Western Blot 实验计划完整版
Western Blot 实验计划完整版
一、SDS-PAGE
1、分离胶的配制
10% 10%
30:0.8丙烯酰胺/双丙烯酰胺 2.67 mL 4.005mL
去离子水 3.33 mL 4.995mL
分离胶缓冲液(4X) 2.00 mL 3.00mL
8.00 mL 12.00mL
10%(w/v)APS(现用现配) 45μL 67.5μL
TEMED 12μL 18μL
2、压缩胶的配制
3%
30:0.8丙烯酰胺/双丙烯酰胺0.75 mL
去离子水 3.00 mL
压缩胶缓冲液(4X) 1.25 mL
5.00 mL
10%(w/v)APS(现用现配) 30μL
TEMED 8μL
先制备蛋白样品，后灌注压缩胶，压缩胶灌注后应在20~40min内使用。
3、蛋白样品的制备
蛋白样品8μL
上样缓冲液(loading buffer/laemmili buffer) 12μL
煮沸5min
冷却至室温
短暂离心
之后可加样，加样孔的深度至少为5~8mm。
拔出梳子后，如加样孔有气泡，可向其中加入适量电泳缓冲液将气泡驱除
从烧水开始，蛋白样品的制备大约需要35min
4、电泳
压缩胶电压：80V（10mA）
分离胶电压：120V（20mA）
当溴酚兰指示剂到达凝胶底部时，即停止电泳。
5、染色
考马斯亮蓝染色液35min，摇床摇动（为获得最大分辨率，5%凝胶染色2小时，10%凝胶染色4小时）
用清水反复漂洗几次
高甲醇脱色液25min，摇床摇动（也可用7%（v/v）冰乙酸）
低甲醇脱色液，摇床摇动
二、Western blot
1、润湿
准备6张Whatman 3#滤纸、一张硝酸纤维素膜，尺寸与凝胶大小相仿，先放入水中3分钟，
放入转膜缓冲液中5分钟。
2、起胶
将凝胶从电泳槽中取出，放入转膜缓冲液中10分钟
3、三明治的制作
按以下顺序放置：3层Whatman 3#滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、3层Whatman 3#滤纸
切记：每层之间用滴管将其中的气泡全部赶出，决不允许气泡存在。
4、海绵的润湿
用转膜缓冲液将海绵润湿
5、转膜
将凝胶面与负极相连，硝酸纤维素膜与正极相连。（100V，1小时）要放于4℃。
1.For transfer of proteins smaller than 20 kDa, transfer proteins from gel to
PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane at 1Amp constant current for 45 mins or equivalent (250mAmp for 3 hours or 500mAmp for 90 minutes) in
transfer buffer (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH).
2.For transfer of proteins smaller than 120 kDa, transfer proteins from gel to
PVDF membrane at 1Amp constant current for 1 hour or equivalent
(250mAmp for 4 hours or 500mAmp for 2 hours) in transfer buffer (25mM
Tris, 190mM glycine, 20% MeOH).
3.For proteins larger than 120kDa, transfer to PVDF membrane at 1Amp
constant current for 90 minutes or equivalent (250mAmp for 6 hours or
500mAmp for 3 hours) in transfer buffer + SDS (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH, 0.05% SDS).
4.For Proteins larger than 250kDa, transfer to PVDF membrane at 1Amp
constant current for 1 hour and 45 minutes or equivalent (500mAmp for 3.5
hours) in transfer buffer + SDS (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH,
0.05% SDS).
Add transfer (or CAPS) buffer to the transfer unit according to manufacturer1s directions. Transfer over night with a setting of 20V / 40 mA or for 3 hours at
70V/160 mA. The transfer process needs to take place under cold temperatures to prevent the gel from sticking to the membrane. This can be accomplished
either by using a water cooling core in the transfer unit or placing the entire
unit at 4 . Please follow the manufacturer1s recommendations
6、清洗
将硝酸纤维素膜放入1X TBST中清洗3次，每次5分钟。摇床摇动。（这步忘了！）
7、封闭
1.Remove the blot from the transfer apparatus or staining tray and immediately
place into blocking buffer (1% BSA, 10mM Tris pH 7.5, 100mM NaCl, 0.1% Tween 20).
2.Incubate the blot for 1 hour at 37℃, 2 hours at room temperature, or overnight
at 4℃.
8、一抗孵育
一抗用TBST1:1000稀释，将硝酸纤维素膜放入其中，37℃孵育1.5小时，(或4℃过夜)摇床摇动。
Probe with primary antibody in TTBS/1% NFDM for 1 hr. at room temperature. Primary antibody should be diluted as specified on product data sheets. If these values are not available, use the following guidelines for initial experiments: apply antisera or ascites at 1:500 to 1:5,000, apply purified primary antibodies at a concentration of 1 ug/ml.
9、清洗
将硝酸纤维素膜放入1X TBST中清洗3次，每次5分钟。
10、二抗孵育
二抗用TBST1:8000稀释，将硝酸纤维素膜放入其中，37℃孵育1小时，摇床摇动。
11、清洗
同13，之后，用1X TBS在清洗2次，每次5分钟，以洗去膜上的Tween 20，因为它可以阻碍底物的沉积。
12、显色
按如下配方配制显色液：
1mL水+1滴（大约50微升）试剂A(之后混匀)+1滴试剂B+1滴试剂C
将硝酸纤维素膜放入其中孵育，一旦显色，立即放入去离子水中终止反应。
Considerations:
?Perhaps the most common problem in western blotting is the occurrence of background staining. The best remedy for high background (in many cases) is simply to dilute the primary antibody further. Other solutions include ensuring that detergent is used in the blocking reagent, using an alternate blocking reagent (casamino acids, BSA, serum), and decreasing the amount of protein applied to the electrophoresis gel.
?Occurrences of extra bands in the blot can be resolved by several strategies.
Run a control blot omitting the primary antibody to determine if the secondary antibody is the source of the problem. Replacing the secondary antibody with
a different lot or a similar reagent from a different source can provide
resolution. Spurious bands below the targeted molecular weight suggest that the protein is being degraded in the experiment; inclusion of protease inhibitors can help.
?No or low signal can be remedied by loading more protein in the gel or increasing the amount of primary and/or secondary antibody applied to the blot.
?Some antibodies will not bind in the presence of detergent; consult the datasheet for each antibody prior to performing any procedure.
本实验所需全部试剂的配方：
SDS-PAGE
一、丙烯酰胺/双丙烯酰胺储液（30:0.8）1000mL
30%(w/v) 丙烯酰胺300g
0.8%(w/v) 双丙烯酰胺8g
加去离子水，至终体积1000mL。经0.22μm膜过滤。存于4℃暗处。
二、分离胶缓冲液（4X）
1.5mol/L Tris-HCL(pH8.0)
0.4%(w/v)SDS
500mL 1000mL
Tris-Base 90.8g 181.7g
10%(w/v) SDS 20mL 40mL
加去离子水，至所需终体积。室温下用HCL调pH至8.0。经0.22μm过滤。存于4℃。
三、压缩胶缓冲液（4X）
0.5mol/L Tris-HCL(pH6.8)
0.4%(w/v)SDS
500mL 1000mL
Tris-Base 30.3g 60.6g
10%(w/v) SDS 20mL 40mL
加去离子水，至所需终体积。室温下用HCL调pH至6.8。经0.22μm过滤。存于4℃。
四、电机缓冲液（4X）
0.1mol/L Tris
0.768mol/L 甘氨酸
4000mL 8000mL
Tris-Base 48.8g 96.9g
甘氨酸 230.6g 461.2g
加去离子水，至所需终体积。不必调pH。此比例时Tris碱-甘氨酸的pH应为8.3。室温下存于大容器中。
五、SDS(10%;w/v)100mL
取10gSDS溶于去离子水中，至终体积100mL。室温下存于洁净瓶中。
六、电泳缓冲液（1X）
1/4体积的4X电泳缓冲液与3/4体积的去离子水混合。然后加1/100体积的10%SDS至终浓度0.1%(w/v)SDS。实例如下：
800mL
电极缓冲液200mL
去离子水592mL
10%(w/v)SDS 8mL
800mL
七、样品缓冲液(2X)储液
0.25mol/LTris-HCL(pH6.8)
4%(w/v)SDS
20%(w/v)甘油
痕量溴酚兰
配制此溶液时，应极小心，戴手套，并避免角蛋白（皮肤上即存在此蛋白）对缓冲液的污染。
100mL
压缩胶缓冲液（4X）50mL
SDS(固体干粉) 4g
甘油20mL
溴酚兰（溶液呈深蓝色）2mg
加去离子水至100mL终体积。此缓冲液可室温下保存或等分冻干保存，但用前必须温热以确保SDS于溶液中。应保证反复使用此溶液的同一储液而不被污染。等分保存将有助于避免这个问题。
八、含2-巯基乙醇的样品缓冲液（1X）
用前配制样品缓冲液的工作液，稀释2X样品缓冲液，加入2-巯基乙醇至终浓度为5%（v/v）。例如：
2X样品缓冲液100μL
去离子水90μL
2-巯基乙醇10μL
200μL
九、过硫酸铵（APS）(10%;w/v)
取3g过硫酸铵，溶于去离子水，至终体积为30mL。此溶液4℃下在短暂的数日内是稳定的，但建议，对每一组新胶均应新鲜配制。
十、考马斯亮蓝染色液（1000mL）
考马斯亮蓝R250 2.5g
甲醇454mL
冰醋酸92mL
去离子水454mL
经Whatman #1滤纸过滤。
十一、高甲醇脱色液
1000mL 2000mL
甲醇454mL 908mL
冰醋酸75mL 150mL
去离子水471mL 942mL
十二、标准（低甲醇）脱色液
1000mL 2000mL
甲醇50mL 100mL
冰醋酸75mL 150mL
去离子水875mL 1750mL
Western Blot
一、膜转移缓冲液（Transfer buffer）
组分浓度：39mM Glycine, 48mM Tris, 0.037%(w/v)SDS, 20%(v/v)甲醇配制量：1L
配制方法：1、称量下列试剂，置于1L烧杯中。
Glycine 2.9g
Tris 5.8g
SDS 0.37g
2、向烧杯中加入约600mL的去离子水，充分搅拌溶解。
3、加去离子水将溶液定容至800mL后，加入200mL的甲醇。
4、室温保存。
二、TBS(5X)
组分浓度：100mM Tris-Base, 0.685M NaCl
配制量：500mL
配制方法：1、称量下列试剂，置于500mL烧杯中。
Tris-Base 0.6075g
NaCl 20.0157g
2、向烧杯中加入约400mL的去离子水，充分搅拌溶解。
3、调节pH至7.6
4、加去离子水将溶液定容至500mL后，4℃保存。
三、TBST(Washing buffer)
100mL 5X TBS
0.25mL Tween 20
Q.S.to 500mL
四、Blocking buffer(1%BSA in TBST)
20mL 5X TBS
1g BSA
Q.S.to 100mL
(完整版)WesternBlot(免疫印迹法)实验方法步骤
Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤 发布日期:2008-8-25 热门指数:4360 Western Blot(免疫印迹法) 主要包括以下4个基本步骤： n 样品制备 n 电泳分离 n 蛋白的膜转移 n 免疫杂交与显色――蛋白检测 溶液和试剂 n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS) n Modified RIPA buffer Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;P MSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mM n 1X SDS 样品缓冲液 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝 n 转移缓冲液 25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3) n 10X Tris缓冲盐(TBS) 准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6 n 脱脂奶粉或BSA n 甲醇 n TBS/T缓冲液 1X TBS, 0.1% Tween-20 n 封闭缓冲液（TBS/T）
1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSA n 一抗的稀释 1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗) Note:一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。 n 预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率 样品制备 原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。 1．培养细胞或药物处理。 2．弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。 3．加入1X SDS样品缓冲液(6-well plate, 100 μl /w或75 cm2plate, 500-1000 μl/瓶)，刮落细胞，转移到Ep管。注意：冰上操作。 4．超声10~15秒剪切DNA以减低样品粘性。 5．煮沸样品5 minutes。 6．离心12000g, 5 min，取上清。 7．电泳分离：上样15μl~20 μl 至SDS-PAGE 胶(10 cm x 10 cm)电泳。 如要定量检测某蛋白的表达水平，应用RIPA裂解液(1 ml per 107cells/100 mm dish/150 cm2flask)裂解细胞，收集裂解液至离心管中，在振荡器上混匀4～15min，14000g离心15min（4℃），弃沉淀，用B radford法或其它蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度以调整上样体积和上样量，进行Western杂交时还需设置内或外参照，通常用beta-actin。 注意：一般上样20~30 μg已足够，如待检蛋白为低丰度蛋白，可加大上样量至100μg，但电泳条带易拖尾，可制备亚细胞组份或采用更敏感的检测方法。 电泳分离（参照SDS-PAGE电泳方法） 转膜 杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于Western blot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜(NC) 和PVDF膜。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被
蛋白印迹——western-blot-实验流程及注意事项
蛋白印迹——Western blot 实验流程及注意事项 各种凝胶电泳方法可以直接了解蛋白的某些性质如迁移率、电荷、大小、丰度以至蛋白的亲疏水性等。此外，特异染色方法可用于识别不同种类的蛋白质。Western blot技术大大扩展了凝胶电泳后识别和鉴定蛋白的可能性。这一技术首先将电泳分离后的蛋白质条带或斑点从凝胶介质转移到固相支持膜上，然后用特异性配体进行检测。特异性抗体和凝集素等已被广泛应用检测印迹膜上的蛋白。印迹技术还常常作为电泳分离后用化学方法（如蛋白氨基端序列分析等）鉴定蛋白的一个重要步骤。 一、聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE或SDS-PAGE） 聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。
PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCL。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCL。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。 实验步骤 1.配制分离胶5ml（配方见图1）； 2.将液体用1ml移液器加入玻璃板（从玻璃板的边缘加入，速度适中，尽量不 要产生气泡）； 3.用去离子水压胶（利用重力作用把胶压平，否则如果有气泡，胶就不平了， 影响电泳效果。注意上面盖一保鲜膜，防止液体挥发）； 4.大约1第二天一早配制堆积胶）， 5.倒掉玻璃板上面的水并用滤纸吸干，加入堆积胶，并插入梳子； 6.约1小时后堆积胶凝固，把玻璃板转移到电泳装置并加紧（防止漏液）； 7.将电泳装置内加入电泳缓冲液并观察是否漏液； 8.拔掉梳子，用微量注射器冲洗上样孔，加入和上样缓冲buffer混合变性的蛋 白；①蛋白上样量：20-50μg；②上样缓冲液：加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×；③上样最大体积：根据梳子孔径和玻璃板的距离而定，一般我们用的上样最大体积在30ul左右；④蛋白变性：上样前要将样品于沸水中煮5-10min 使蛋白变性。可以使用PCR仪进行变性，99℃5分钟，加快速度，这样就不用将水煮沸了，同时在水中煮蛋白样品有下面弊端：a. EP 管容易炸开，样品丢失；b. 容易进水，使样品体积增加，超过电泳最大上样量； 9.在电泳槽中加入电泳缓冲液； 10.恒压80V 30分钟，100V 2小时左右，溴酚蓝跑到底即可（电泳时间可以根 据自己目的蛋白的具体条件设置，一般4～5 h，电压为40V 较好，也可用60V。）；
Western Blot 实验详解
Western Blot实验详解 一、实验材料 Western Blot相关试剂： 2×Sample Buffer：1ml Glycerol（甘油）;0。5ml Beta mercaptoethanol（β-巯基乙醇）; 3ml 10%SDS; 1。25ml 4×Upper buffer; 4。25ml dH2O; Add bromophenol blue （溴酚蓝）to color。4×Upper buffer：60。6g Trizma Base(氨基丁三醇); 20ml 20%SDS; Add dH2O to 1000ml; 用盐酸调pH 至6。8。 10×电泳缓冲液（pH 8。3）：在1L大烧杯中加入800ml去离子水，称取Tris 30。2g、甘氨酸188g，混匀，加入100ml 10%SDS(10g)，定容至1L。（注：SDS在68℃水浴中溶解）。工作液：1×电泳缓冲液去离子水稀释室温保存。 1。5M Tris-HCl(pH8。8)：Tris 181。7g去离子水溶解，用浓盐酸调至pH8。8，定容至1L 室温保存。 1M Tris-HCl(pH6。8)：Tris 121。1g去离子水溶解，用浓盐酸调至pH7。5，定容至1L 室温保存。 10×TS(洗膜液)：在800ml去离子水，加入Nacl 90g，1M Tris-HCl(pH7。5) 100ml，去离子水定容至1L。工作液：1×TS 室温保存。 1M Tris-HCl(pH7。5)：Tris 121。1g去离子水溶解，用浓盐酸调至pH7。5，定容至1L 室温保存。 10%SDS：称取十二烷基磺酸钠（SDS）10g，加入约80ml去离子水，68℃加热溶解。用10%HCl 调pH至7。2，定容至100ml。 1×Transfer Buffer：在1L大烧杯中加入800ml去离子水，加入3。03g Trisgrams，14。43g 甘氨酸，最后加入200ml甲醇。4℃保存。 30%储备胶：丙烯酰胺Acr 29。0g、亚甲双丙烯酰胺（Bis）1。0g，混匀后加入去离子水37℃溶解，定容至100ml。4℃避光保存。 10%AP（过硫酸铵）：称取1gAP，加入10ml去离子水搅拌。分装，-20℃保存。Western Blot相关仪器： 电泳仪；转移仪；摇转仪。 二、实验原理 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 三、操作程序与结果判定
western-blot实验方法
western-blot实验方法 1、试剂耗材的准备： （1）转膜缓冲液（48 mM Tris-HCl，39 mM 甘氨酸，0.037% SDS，20%甲醇）： （2）10 ×丽春红染液： （3）TBS 缓冲液： （4）TBST 缓冲液（含20%Tween20 的TBS 缓冲液）： （5）封闭液（含5%脱脂奶粉的TBST 缓冲液）： （6）一抗、二抗及抗体稀释液：参照说明书，以封闭液或TBST 进行稀释。（7）底物显色液 ECL，4℃避光保存，现用现配。 （8）显影液和定影液 用水稀释10 - 20 倍于铝盒中，可多次使用。室温避光存放。 2、实验步骤： （1）蛋白样品制备：用细胞裂解液抽提蛋白，并测蛋白浓度。
（2）取1 mg 蛋白进行SDS-PAGE。 （3）转膜：（转膜缓冲液4 ℃预冷备用，冷却装置于- 80 ℃冰箱冷冻备用）。 （4）将2 张海绵垫、2 张滤纸、转膜夹子及玻棒浸泡在盛转膜缓冲液的铝盒中。 （5）戴上手套，剪一张与凝胶尺寸相近的PVDF 膜（83 mm × 75 mm），左上角剪一缺口作为标记，浸泡在盛有20 mL 甲醇的平皿中约15 sec，直到膜变半透明。用纯水冲洗膜2 次。浸泡在盛转膜缓冲液的铝盒中。 （6）SDS-PAGE 结束后，小心地剥下两块凝胶，一块用于考马斯亮兰染色观察电泳情况，另一块浸泡在转膜缓冲液中预平衡。海绵垫、滤纸、PVDF 膜及凝胶的预平衡时间在15 min - 1 hr 之间。 （7）将转膜夹子打开，使黑的一面保持水平。按照海绵垫、滤纸、凝胶、膜、滤纸和海绵垫的先后顺序铺垫，制备凝胶转移夹层。将膜与凝胶对齐。用玻璃棒赶走气泡。 （8）将夹子夹起来，扣紧，小心不要移动内层。放入电转槽中。使夹子的黑面对槽的黑面，夹子的白面对槽的红面。 （9）将电转槽放在冰水盒中。将预冻的冷却装置放入槽内。缓慢倒入约650 mL转膜缓冲液。 （10）盖好盖子，接上电源。根据蛋白分子量来调节工作电流，一般使用100 V（350mA），转移60 - 90 min。 （11）转膜结束后，断开电源，拆卸转膜夹子，逐一掀去各层。将膜用1 ×丽春红染色5 min，用水冲洗3 次，观察蛋白转印是否完全。同时也可将凝胶用考马斯亮蓝染色，胶上无蓝色条带则说明蛋白转印完全。 （12）免疫反应： I 封闭：用镊子将膜移至含有25 mL 封闭液的平皿中，用脱色摇床室温缓慢摇匀2 hrs，或 4 ℃过夜。封闭完用TBST 冲洗 5 sec。用吸水纸吸去残余液。 II 一抗孵育：按照一抗说明书的推荐比例稀释一抗，使用TBST 或封闭液稀释。在一容器中，将PVDF 膜浸没在抗体溶液里，室温下2 hrs 或4 ℃过夜，摇床缓慢摇匀。 III 一抗孵育完后，用TBST 室温下在摇床上洗3 次，每次10 min。 IV 二抗孵育：同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下摇床缓慢摇匀1 -2 hrs。 V 二抗孵育完后，用TBST 室温下在摇床上洗3 次，每次10 min。 （13）显影和定影： I 将ECL Plus 显色液的A 液和B 液在容器里体积混合，根据膜的大小来确定显色液的量， 1 min 后，将膜与显色液充分接触。 II 反应1 - 5 min 后，吸去膜上残余液，将膜转移至一干净保鲜膜上，包好，放入压片夹中。III 剪一张比膜尺寸稍大的X 光片，打开压片夹，将X 光片放在膜上，一旦放上，便不能移动。关上压片夹，开始计时。 IV 根据信号强弱调整曝光时间，一般1 - 5 min，也可选择不同时间多次压片以达最佳效果。V 曝光结束后，打开压片夹，将X 光片迅速浸入备好的显影液中显影，待出现明显条带后，终止显影。一般1 - 2 min（20 - 25 ℃）。 VI 显影结束后，用水冲洗X 光片，放到定影液中，定影时间一般为5 - 10 min，以胶片透明为止。 VII 用水冲洗去底片上残留的定影液，室温下晾干。
蛋白质印迹(Western blot)实验方案
蛋白质印迹（Western blot）实验方案 溶液和试剂 裂解缓冲液 这些缓冲液可在 4 ℃下保存数周，或者以分装形式在 -20 ℃下保存长达 1 年。Nonidet-P40 (NP40) 缓冲液 150 mM NaCl 1.0% NP40（可用 0.1% Triton X-100 替代） 50 mM Tris-HCl pH 8.0 蛋白酶抑制剂 RIPA 缓冲液（放射免疫沉淀试验缓冲液） 150 mM NaCl 1.0% NP-40 或0.1% Triton X-100 0.5% 脱氧胆酸钠 0.1% SDS（十二烷基硫酸钠） 50 mM Tris-HCl pH 8.0 蛋白酶抑制剂 Tris-HCl 缓冲液 20 mM Tris-HCl pH 7.5 蛋白酶抑制剂 电泳、转膜、封闭缓冲液 Laemmli 2×缓冲液/上样缓冲液 4% SDS 10% 2-巯基乙醇 20% 甘油 0.004% 溴酚蓝 0.125 M Tris-HCl 测定 pH 并调节至 pH 6.8。 电泳缓冲液（Tris-甘氨酸/SDS） 25 mM Tris 碱 190 mM 甘氨酸 0.1% SDS 测定 pH，pH 应为约8.3。必要时进行调节。 转膜缓冲液（湿转） 25 mM Tris 碱 190 mM 甘氨酸 20% 甲醇 测定 pH，pH 应为约8.3。必要时进行调节。 对于大于 80 kDa 的蛋白质，我们推荐加入最终浓度为 0.1% 的 SDS。 转膜缓冲液（半干转）
48 mM Tris 39 mM 甘氨酸 20% 甲醇 0.04% SDS 封闭缓冲液 5% 奶粉或 BSA（牛血清白蛋白） 加入 TBST 缓冲液中。混匀并过滤。过滤失败可能导致出现“斑点”，其中微小的黑色颗粒会在显色过程中污染印迹。 实验步骤 样品裂解 1. 制备细胞培养物裂解物 .将细胞培养皿置于冰上，用冰冷的 PBS 洗涤细胞。 .吸出 PBS，然后加入冰冷的裂解缓冲液（每 107 细胞/100 mm 培养皿/150 cm2培养瓶加入 1 ml；每 5×106细胞/60 mm 培养皿/75 cm2培养瓶加入 0.5 ml）。 .用预冷的塑料细胞刮棒刮下贴壁细胞，然后轻轻地将细胞悬浮液转移至预冷的微量离心管中。 .在4 ℃下持续搅拌 30 分钟。 .在4 ℃预冷的离心机中以16,000 × g 的转速离心20 分钟。 .轻轻地从离心机中取出离心管，置于冰上。将上清液转移至放置在冰上的新离心管中，弃去沉淀。 2. 制备组织裂解物 .用干净的工具切取目标组织，此操作最好在冰上进行，并且应尽快完成，以防止样品被蛋白酶降解。 .将组织置于圆底微量离心管或Eppendorf 管中，并浸入液氮中进行“速冻”。将样品保存在-80 ℃下以备后续使用，或放置在冰上直接进行匀浆。对于约5 mg 的 组织，向离心管中快速加入约300 μL 裂解缓冲液，然后用电动匀浆器进行匀浆， 用另外300 μL 裂解缓冲液冲洗刀片两次，然后在4 ℃下持续搅拌（例如，在回 旋振荡器上）2 小时。 . 4 ℃下在微型离心机中以16,000 × g 离心20 分钟。轻轻地从离心机中取出离心管，置于冰上。将上清液转移至放置在冰上的新离心管中。弃去沉淀。 样品制备 .取出小部分(50 μL) 裂解物，用于蛋白分析。确定每种细胞裂解物的蛋白浓度。.向剩余体积的细胞裂解物中加入等体积的2× Laemmli 样品缓冲液。我们推荐采用以下方法来还原样品和使样品变性，除非在线抗体数据表指明应使用非还原和非变性条件。
最详细的WesternBlot过程步骤详解
最详细的W e s t e r n B l o t 过程步骤详解
最详细的W e s t e r n B l o t 过程步骤详解 Pleasure Group Office【T985AB-B866SYT-B182C-BS682T-STT18】
Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答) Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术: 一、原理 二、分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL ECF iv.底物DAB呈色 三、主要试剂 四、主要步骤 五、实验常见的问题指南 1.参考书推荐 2.针对样品的常见问题 3.抗体 4.滤纸、胶和膜的问题 的相关疑问 6.染色的选择 7.参照的疑问
8.缓冲液配方的常见问题 9.条件的摸索 10.方法的介绍 11.结果分析 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、分类 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
Westernblot一、实验目的western技术是用来检测蛋白表达的特定的
Western blot 一、实验目的 western技术是用来检测蛋白表达的特定的灵敏的方法。 二、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 三、操作步骤
（一）样品处理 1培养的细胞： ⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。 ⑵加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。 ⑶用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。 ⑷ 12000g离心，4℃，2min。 ⑸取少量上清进行定量。 ⑹将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。 或收取细胞于EP管中加入适量的1×SDS，吹匀，100度5min,重复一次。1200rpm ,10min.取上清定量。 3．组织： ⑴匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml 裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。 ⑵ 12000g离心，4℃，2min。 ⑶取少量上清进行定量。 ⑷将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。 由于蛋白酶抑制剂可影响蛋白定量，且新鲜蛋白很少降解，故可不加，如加按建议比例即可。提取磷酸化的蛋白还需加Na3VO4 0.1mM及NaF 25mM）。 1×loading buffer配方：10% 甘油，50mM Tris·Cl (pH6.8)，2% β-巯基乙醇，0.2~0.5‰溴酚蓝，2%或5%的SDS。Buffer可配成2×~5×，注意SDS终浓度勿超过10%。 对于心脏，肌肉等碎屑较多的组织可用5%的SDS，肝肾等组织2%即可。) （二）配胶
western blot 实验原理及操作
Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答) Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术: 一、原理 二、分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL iii.底物荧光ECF iv.底物DAB呈色 三、主要试剂 四、主要步骤 五、实验常见的问题指南 1.参考书推荐 2.针对样品的常见问题 3.抗体 4.滤纸、胶和膜的问题 5.Marker的相关疑问 6.染色的选择 7.参照的疑问 8.缓冲液配方的常见问题
9.条件的摸索 10.方法的介绍 11.结果分析 一、原理 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western 印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
Western Blot 实验计划完整版
Western Blot 实验计划完整版 一、SDS-PAGE 1、分离胶的配制 10% 10% 30:0.8丙烯酰胺/双丙烯酰胺 2.67 mL 4.005mL 去离子水 3.33 mL 4.995mL 分离胶缓冲液(4X) 2.00 mL 3.00mL 8.00 mL 12.00mL 10%(w/v)APS(现用现配) 45μL 67.5μL TEMED 12μL 18μL 2、压缩胶的配制 3% 30:0.8丙烯酰胺/双丙烯酰胺0.75 mL 去离子水 3.00 mL 压缩胶缓冲液(4X) 1.25 mL 5.00 mL 10%(w/v)APS(现用现配) 30μL TEMED 8μL 先制备蛋白样品，后灌注压缩胶，压缩胶灌注后应在20~40min内使用。 3、蛋白样品的制备 蛋白样品8μL 上样缓冲液(loading buffer/laemmili buffer) 12μL 煮沸5min 冷却至室温 短暂离心 之后可加样，加样孔的深度至少为5~8mm。 拔出梳子后，如加样孔有气泡，可向其中加入适量电泳缓冲液将气泡驱除 从烧水开始，蛋白样品的制备大约需要35min 4、电泳 压缩胶电压：80V（10mA） 分离胶电压：120V（20mA） 当溴酚兰指示剂到达凝胶底部时，即停止电泳。 5、染色 考马斯亮蓝染色液35min，摇床摇动（为获得最大分辨率，5%凝胶染色2小时，10%凝胶染色4小时） 用清水反复漂洗几次 高甲醇脱色液25min，摇床摇动（也可用7%（v/v）冰乙酸） 低甲醇脱色液，摇床摇动 二、Western blot 1、润湿 准备6张Whatman 3#滤纸、一张硝酸纤维素膜，尺寸与凝胶大小相仿，先放入水中3分钟，
WB实验方法
Western Blot实验 一、实验目的 掌握Western Blot印迹法检测蛋白质的实验技术 二、实验原理 Western免疫印迹（Western Blot）广泛应用于检测蛋白水平的表达。Western Blot原理是将经过PAGE胶分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。 三、实验试剂及仪器 1试剂 （1）低分子量标准蛋白（Marker） （2）Flexirun(预混胶) （3）过硫酸铵溶液(AP)：10克过硫酸铵溶于100 mL蒸馏水中(当天配制，4℃下只用1天为宜) （4）小麦叶片 （5）四甲基乙二胺（TEMED） （6）电极缓冲液(pH 8.3)： 30.3克Tris，144.2克甘氨酸，10克SDS,用蒸馏水溶解至1000 mL，用时稀释10倍(4℃下保存) （7）转膜缓冲液(20%甲醇，Tris-base 3 g/L，Glycine 14.4 g/L) （8）TBST缓冲液(TBST 为150 mM NaCl，0.05% Tween-20，20 mM Tris-HCl pH=7.4) （9）NC膜，滤纸，脱脂乳粉 （10）DAB显色试剂盒 2 仪器 电泳仪，垂直平板电泳槽，日立高速冷冻离心机，微量进样器 四、实验步骤 1. 12%分离胶的制备(6ml) 3.6ml Flexirun(预混胶), 2.4ml水，6ul TEMED, 60ul 10% AP 2.5%浓缩胶制备(3ml) 0.75ml Flexirun(预混胶), 2.25ml水，3ul TEMED, 30ul 10% AP 本实验采用的是预混胶含有凝胶贮液，凝胶缓冲液和SDS,方便快捷。倒入适量
免疫印迹WesternBlot的基本原理试验步骤及FAQ
免疫印迹(Western Blot)的基本原理、实验步骤及FAQ 查看Western blot实验问题：Western Blot的常见问题(FAQ) Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。SDS-PAGE 可对蛋白质样品进行分离，转移到固相载体——例如硝酸纤维素薄膜（NC）上。固相载体可以吸附蛋白质，并保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。转移后的NC膜就称为一个印迹（blot），用蛋白溶液（如5%BSA或脱脂奶粉溶液）处理，封闭NC膜上的疏水结合位点。用目标蛋白的抗体（一抗）处理NC膜——只有待研究的蛋白质才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，这样清洗除去未结合的一抗后，只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。用一抗处理过的NC膜再用标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。 Western Blot实验试剂及仪器 试剂准备 （1）甲醇 （2）转移缓冲液（Tris5.8g甘氨酸2.9g SDS0.37g甲醇200ml V=1L） （3）一抗，二抗 （4）PBST，PBS，Tween-20 （5）显影液（5X）： 自来水（加热至50℃）375ml（以下药品加到温水中） 米吐尔1.55g，亚硫酸钠（无水）22.5g，碳酸钠（无水）33.75g，溴化钾20.95g，补水至500ml （6）定影液： 自来水（50～60℃）700ml（以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者）
Western blot实验所需试剂配制方法
一．Western blot实验所需试剂配制方法 制胶试剂： 1.30％（W/V）丙烯酰胺溶液： 名称用量备注 Acrylamide 29g 1g 充分搅拌溶解 N-甲叉双丙烯酰胺 (N，N-methylene-bisacylamide，BIS) 去离子水80ml 定容至100ml，0.45μm 滤膜过滤除杂，置于棕 色瓶中4℃保存， （注意：丙烯酰胺具有强烈的神经毒性，通过皮肤吸收并具有累积性，配制时应戴手套操作）2.10％（W/V）过硫酸铵： 名称用量备注 过硫酸铵0.1g 去离子水1ml 现配现用 （注意：10％过硫酸铵溶液在4℃保存能使用两周左右，过期会失去催化效果） 3. 1M Tris-HCL, pH=6.8 (36%的浓盐酸) ： 名称用量备注 Tris 12.1 去离子水80ml 浓盐酸8.8-9ml 预实验已确定 去离子水加入去离子水定容至100ml后，室温保存 4. 1.5M Tris-HCL, pH=8.8 (36%的浓盐酸) ： 名称用量备注 Tris 18.17 去离子水80ml 浓盐酸 2.8-3ml 预实验已确定 去离子水加入去离子水定容至100ml后，室温保存 5. 10%SDS： 名称用量备注 SDS 10g 去离子水80ml 加入去离子水定容至100ml后，室温保存
缓冲液配置： 6. 5ⅹTris-Glycine Buffer(SDS-PAGE电泳缓冲液) 名称用量备注pH=8.3 Tris 15.1g Glycine 94.0g SDS 5.0g 去离子水800ml 加入去离子水定容至1L后，室温保存 7. 1ⅹ膜转移缓冲液： 名称用量备注 Glycine 2.9g 2.9g Tris 5.8g 5.8g SDS 0g 0.37g 甲醇用前加200ml甲醇用前加200ml甲醇 去离子水定容到1000ml 定容到1000ml 室温保存 8. 1ⅹ膜转移缓冲液： 名称用量备注 Glycine 2.9g 2.9g Tris 5.8g 5.8g SDS 0g 0.37g 甲醇用前加200ml甲醇用前加200ml甲醇 去离子水定容到1000ml 定容到1000ml 室温保存 9. 5×SDS-PAGE Loading Buffer： 名称用量备注 1MTris-HCL, pH=6.8 1.25ml 2.5ml SDS 0.5g 1g 甘油 2.5ml 5ml BPB（溴酚蓝）25mg 50mg 超纯水至5ml 10ml 分装200ul/管 50℃充分溶解， 30min，离心取上 清，0.45uM过滤 2ME 10ul/200ul 使用前添加，添加后可室温 保存一个月
WB实验方案
步骤 （一）蛋白样品制备 1、总蛋白： （1）选老化3天、5天的家榆种子20颗，液氮研磨，放入10ml离心管中，加4ml 裂解缓冲液，4℃，摇床上摇动裂解2h；4℃，12000rpm离心20min，取上清， 至于冰上备用。 （2）蛋白定量。 （二）SDS-PAGE 1、灌胶：将胶板洗净，装在灌胶架上，灌入分离胶，加满蒸馏水将胶压平，待分离胶 凝固将水倒出，吸净，灌入浓缩胶至溢出，慢慢插入梳子，待其凝固后将胶板装入胶槽，长板在外侧，短板在内侧，倒入电极缓冲液，没过胶面。 2、蛋白变性：加入2X上样缓冲液，混匀，煮沸5min，混匀。 3、上样：上样量为20μl（15-30μg）。 4、电泳：浓缩胶电压80V，分离胶120V。 （三）Western-blotting 1、转膜： （1）将膜剪到合适的大小，具体根据实际情况，与分离胶大小相当。裁剪滤纸，大小比膜略小（长宽各短半厘米左右） （2）将硝酸纤维素膜在预冷的转膜缓冲液中浸泡10min（如用PVDF膜，先在甲醇中浸湿约10min）；将胶浸在预冷的转膜缓冲液中平衡10min（否则转膜过程中会 发生皱缩、转印扭曲）。滤纸剪完也泡在转膜缓冲液里。 （3）将转膜黑夹子上面放上垫层，垫层上面铺一张滤纸，滤纸上依次是胶、膜、滤纸、垫层、白夹板，每贴一层都要赶净气泡，将装好的夹板放入装有转膜缓冲 液的电泳槽，300mA电泳1h。 注：转膜时不要用手碰膜，可以用镊子。滤纸、膜、胶的“三明治”结构放好 后要赶净气泡，过程中一定要戴手套！ 3、杂交
（1）将膜周围多余部分裁剪掉，在TBST中洗5min。 （2）封闭：5%脱脂牛奶（溶于TBST）震荡孵育1h，室温。 （3）用TBST洗5min (这一步可省略)。 （4）一抗按比例稀释（大致1:2000~1:5000左右，具体因抗体而异），用5%脱脂牛奶/TBST 稀释，室温，振荡1~2h。 （5）TBST洗3次，每次10 min。 （6）二抗用5%脱脂牛奶/TBST按比例稀释（一般1:5000），室温振荡1h。 （7）TBST洗4次，每次10 min。 5、显影： （1）在平板上铺好一张保鲜膜，然后将洗好的膜用镊子取出，让膜的下沿接触吸水纸，吸取多余的水分，但不要吸的太干，然后将膜放在保鲜膜上。 （2）将发光液A和B按1:1混合，总体积为1ml，用移液器点到膜上，然后将铺好的保鲜膜折过来盖在膜上，期间反复抬起几次除去气泡并让发光液均匀涂布在 膜上，盖好膜，将膜展平。约反应3min，信号强时在暗处即可看到荧光。 （3）准备好显影液，水和定影液。关灯，做好避光工作，除去X光片的外盒盖，将里面的纸包拉出一点，打开包装纸，从中间抽取一张底片，将包装纸折好，放 回盒内，盖好盒盖。将X光片的一角折一下，以区别方向，将X片覆盖在膜上， 曝光不同的时间。 （4）将X片在显影液中显影至出现条带，漂洗后在定影液中定影1min即可。 （5）X光片晾干后可以放在塑料袋中保存。在X光片的使用和保存过程中应尽量避免摩擦，防止在片上出现划痕。 四、所需试剂及配制 1、裂解缓冲液：150mM NaCl，1%NP-40，50mM Tris，1mM PMSF（母液用乙醇溶）用 时现加，pH8.0 。或RIPA：150 mM NaCl，1% NP-40 or Triton X-100，0.5%脱氧胆酸 钠，0.1% SDS，50 mM Tris,1mM PMSF，pH 8.0。 2、2X上样缓冲液：2g SDS，5ml β-巯基乙醇，10ml甘油，5ml浓缩胶缓冲液，0.1g 溴酚蓝，补水至50ml。（1.2ul/30ulβ-巯基乙醇）
WB检测磷酸化蛋白的实验方案
WB检测磷酸化蛋白的实验方案 请关注：↑Abcam 助您更快实现研究使命 将细胞或组织样品在裂解缓冲液中匀浆，裂解缓冲液需新鲜制备，加入蛋白酶抑制剂（检测磷酸化蛋白时还应加入磷酸酶抑制剂）。 一旦开始裂解，蛋白水解、去磷酸化和变性也随即开始。始终将样品置于冰上或维持在 4 °C，并在一开始就向裂解缓冲液中新鲜加入合适的抑制剂，能够显著减缓这些反应。 使用加入了新鲜蛋白酶和磷酸酶抑制剂的 RIPA 或 NP40 缓冲液。 实验步骤 1.向含有 1-100 ng 靶蛋白（500 μg 裂解物）的蛋白样品中加入等体积的 2x SDS-PAGE 样品缓冲 液。对于还原样品，样品缓冲液中应该同时加入 DTT 或 β-巯基乙醇。对于非还原样品，不加入 DTT 或β-巯基乙醇。 2.将样品加热到 95 °C 或煮沸 5 分钟，使蛋白变性。 3.上样并在标准条件下跑胶。 4.通过半干法或湿法将蛋白转印至 PVDF 膜上。请注意：PVDF 膜必须预先在甲醇溶液中湿润后。 5.如有需要，可以在丽春红染料中对膜进行简单地（10 秒）染色，以确定转膜效率。可以用 PBST 或 TBST 清洗去除染料。我们不建议在蒸馏水中清洗，因为某些情况下可能会使蛋白质脱落下来。6.在 TBST 中加入 5% w/v BSA 对膜进行封闭。在摇床上 4 °C 孵育 1 小时。 7.使用 TBST 稀释一抗至建议稀释度。我们推荐在封闭的袋子、杂交管或 50 mL Falcon 管（约 2.5 mL缓冲液）中进行孵育。在摇床上 4 °C孵育过夜。 8.室温下使用 TBST 洗膜 3 至 4 次，每次 5 分钟。 9.在 TBST 中，按照建议的稀释度（虽然需要对特定应用进行优化，1/5000 是较好的通用工作稀释 度）稀释 HRP 二抗。 10.室温下使用 TBST洗膜 3 至 4 次，每次 5 分钟。 11.进行 ECL Plus 检测。 注意事项 abcam 2018-10-17 abcam 此为临时链接，仅用于预览，将在短期内失效。
westernblot中试剂的用途和配制
western blot 中试剂的用途和配制 western blot 中试剂的用途和配制 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、分类 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片
曝光，就可洗出条带。 三、主要试剂 1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。 2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。 3、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。 4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O 中，用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。 5、TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml，临用前配制. 6、SDS-PAGE加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混
原创Westernblot转膜整个过程
原创W e s t e r n b l o t转膜 整个过程 集团文件发布号：（9816-UATWW-MWUB-WUNN-INNUL-DQQTY-
转膜（T r a r s m e m b r a n）1转膜的定义 将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。前者操作容易，转移效率高；而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。 2转移膜的选择 杂交膜的选择是决定Westernblot成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于Westernblot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜（NC）和PVDF膜。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。通常用0.45μm和0.2μm两种规格的NC膜。大于20kD的蛋白可用0.45μm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2μm的膜了，如用0.45μm的膜就会发生“Blowthrough”的现象。PVDF膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和1-5秒钟。 最常用于WesternBlot的转移膜主要是硝酸纤维素（Nitrocellulose,NC）膜和聚偏二氟乙烯（PolyvinylideneFluoride,PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交。