实这个信息很重要，用户出错时惶恐不安，就靠着错误提示来解决问题了。你不在流程图里说什么时候显示错误页、不在demo里提供错误页，有些程序员会直接在网页上写个“错误，请检查”，所以UI设计师一定要对这个东西重视起来。但一般来说也没必要把每种错误都在流程图中表示出来，因为含有两个文本框的表单就有三种出错情况了，多了就更不用说了。所以我都是把错误页变为表单的附属页，比如表单页的编号为2，那么此表单错误页的编号就从2.1开始排下去，每种错误放到一个附属页中，这样程序员在拿到demo时也能搞清楚什么意思。结合网页和表单的形状，一个表单验证的流程图就是这样的：

重组质粒的构建经验 [技巧]

重组质粒的构建经验 [技巧] 重组质粒的构建经验~~~ 昨天我在版中我看很多谷友询问重组质粒的构建问题，有些谷友说构建质粒需要一个月，甚至更长时间，这让我联想我刚做分子生物学时候的曲折。重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的。在国内先进的实验中，也大都是由实验员搞定。但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。在这里将我的心得分享于大家，这也是我本人几年来一线工作时的经验积累，以期能为谷友提供借鉴，让大家在实验中少走弯路。所涉及内容如下: 1) 克隆基因的酶切位点问题 2) 载体酶切的问题 3) 连接片段浓度比的问题在阐明上述问题同时，本人尽可能举些实验中的问题案例予以说明。一、克隆基因的酶切位点问题 1、克隆位点选择的问题。首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。这是常识，不赘述。 2、保护碱基数目的问题。在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。这种忽视碰可能会大大影响后续的实验进展。一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行;而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA片段上。如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数，相信下列将有助于大这家的实验设计。 NcoI 4 NdeI 6 NheI 3 NotI 8 PmeI 6 SacI 3 SalI 3 SmaI 3 HindIII 3 BstI 8 SphI 4

重组质粒的构建与转化

实验目的 1. 学习在实现DNA 体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能用限制性核酸内切酶对载体和目的DNA 进行切割，产生利于连接的合适末端。 2. 学习设计构建重组DNA 分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA 酶切的操作。 3. 学习利用T4 DNA 连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA 片段连接起来，构建体外DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。 4. 掌握利用Cacl 2制备感受态细胞的方法。 5. 学习掌握热击法转化 E.coli 的原理和方法。 6. 学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。 7. 学习并掌握使用Omaga 试剂盒抽提质粒的方法及进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA 片段。实验原理：（一）限制性核酸内切酶的酶切反应体外构建重组DNA 分子，首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能在目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源供体DNA 时不能得到完整的目的基因。其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA 片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA 片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA 串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。单酶

切法简单易行，但是后期筛选工作比较复杂。各种限制性内切酶都有其最佳反应条件，最主要的因素是反应温度和缓冲液的组成。在双酶切体系中，如果两种酶对盐离子的浓度和温度要求一致，原则上可以将这两种酶同时加入一个反应体系中同步酶切；如果不一致，则酶切反应最好分步进行，常用的酶切顺序是：先低盐后高盐，先低温后高温。酶切与连接是两个密切相关的步骤，要达到高效率的连接，必须酶切完全，酶切的DNA 数量要适当。另外，酶切反应的规模也取决于需要酶切的DNA 的量，以及相应的所需酶的量。一般的，酶切0.2~1.0 μg的DNA 分子时，反应体积约为15~20 μg，DNA 的量越大，反应体积可按比例适当放大。酶的用量参照标准：一个标准单位酶能在指定的缓冲液系统和温度下，1h 完全酶解1μg 的pBR322 DNA 分子。如果酶活力低，可以适当增加酶的用量，但是最高不能超过反应总体积的10% 。因为限制性核酸内切酶一般是保存在50% 甘油的缓冲液中，如果酶切反应体系中甘油的含量超过5% ，就会抑制酶的活性。（二）载体与外源DNA 的连接反应连接反应总是紧跟酶切反应，外源DNA 片段与载体分子连接的方法即DNA 分子体外重组技术主要依赖限制性核酸内切酶和DNA 连接酶催化完成的。DNA 连接酶催化两双链DNA 片段相邻的5’-磷酸和3’-OH 间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA 连接酶是来自T4 噬菌体的T4 DNA 连接酶，它可以连接黏性末端和平末端。连接反应时，载体DNA 和外源DNA 的摩尔数之比控制在1:（1~3 ）之间，可以有效地解决DNA 多拷贝插入的现象。实际操作中，反应温度介于酶作用速率和末端结合速率之间，一般是16℃，平末端适当提高连接反应温度。反应时间与温度有关，随温度的提高，反应速度增加，所需时间会相应减少，16℃下最常用的连接时间为12-16h 。（三）感受态细胞的制备及质粒转化

企业合并重组一般程序是什么.doc

公司合并重组一般程序是什么被合并企业进行清产核资，清理，搞好产权界定；就合并的有关事宜，通过召开职代会征求双方企业职工的意见；合并协议修改完成后，由企业双方法定代表人签署合并协议；按照合并协议和审批文件等实施合并，办理资产划转工商登记税务登记等有关手续。公司不管是进行合并还是重组，其最终目的都是为了让公司更好的发展下去。而在我国公司进行合并重组是有严格程序要求的。那么具体的程序是怎样的呢？我们一起在下文中进行了解吧。企业合并重组的一般程序： 1、被合并企业进行清产核资，清理，搞好产权界定; 2、合并双方共同提出可行性报告，征求被合并企业债权银行意见并征得主要同意。股份制公司必须通过董事会或股东会形成决议; 3、就合并的有关事宜，通过召开职代会征求双方企业职工的意见;

4、合并双方就合并的形式和资产债权担保的处置办法及职工的安置方案等合并基本内容进行协商，达成合并意向性协议; 5、需要企业所在地地方政府提供优惠政策的，应由地方政府提出审查意见; 6、同级人民政府或授权能代表合并企业双方出资者的机构部门对合并作出决定; 7、对涉及特殊行业的合并，对大中型国有和国有控股企业的合并以及省属企业的合并，应分别由地方政府省属企业的主管部门报省经贸委会同银行财政劳动等有关部门提出审核意见后，报省政府审批;涉及上市公司的合并重组还应征求证券监管机构的意见;其他国有小型及国有控股小型企业合并重组的审批由各市(地州)人民政府行政公署或授权部门审批; 8、合并协议修改完成后，由企业双方法定代表人签署合并协议; 9、按照合并协议和审批文件等实施合并，办理资产划转工商登记税务登记等有关手续; 10、由合并双方的出资者和政府有关部门进行验收，经各方认可后完成合并。在看完上文的内容后，相信大家已经知道，公司进行合并重组是要经过严格审批的，因为公司进行这些活动是关系到多数人

流程图基本形状解析

流程图里的形状符号的代表意义

VISIO里的基本流程图形状 Axure里的流程图形状组件面板对于画流程图，是我们经常会遇到的问题。我们和程序工程师沟通，用再多的口水，也无法挑明的事情，画一张简明的流程图，就能很直白的说明关键问题。有时候你可能会懊恼，因为程序员的思维犹如计算机，你告诉他为什么没有用，你就告诉他该怎么做，是左是右，是0是1就好了。这个时候，产品经理需要的是理性思维，清晰的思路，如果你不清晰，工程师大多数会跟着你的思路乱做一团。所以多画几个流程，多根据页面需求画清晰的流程，就能解决实际的问题。话不多说，本章主要介绍流程图里面的工具，因为图形其实很好介绍，简单的英文翻译就好了，所以也顺带说说这些图形在流程里的作用。方式还和以前一样，编号，对号入座，咱们来一个萝卜，一个坑： 1、矩形作用：一般用作要执行的处理（process），在程序流程图中做执行框。在axure中如果是画页面框架图，那么也可以指代一个页面。有时候我们会把页面和执行命令放在同一个流程中做说明，这个时候将两类不同的矩形做色彩区别，然后做说明就好了。 2、圆角矩形或者扁圆作用：表示程序的开始或者结束，在程序流程图中用作为起始框或者结束框。 3、斜角矩形作用：斜角矩形平时几乎不使用，可以视情况自行定义。或者在其他的流程图中，有特殊含义，暂不知晓，也希望有识之士指点一二。 4、菱形作用：表示决策或判断（例如：If...Then...Else）,在程序流程图中，用作判别框。 5、文件作用：表达为一个文件，可以是生成的文件，或者是调用的文件。如何定义，需要自己根据实际情况做解释。 6、括弧

构建重组质粒基本方法

构建重组质粒基本方法 1.cDNA编码区片段的PCR扩增 50ul ×2 模版 1 5‘引物 1 3‘引物 1 dNTP 1 10×buffer 5 Taq 1 Milliq H2O 40 2．PCR产物纯化 1、加5倍体积的PB 2、将Spin柱放于2ml收集管上 3、加样液，14Krpm，离心1min 4、弃去排出液 5、加0.75ml PE, 14Krpm，离心1min 6、弃去排出液,14Krpm,离心1min 7、将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中 8、往Spin柱的膜中央加入50μl的EB(或milliq H2O),静置2min, 14Krpm，离心1min 3．双酶切载体和PCR产物分别用一下条件进行双酶切（反应体系均为30ul，37℃，酶切n 小时）： 4．双酶切后的载体用试剂盒割胶回收 1.割胶并称重，加3倍体积的QG（胶块每100mg约合100μl的体积）

2.50℃，恒温10min，等到胶完全被溶解 3.将一个Spin柱放在一个2ml的收集管中 4.加样液，14Krpm，离心1min 5.弃去排出液 6.加0.75ml PE, 14Krpm，离心1min 7.弃去排出液,14Krpm,离心1min 8.将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中 9.往Spin柱的膜中央加入50μl的EB(或milliq H2O),静置2min, 14Krpm，离心1min 5．连接上述双酶切产物经过纯化（其中载体酶切产物割胶回收，PCR片段酶切后纯化步骤与上述PCR产物纯化步骤相同），在T4 DNA连接酶作用下16℃连接过夜。连接体系如下：载体 2ul PCR 片段 6ul 10xT4 buffer 1ul T4 DNA ligase 1ul 6．转化取上述连接液5μl转化到预先制备的DH5α化学感受态细胞中，冰浴30分钟，42℃热激2min,置冰上5min，加入1mlLB培养液37℃摇床45min，离心5000rpm，1-5min（不要离心太久，以免太实），最后均匀涂布在含有100 ng/ml 抗生素的LB平板上（100-150 ul）。将平板在37℃倒置培养过夜。挑取阳性克隆菌落转划到另一块含有100 ng/ml抗生素的LB平板上，并对之进行编号，37℃倒置培养过夜。 7．菌落原位PCR 挑取转划后长出的阳性克隆菌落，加入3ul细菌DNA提取液破细胞。将细菌裂解液作为PCR模板，其他PCR组分及PCR条件同上。PCR产物在2% 凝胶上进行电泳分析。 8. QIAGEN试剂盒抽提质粒

公司重组模式流程

企业重组一般有业务重组、资产重组、债务重组、股权重组、人员重组、管理体制重组等模式. (2)资产重组：是指对重组企业一定范围内的资产进行分析整合和优化组合的活动.它是企业重组的核心. (3)债务重组：即负债重组，是指企业的负债通过债务人负债责任转移和负债转变为股权等方式进行重组的行为 (4)股权重组：是指对企业股权进行调整的行为.它与其他重组相互关联,甚至同步进行,比如债务重组时债转股. (5)人员重组,是指通过减员增效,优化劳动组合,提高劳动生产效率的行为. (6)管理体制重组,是指修订管理制度,完善企业管理体制,以适应现代企业制度要求的行为. 企业重组实施思路分析企业的内外部环境公司产业重组设计公司组织重组设计 [编辑本段] 企业重组流程（BRP）（一）主要重组流程范围功能内流程重组：即对职能内部的流程进行重组。在旧体制下，各职能部门机构重叠、中间层次多，而这些中间管理层一般只执行一些非增值性的统计、汇总、填表等工作，ERP系统完全可以取而代之。BPR就是要取消中间管理层，使每项职能从头至尾只有一个职能机构来管理，做到机构不重叠、业务不重复。功能间的BPR：在企业范围内打破部门的界限，进行跨越多个职能部门边界的业务流程重组，实行流程团队管理。流程团队将各部门人员组合在一起，使许多工作可平行处理，从而能大幅度缩短工作周期。这种组织结构灵活机动，适应性强。企业间的BPR：是指发生在2个以上企业之间的业务重组实现了对整个供销链的有效管理，缩短了生产周期、定货周期和销售周期，简化了工作流程，减少了非增殖成本。这类BPR是目前业务流程重组的最高层次，也是重组的最终目标。（二）企业重组流程的三个阶段（1）首先是项目的初始阶段。这时应明确项目的内涵及意义，并组成项目团队。将需要改进的流程与企业的经营结果如提高利润率、降低成本等直接联系起来，使企业认识到改进流程的意义。明确流程的起点与终点，以及改造完后应达成的目标，即

重组质粒的构建

重组质粒构建生物学——屠仁军(新浪) 一、载体与外源片段（PCR产物）的双酶切为了保证做连接反应时有足够的外源DNA片段，应该加入1ug的DNA进行酶切反应；两种酶分别加1ul，10×buffer 2ul，1ug的DNA，加水至20ul。（因此要跑胶分析DNA以及载体的浓度，取1-2ul，电泳检测其含量。1ul体积太少，可以将其稀释在9ul水中，再加loading buffer。6ul 15000bp的marker，2500bp条带的亮度约是100ng DNA。可对比marker的亮度算出酶切回收的DNA的浓度，以便于确定连接反应时的用量。Image J软件可以做灰度分析。）双酶切反应结束后，使用PCR cleanup试剂盒回收DNA与载体。回收完之后用同样的方法分析其浓度。（也可以用分光光度计直接测量DNA的浓度，但是，一般酶切反应之后其浓度会比较小，取1ul 稀释100倍之后浓度很低，可能已经低于仪器的测量范围，而电泳灵敏度很高，还可一排除杂带、RNA、蛋白质等对浓度的干扰。）二、连接反应载体100ng，DNA片段根据大小，1ul buffer，1ul T4连接酶，加水至10ul；16℃连接12-16h。载体（约0.03pmol）与外源DNA的摩尔比大约1：3-1：10之间，根据载体与DNA片段的长度，可算出需要的量。因为载体的大小一般在5kb-10kb，因此，严格的算出0.03pmol的载体的质量意义不大，大约100ng即可。如果时间比较紧张，可以25℃连接15min，之后可取5ul进行转化，剩余5ul于16℃继续连接。三、质粒转化到感受态大肠杆菌中从-70℃中取出感受态，指尖轻转融化后立即插入冰上，5ul连接产物+100ul感受态大肠杆菌，充分混匀后冰浴30min，然后42°热激90s，热激时不要晃动EP管。然后立即插入冰上，静置2min。（连接产物的量尽量不超过感受态体积的5%，否则会降低转化效率，从而得不偿失。）在超净台中向EP管中加入700ul 无抗性LB培养

企业并购重组方式及流程

企业并购重组方式及流程(本文为word格式，下载后可直接编辑)

目录企业并购重组方式选择 (3) 企业并购路径 (3) 企业并购交易模式 (4) 并购流程 (6) 一、确定并购战略 (6) 二、获取潜在标的企业信息 (7) 三、建立内部并购团队并寻找财务顾问 (8) 四、建立系统化的筛选体系 (9) 五、目标企业的初步调查 (13) 六、签订保密协议 (13) 七、尽职调查 (19) 八、价格形成与对赌协议 (22) 九、支付手段 (22) 十、支付节点安排 (25)

重组质粒的构建与转化

实验目的 1.学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能用限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。 2.学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。 3.学习利用T4 DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。 4.掌握利用Cacl2制备感受态细胞的方法。 5.学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。 6.学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。 7.学习并掌握使用Omaga试剂盒抽提质粒的方法及进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA片段。实验原理：（一）限制性核酸内切酶的酶切反应体外构建重组DNA分子，首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能在目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源供体DNA时不能得到完整的目的基因。其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA 片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。单酶

切法简单易行，但是后期筛选工作比较复杂。各种限制性内切酶都有其最佳反应条件，最主要的因素是反应温度和缓冲液的组成。在双酶切体系中，如果两种酶对盐离子的浓度和温度要求一致，原则上可以将这两种酶同时加入一个反应体系中同步酶切；如果不一致，则酶切反应最好分步进行，常用的酶切顺序是：先低盐后高盐，先低温后高温。酶切与连接是两个密切相关的步骤，要达到高效率的连接，必须酶切完全，酶切的DNA数量要适当。另外，酶切反应的规模也取决于需要酶切的DNA的量，以及相应的所需酶的量。一般的，酶切0.2~1.0μg的DNA分子时，反应体积约为15~20μg，DNA的量越大，反应体积可按比例适当放大。酶的用量参照标准：一个标准单位酶能在指定的缓冲液系统和温度下，1h完全酶解1μg的pBR322 DNA分子。如果酶活力低，可以适当增加酶的用量，但是最高不能超过反应总体积的10%。因为限制性核酸内切酶一般是保存在50%甘油的缓冲液中，如果酶切反应体系中甘油的含量超过5%，就会抑制酶的活性。（二）载体与外源DNA的连接反应连接反应总是紧跟酶切反应，外源DNA片段与载体分子连接的方法即DNA分子体外重组技术主要依赖限制性核酸内切酶和DNA连接酶催化完成的。DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-OH间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自T4噬菌体的T4 DNA连接酶，它可以连接黏性末端和平末端。连接反应时，载体DNA和外源DNA的摩尔数之比控制在1:（1~3）之间，可以有效地解决DNA多拷贝插入的现象。实际操作中，反应温度介于酶作用速率和末端结合速率之间，一般是16℃，平末端适当提高连接反应温度。反应时间与温度有关，随温度的提高，反应速度增加，所需时间会相应减少，16℃下最常用的连接时间为12-16h。（三）感受态细胞的制备及质粒转化

企业并购重组方式及流程

目录企业并购重组方式选择 (2) 企业并购路径 (2) 企业并购交易模式 (2) 并购流程 (3) 一、确定并购战略 (3) 二、获取潜在标的企业信息.........................................错误!未定义书签。三、建立内部并购团队并寻找财务顾问.....................错误!未定义书签。四、建立系统化的筛选体系.........................................错误!未定义书签。五、目标企业的初步调查.............................................错误!未定义书签。六、签订保密协议 (6) 七、尽职调查 (6) 八、价格形成与对赌协议 (8) 九、支付手段 (10) 十、支付节点安排 (11)

企业并购重组方式选择企业并购路径企业并购的路径解决如何与交易对手达成并购意向，也就是交易借助的渠道或者程序。主要分为四种途径。一、协议并购：是指并购方与目标企业或者目标企业的各股东以友好协商的方式确立交易条件，并达成并购协议，最终完成对目标企业的并购。根据目标企业的不同又可以分为上市公司的协议并购和非上市公司的协议并购，二者无实质不同，只是上市公司的协议并购还需遵循《上市公司并购管理办法》（证监会令第35号）等特别规定。二、要约收购：是指并购方通过向目标公司的股东发出购买所持有公司股份的书面意见，并按照公告的并购要约中的并购条件、价格、期限以及其他事项，并购目标公司的股份。要约收购和协议收购的核心区别在于所有股东平等获取信息，自主做出选择。更具有公开性和公平性，有利于保护小股东的利益，实践中一般为上市公司的并购采用。三、竞价收购：目标企业通过发布出售公告的形式，邀请具有一定实力的潜在购买方，通过递交密标的方式进行公开竞价，价优者获得并购资格。竞价并购是被并购企业主导的并购模式，根据招标形式不同，可以分为公开招标、拍卖、竞争性谈判、议标等形式。一般用于国有企业的并购。为股权并购提供了一个竞争的环境，有利于股东利益最大化。四、财务重组并购：是指对陷入财务危机，但仍有转机和重建价值的企业，根据一定程序进行重新整顿，使公司得以复苏和维持的处置方法。财务重组式并购主要有三种类型（一）承担债务式：在被并购企业资不抵债或者资产和债务相当的时候，并购方以承担被并购方全部债务或者部分债务为条件，获得被并购方的控制权。（二）资产置换式：并购方将优质资产置换到被并购企业中，同时把被并购企业原有的不良资产连带负债剥离，依据资产置换双方的资产评估值等情况进行置换，以达到对被并购企业的控制权与经营管理权。具体在实践操作中又分为先并购后置换和先债务重组后置换（三）托管式并购：是指通过契约形式，将法人财产经营管理权限、权益和风险转让给受托者，受托者以适当名义有偿经营。采取托管方式进行并购主要是因为目标企业的经营现状不具备实施企业并购的条件，需要采取先托管后并购的操作方式。企业并购交易模式交易模式主要解决企业并购的对象问题。如果选择目标企业的资产作为交易对象，就是资产并购；如果选择目标企业的股权作为交易对象就是股权并购；如果选择目标企业的股权和资产并且以消灭目标企业主体资格为目的，就是合并。（一）资产收购：资产收购的客体是目标企业的核心资产。对于资产的要求：

构建质粒经验

重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的。在国内先进的实验中，也大都是由实验员搞定。所以其中其中还是有基本的技巧需要掌握。在这里决定将我的心得分享于大家，以期能提供借鉴，让大家在实验中少走弯路。在本帖及之后继帖中将以一段PCR获得基因，以NdeI和HindIII位点克隆进入质粒为例来系统剖析重组质粒的构建中基本策略与技巧。这作的经验积累与心得。所涉及内容如下： 1) 克隆基因的酶切位点问题 2) 载体酶切的问题 3) 连接片段浓度比的问题以上阐明上述问题同时，本人尽可能引入实验时会各种出现的问题予以说明。一、克隆基因的酶切位点问题 1 对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。这是常识不赘述。这里对NdeI和HindIII 为例。 2 设计PCR引物时的保护碱基数目。这可能是初涉入未引起注意与重视问题。NdeI需加入6个以上的保护碱基，而HindIII则要三个就可以。一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；而有一类，只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA 片段上。如NdeI就属这类。下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数： NcoI 4 NdeI 6 NheI 3 NotI 8 PmeI 6 SacI 3 SalI 3 SmaI 3 HindIII 3 BstI 8 SphI 4 XhoI 3 XbaI 3 SmaI 4

案例分析：本人最初用NdeI酶，未注意到该问题，只与普通酶一样引入两个保护碱基，一个月内没有进展。后查文献得知症结所在，加下六个后，迎刃而解。大家引以为戒啊。现在普通酶我都引入三个保护碱基，现在合成价格不贵，为保证酶切充分，连接顺利，不用节约那点钱，再说若一次不成功，重要实验花费时间与金钱更多，孰利孰弊，不言自明。呵呵。二、载体酶切的问题 1单切鉴定。这个问题实是简单，但我认为很有着重强调之必要。现在大家手头的质粒都是转来转去的，其中的各酶切位点状况如何，是否能被有效地切开，在实验开始之前对质粒载体很有作单切鉴定之必要。现在我每次构建之前，对所要用的酶切位点都作一一鉴定，比如要用到NdeI和HindIII，我就先对质粒该两个酶进行鉴定。有效地切开后，再将引物发出合成；若不能，就按“一”中原则进行调换。 2 质粒双切后对照连接。实验中这是连接步骤，但实质还是质粒酶切问题。一般情况下，都在通用缓冲液中进行双酶切，但两种酶在通用缓冲液中中酶切效率不一样，可能导致部分只是单切缺口的质粒片段存在，这样，连接的对照实验在不加入外源片段时，质粒就会自连，长出菌斑，这种情况下，质粒酶切片段是不可能用于下一步真正连接实验。案例分析：本人曾用XhoI和HindIII酶切位点构建重组质粒，对质粒进行双酶切后，直接就做连接，未上述两步鉴定，每次结果满板的菌斑。但就是没有阳性。后来对质粒进行单酶要鉴定后，发现XhoI酶切位点损坏。又是一个月没有进展，浪费精力和药品。血的教训啊。因为当时没有注意到：单切质粒是一条带，双切质粒也是一条带，电泳行为上是一样的，分辨不出。如果做上述任何一个鉴定就会知道问题出在那儿，呵呵。案例分析：本实验室一个号称实验严谨的大博士，有KpnI和HindIII构建重组质粒，一个月未果，只得阴性斑，不得阳性斑，后怀疑KpnI酶失效。迁怒KpnI,在我不知情下扔掉实验室所满管KpnI酶。我得知后，问他做过上述两鉴定实验后，他支吾着说没有，反而责备本人不早说出问题原因所在。呵呵，他不自责自己只是闷头做实验，不早问，反倒咬一口解铃人。呵呵，你说冤不冤？版主你的类似的冤可能更多吧，辛苦了! 两星期前写了前两问题后，终于能抽时间写第三个问题，在做好前述两个方面工作后，这个问题相对简单。三、连接时两片段浓度比问题一般实验指导手册上都说质粒：片段＝1：3（摩尔比），在实际操作中我以为在1：5甚至1：10为宜。做好“一、二”，16℃10小时后，每次都能有效地连接上。当然还有感觉态问题，我们以前自己做，现在懒得做了，都用“天为时代公司”的产品，还不错（注明我不是天为公司内线，呵呵）。

重组质粒的构建.

重组质粒的构建实验流程—质粒构建基因提取—1、2、3 基因提取—1、2、3 PCR反应扩增目的基因—4、3 PCR反应扩增目的基因—4、3 DNA片段回收—5、3 DNA片段回收—5、3 重组质粒检测：（1）PCR (2)双酶切—8、5 重组质粒检测：（1）PCR (2)双酶切—8、5 测序测序重组质粒提取—2、 3 重组质粒提取—2、 3 菌种保藏—7 菌种保藏—7 目的片段与载体连接及转化—6 目的片段与载体连接及转化—6

实验操作 1、 LB培养基配置 LB培养基用于一般细菌培养，特别用于分子生物学试验中大肠杆菌的保存和培养。其中蛋白胨、酵母膏粉提供氮源、维生素和生长因子，NaCl维持均衡的渗透压，葡萄糖提供碳源，琼脂是培养基的凝固剂。【试剂】胰蛋白胨（Tryptone）、酵母提取物（Yeast Extract）、NaCl、琼脂（Agar）【实验步骤】 1、 LB固体培养基配方（配置100ml培养基）

胰蛋白胨（Tryptone） 1g 酵母提取物（Yeast Extract） 0.5g NaCl 1g 琼脂（Agar） 1.5g 单蒸水 100ml 蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速，另外，称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品、或在称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一种药品，瓶盖也不要盖错。 2、液体培养基除不加琼脂外，其余同固体培养基一样。 3、包扎用报纸封住瓶口，再用皮筋捆扎好，用记号笔注明培养基名称、组别、日期。 4、灭菌将上述培养基以1.05kg/cm2、121.3℃、20min高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入4℃冰箱内暂存。灭菌后，将锥形瓶放入烘箱烘干，烘干后，4℃保存。 5、 LB固体培养基倒板配置：如上述配方配置100ml的LB固体培养基。抗生素的加入：将凝固的培养基放入微波炉内加热至完全融化，然后置于55℃的水浴中，待培养基温度降至55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。倒板：一般10ml倒1个板子，培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10—15min。保存:将培养皿倒置放于4℃保存，一个月内使用。二、质粒的提取（protocol）

关于上市公司重大资产重组操作流程的简要介绍 - 投行部

关于上市公司重大资产重组操作流程的简要介绍 - 投行部关于上市公司重大资产重组操作流程的简要介绍 ——结合万丰奥威重组案例一、基本概念与法规适用 (一)定义上市公司及其控股或控制的公司在日常经营活动之外购买、出售资产或者通过其他方式进行资产交易达到规定的比例，导致上市公司的主营业务、资产、收入发生重大变化的资产交易行为。要点1、日常经营活动之外; 要点2、资产层面的购买与出售，与上市公司股权层面的重组(上市公司收购)不同，但一般情况下资产层面的重组与股权层面的重组结合进行; 要点3、达到一定比例，50%。 (二)标准指标:资产总额、营业收入、资产净额比例:变化达到50%，基准:以上市公司最近一年度、经审计、合并报表为基准。 (三)类型 1、单纯资产重组型 (1)资产出售型;(2)资产购买型;(3)资产置换型(资产购买与出售)。 2、资产重组与发行股份组合型 (1)非公开发行股份购买资产;(2)换股吸收合并;(3)其他组合型。注:发行股份购买资产与换股吸收合并的区别点: , 非公开发行股份购买资产的发行对象不得超过10人，换股吸收合并可

以; , 换股吸收合并需要设计债权人保护和异议股东选择权机制，发行股份购买资产不需要。 (四)发行部与上市部的分工 1 1、所有的单纯资产重组型，都是上市部审核; 2、关于上市公司非公开发行股份的审核，上市部与发行部分工如下: 序号类型审核部门 1 以重大资产认购股份的上市部 2 以重大资产+25%以下现金认购股份的上市部 3 上市公司存续的换股吸收合并上市部 4 上市公司分立上市部 5 非上市公司(含非境内上市公司)存续式换股吸上市部收合并上市公司 6 全部以现金认购股份的(包括募投项目为重大资发行部，但发行对象与资产出售产购买的) 方为同一方或受同一控制除外 7 非重大资产+现金认购股份的发行部 8 非重大资产认购股份上市部和发行部均有审核先例，保代培训强调的是发行部 9 重大资产+25%以上现金认购股份不明确 (五)由上市部审核的部分，需要上重组委的有如下类型: 1、上市公司出售和购买的资产总额均达到70%; 2、上市公司出售全部经营性资产，同时购买其他资产的; 3、上市公司实施合并、分立的; 4、发行股份的; 5、证监会认为的其他情形 (六)上市部内部的审核分工

流程图基本形状解析之欧阳家百创编

流程图里的形状符号的代表意义欧阳家百（2021.03.07）

1、矩形作用：一般用作要执行的处理（process），在程序流程图中做执行框。在axure中如果是画页面框架图，那么也可以指代一个页面。有时候我们会把页面和执行命令放在同一个流程中做说明，这个时候将两类不同的矩形做色彩区别，然后做说明就好了。 2、圆角矩形或者扁圆作用：表示程序的开始或者结束，在程序流程图中用作为起始框或者结束框。 3、斜角矩形作用：斜角矩形平时几乎不使用，可以视情况自行定义。或者在其他的流程图中，有特殊含义，暂不知晓，也希望有识之士指点一二。 4、菱形作用：表示决策或判断（例如：If...Then...Else）,在程序流程图中，用作判别框。 5、文件作用：表达为一个文件，可以是生成的文件，或者是调用的文件。如何定义，需要自己根据实际情况做解释。 6、括弧作用：注释或者说明，也可以做条件叙述。一般流程到一个位置，做一段执行说明，或者特殊行为时，会用到它。 7、半圆形

重组质粒构建(protocol)

重组质粒的构建（beta版）一、引物设计: 1.选择合适的载体。酶切位点及其顺序（酶切位点的顺序一定不能颠倒;注意ATG和stop codon）。 2.在NCBI上再次确认目的片段的碱基序列。 1，使用word 2，设计引物：primer-up Primer-down 3，另设计一对引物扩增CDS区，引物位于CDS区之外，扩增产物包含完整的CDS区。引物长度约20个碱基。 4，核对----送公司合成。 5，对公司合成的引物快速离心，在超净台按照管子上标注的体积加入高压水（dd2H2O），配成100umol/ul(100uM),-20℃保存。使用时按1：3比例稀释成25uM工作浓度。二、PCR（P出目的片段）：（一）、PCR P出目的片段： 2,pcr: cDNA 1ul 10x PFU buffer 2.5ul ℃ 5min dNTP 1ul ℃ 30sec F’-Primer 1ul ℃ 30sec R’-Primer 1ul ℃ X min PFU 0.5ul ℃ 5min dd2H2O 18ul （X是根据片段的长度设定，1000bp/min，退火温度根据Tm值来计算，一般低于Tm值5℃） 3，跑胶、回收: （1），配胶： 0.6g 琼脂糖 60ml 1X TAE 0.6ul (待温度降到50-60℃左右时)

25分钟后，即可点样跑胶。（2），跑胶：130-150V、25-30分钟左右。（3），紫外灯下观察，切胶（要带防护手套和口罩） 4，胶回收（胶回收试剂盒）: 按照试剂盒的protocol来做，在胶回收的最后一步，Elution Buffer预先在55-65℃温箱中水浴，放在37℃温箱中2min。对胶回收的产物跑胶验证。可建立10ul的体系：回收产物5ul、6xloading buffer 2ul、dd2H2O 5ul。三、酶切、链接： 1，目的片段酶切：（酶切时间根据酶的活性,70℃15-20min灭活） insert (胶回收产物) 10ul 10 x buffer 2ul 20ul的体系dd2H2O 6ul EcoRI 1ul HindⅢ1ul 2，载体酶切：（1~2小时） Vector （1ug/ul）：5 ul（总量5ug） 10 x buffer 2ul 20ul的体系dd2H2O 11ul EcoRI 1ul HindⅢ1ul 为方便以后使用，载体可以一次性多切点。 3，酶切时，首先要核对一下酶的buffer，有时双酶切时两个酶不能共用一种buffer，那么就要先切一端，酶切回收后再用另一酶切另一端，然后再酶切产物回收。 4，连接： 10x T4 Ligation Buffer 1ul Vector 1ul 10ul体系insert 3ul（2～3ul） T4 DNA Lignase 1ul dd2H2O 4ul 附：Ligation system DNA片段克隆到质粒载体上载体与插入DNA的摩尔数比例为1:3-10。最佳的摩尔数比例因载体类型的不同而不同，例如cDNA 和基因组DNA克隆载体。可根据以下公式计算插入DNA用量： [实例]: 载体与插入片段的摩尔数比例为1:3，如连接反应中加入100ng 6kb载体，插入片段大小为0.5kb，这时应加入插入片段的量为：

企业并购重组方式及流程

并购方式母公司对子公司持股超过90%的话，直接合并。标准归并：（1）所有资产、负债、权利义务移转。（2）注销法律上的人格（3）目标公司，属于重大交易事项，交易应当得到目标公司股东会的批准。（4）收购公司，情况有所不同，取决于并购交易相对收购公司的重大程度。中国版本，没有规模的概念，大小公司过于平等，没有考虑控制关系，没有区分。如果出现大鱼吃小鱼的情况，就绕过归并。可以先把目标公司掏空，规避是因为我们法律不合理。合并：两家公司将所有的资产转移给新设立的第三家公司，而解散原有的两家公司的情形。不解散或清算原有主体的话，就会变成联营（Joint Venture ）。这种情况很少发生，原因：一个公司业务大了，控制权大了，商誉也会大，商誉就是啮合了这些元素的东西，兼并直线合并归并母子/简易向上向下横向小型合并三角兼并正向三角反向三角组合兼并事实合并

一个企业除了资产没有其他的，就是被合并的对象。在大多数国家法上均规定了下面两种情形可以不需要收购公司股东会的批准，董事会就可以直接作出决定。简易归并（Short Form Merger）包括两类：一种是母公司归并子公司（向上归并），一种是子公司之间的归并。对被并购方，不存在需要股东会批准的情形，对并购方而言，无论这种交易的大小程度，也无需获得股东大会的批准，因为母公司的股东最终控制资产。小型归并大小鱼合并美国、日本、台湾都存在这种制度如果目标公司被收购之后，收购公司增加的资本转换为任何一类股权不超过以前向下归并（Down-Stream Merger）：比较有争议的时子公司收购母公司，是否应当列入简易归并。支持的理由是这并不构成实质性的股东权利和资产对应性的改变，反对的理由则是这种交易是由董事会主导的。简易归并并不需要股东会批准，加上程序较为简单，常常会成为排挤股东（Freeze-out）或者下市的最后一步。公司可以通过系列步骤，先接管获得目标公司的90%以上股权，进而通过简易归并完成联合，这就属于“收尾”归并。归并和合并构成了最基本的公司并购方式，任何复杂的并购方式最后也可以归结为这两种形式。法律对归并和合并的规制，主要是从四个方面入手：（1）程序；（2）股东投票批准；（3）协议及其履行；（4）分配，包括清算的消失主体和存续公司的股东获得股份。纵向合并： 1、中国式法律黑洞如果上市公司是子公司，或者母上市公司合并自己的子公司，就遇到回避的问题。董事需要被回避到，董事会决议提不出来，股东会也要回避，5%以上的股东就会阻挡这次交易的发生。按照标准归并，遇到一系列问题，大公司合并小公司，

重组质粒的构建

重组质粒构建生物学——屠仁军(新浪)一、载体与外源片段（PCR产物）的双酶切为了保证做连接反应时有足够的外源DNA片段，应该加入1ug 的DNA进行酶切反应；两种酶分别加1ul，10×buffer 2ul，1ug的DNA，加水至20ul。（因此要跑胶分析DNA以及载体的浓度，取1-2ul，电泳检测其含量。1ul体积太少，可以将其稀释在9ul水中，再加loading buffer。6ul 15000bp的marker，2500bp条带的亮度约是100ng DNA。可对比marker的亮度算出酶切回收的DNA的浓度，以便于确定连接反应时的用量。Image J软件可以做灰度分析。）双酶切反应结束后，使用PCR cleanup试剂盒回收DNA与载体。回收完之后用同样的方法分析其浓度。（也可以用分光光度计直接测量DNA的浓度，但是，一般酶切反应之后其浓度会比较小，取1ul 稀释100倍之后浓度很低，可能已经低于仪器的测量范围，而电泳灵敏度很高，还可一排除杂带、RNA、蛋白质等对浓度的干扰。）二、连接反应载体100ng，DNA片段根据大小，1ul buffer，1ul T4连接酶，加水至10ul；16℃连接12-16h。载体（约）与外源DNA的摩尔比大约1：3-1：10之间，根据载体与DNA片段的长度，可算出需要的量。因为载体的大小一般在5kb-10kb，因此，严格的算出的载体的质量意义不大，大约100ng即可。如果时间比较紧张，可以25℃连接15min，之后可取5ul进行转化，剩余5ul于16℃继续连接。三、质粒转化到感受态大肠杆菌中从-70℃中取出感受态，指尖轻转融化后立即插入冰上，5ul连接产物+100ul感受态大肠杆菌，充分混匀后冰浴30min，然后42°热激90s，热激时不要晃动EP管。然后立即插入冰上，静置2min。（连接产物的量尽量不超过感受态体积的5%，否则会降低转化效率，从而得不偿失。）在超净台中向EP管中加入700ul 无抗性LB培养基，